Her presenterer vi en protokoll for samtidig bruk av han selvmord resonans energi overføring-basert spenning sensorer for å måle protein belastning og fluorescens gjenoppretting etter photobleaching å måle protein dynamics slik at måling av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler.
Celler forstand og svare på fysiske signaler i miljøet ved å konvertere mekanisk stimuli til biokjemisk-detectable signaler i en prosess som kalles mechanotransduction. Et avgjørende skritt i mechanotransduction er overføring av styrker mellom de eksterne og interne miljøene. Å sende styrker, må det være en vedvarende, ubrutt fysiske koblingen laget av en rekke protein-protein interaksjoner. For en gitt protein-protein interaksjon, mekanisk belastning kan enten har ingen innvirkning på samspill, føre til raskere tilknytningene til samhandlingen, eller aften stabilisere samhandlingen. Forstå hvordan molekylær Last dikterer protein omsetning i levende celler kan gi verdifull informasjon om mekaniske staten en protein, igjen Klargjørende sin rolle i mechanotransduction. Eksisterende teknikker for måling av kraft-sensitive protein dynamics enten mangler direkte målinger av protein belastning eller stole på målinger utført enhetskontroll mobilnettet. Her beskriver vi en protokoll for han selvmord resonans energi overføring-fluorescens utvinning etter photobleaching (bånd-FRAP) teknikk, som gjør at måling av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler. Denne teknikken er potensielt gjelder enhver bånd-baserte spenning sensor, tilrettelegge studiet av kraft-sensitive protein dynamikken i rekke subcellular strukturer og ulike celletyper.
Ekstracellulære miljøet er en rik kilde til både biokjemiske og fysiske signaler som styrer celle atferd. Spesielt kan fysisk natur av microenvironment formidle viktige cellulære funksjoner, inkludert cellevekst, migrasjon og differensiering1,2,3,4. Feilregulering om mekanikken i microenvironment er en kritisk komponent for mange sykdommer som ennå ikke har tilstrekkelig behandlinger, for eksempel kreft5, aterosklerose6og fibrose7. En fullstendig forståelse av hvordan celler konvertere fysiske stimuli til biokjemisk-detectable signaler, en prosess kalt mechanotransduction, krever utviklingen av molekylære mekanismer formidling styrke overføring, både inn og ut av cellene og innen flere subcellular strukturer.
I subcellular strukturer blir proteiner stadig over; bindende og frigiving basert på styrken av deres interaksjon med bindende partnere8. For styrker å være overføres over en fysisk avstand, må det være en ubrutt klareringskjede protein-protein interaksjoner, betyr at et protein omsetning må være treg nok til å opprettholde og overføre makt til sin bindende partner9. Mens protein-protein interaksjoner består vanligvis av flere ikke-kovalente bindinger mellom protein domenene, er samspillet ofte definert som en bundet tilstand som kan gå til en ubundet tilstand under ulike forhold10, 11. en gitt protein-protein interaksjon, er det mulig at makt kan har ingen effekt på levetiden til samhandling, kjent som en “ideell bånd”, redusere levetiden til samhandling, kjent som en “slip bånd”, eller øke levetiden til samhandlingen , kjent som en “catch bånd”10. Således, det er en intrikat sammenheng mellom protein belastning og protein dynamikk, som vi kaller kraft-sensitive dynamikk.
Mot å forstå effekten av belastningen på bond dynamics, har en rekke svært informativ eksperimenter utført på enkelt-molekylet nivå. Bruker isolert proteiner eller fragmenter av proteiner og manipulasjon teknikker som magnetiske pinsett, optisk pinsett og atomic force mikroskopi, har disse studiene vist kraft-sensitive protein-protein interaksjoner i flere relevante proteiner11,12. Begge integrins13 og cadherins14, som transmembrane proteiner viktig for å danne celle-matrise og celle-celle interaksjoner, henholdsvis, har vist endringer i dynamics grunn for å laste. Inne i cellen, vinculin er rekruttert til begge talin15 og α-catenin16 i en makt-avhengige måte og kan danne en fange bånd med utgangen17, som indikerer en avgjørende rolle for vinculin både fokal adhesjon (FAs) og adherens veikryss (AJs ) under belastning. Single-molekylet studier tillater isolering av bestemt protein-protein interaksjoner og entydig resultater, men de ikke gjøre rede for kompleksiteten i mobilnettet miljø.
Landemerke eksperimenter har vist at flere subcellular strukturer, inkludert FAs og AJs, er mechanosensitive, og viser forbedret montering svar på internt generert eller eksternt brukte laster18,19, 20,21,22. I tillegg har flere teoretiske modeller antydet at mechanosensitive montering kan være drevet av kraft-sensitive protein dynamics23,24,25. For å undersøke disse kraft-sensitive dynamikk i levende celler, er noen indirekte tilnærminger tatt. FRAP og relaterte teknikker gi en relativt enkel metodikk for måling av protein dynamikk i celler26,27,28,29. Måling av protein belastning har imidlertid vært mer begrenset. En typisk bruksmåte er å sammenligne protein dynamikk i celler med og uten eksponering en cellen cytoskjelett hemmer brukes til å redusere totale celle contractility8,30,31. Konseptuelt, er dette en sammenligning mellom høy belastning og lav belastning tilstand. Men det er ingen kvantifisering av lasten over protein i enten tilstand, og det kan være utilsiktet biokjemiske effekter av hemmer, slike tap av viktige bindende områder langs en F-utgangen filament. En annen tilnærming, gjelder for FAs, har vært å måle sum force anstrengelse på underlaget av FA bruker trekkraft force mikroskopi omtrentlig molekylær belastning og undersøke forholdet dynamikken i et enkelt protein i FA32. Mens denne tilnærmingen lar for kvantifisering av total makt, gir det ikke molecularly spesifikk informasjon. FAs består av over 200 ulike proteiner, hvorav mange kan bære belastningen33. Dermed måle det sum force produksjonen av en FA potensielt tilslører muligheten av flere kraft overføring og gir ikke pålitelig et mål av belastningen på et bestemt protein.
I motsetning til tidligere tilnærmingene i mechanobiology, bruk av bånd-baserte spenning sensorer kan direkte måling av laster oppleves av spesifikke proteiner i levende celler34,35,36. Her presenterer vi en protokoll som kombinerer bånd-baserte spenning sensorer med FRAP-baserte mål av protein dynamikk. Vi kaller denne teknikken bånd-FRAP. Denne tilnærmingen kan samtidig måling av protein belastning og protein dynamikk, slik at vurdering av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler (figur 1). Allerede, er bånd-FRAP teknikken brukt til studiet av kraft-sensitive dynamikk av mekanisk koblingsfunksjonalitet protein vinculin37. Spenning sensorer har blitt utviklet for mange proteiner som er relevante i en rekke subcellular strukturer. For eksempel har sensorer blitt utviklet for vinculin34 og talin38,39 FAs, cadherins og catenins i AJs40,41,42, nesprin i kjernefysiske LINC komplekse 43, α-actinin44 og filamin36 i cytoskeleton og MUC-1 i glycocalyx45, blant annet46. Tilsvarende er FRAP en vanlig teknikk er brukt på mechanosensitive proteiner i fokal adhesjon8,31, adherens veikryss47, begrepsordbok cortex26og kjernen48. Fremover, bånd-FRAP teknikken skal være bredt aktuelt til noen av disse eksisterende sensorer eller nylig utviklet sensorer, slik at målinger av kraft-sensitive dynamikk i en rekke subcellular strukturer og sammenhenger. Mot dette formål gir vi en detaljert, generalisert protokoll for implementering av bånd-FRAP teknikk i disse forskjellige systemer. Forhåpentligvis aktiverer dette en rekke eksperimenter Klargjørende rollene av mechanosensitive regulerer kraft overføring og formidling celle atferd.
BÅND-FRAP metoden tillater direkte måling av kraft-sensitive protein dynamikk, en egenskap som har vært vanskelig å direkte undersøke i levende celler. Følsomheten til protein dynamics molekylær lastes er kritisk til protein’s fungerer som en kraft senderen eller transduktor. Lasting kreves for overføring av både internt generert og eksternt brukte styrker, kalt mechanotransmission, og for konvertering av disse styrkene til biokjemisk-detectable signaler, kalt mechanotransduction. Imidlertid endringer i belastni…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en National Science Foundation CAREER-pris (NSF-CMMI-14-54257) og tilskudd fra American Heart Association (16GRNT30930019) og National Institutes of Health (R01GM121739-01) tildelt Dr. Brenton Hoffman og en nasjonal Science Foundation Graduate forskningsstipend tildelt Katheryn Rothenberg. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet av NSF eller NIH.
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25300062 | |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
60x Objective NA1.35 | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Automated Stage | Prior Scientific | H117EIX3 | |
Custom Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp | T450/514rpc | |
Custom mTFP1 Emission Filter | Chroma Technology Corp | ET485/20m | |
Custom mTFP1 Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET450/30x | |
Custom Venus Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET514/10x | |
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium | Sapphire | MC102 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D5796 | with L-glutamine and sodium bicarbonate |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | |
Fibronectin, Human | Corning | 47743-654 | |
FRAPPA Calibration Slide | Andor | provided along with FRAPPA unit | |
FRAPPA System with 515 nm Laser | Andor | ||
Glass-bottomed Fluoro Dishes | World Precision Instruments | FD35 | |
HEK293-T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hexadimethrine Bromide, Polybrene | Sigma Aldrich | H9268-5G | |
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D6429 | |
Inverted Fluorescent Microscope | Olympus | IX83 | |
JMP Pro Software | SAS | ||
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels | Sutter Instruments | LB10-NW | |
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb | Sutter Instruments | LS/OF30 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
MATLAB Software | Mathworks | ||
MEM Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher | 11140050 | |
MetaMorph for Olympus | Olympus | ||
Micro-Humidification System | Bioptechs | 130708 | |
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
Objective Heater Medium | Bioptechs | 150819-13 | |
OptiMEM | Thermo Fisher | 31985070 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
pMD2.G Envelope Plasmid | Addgene | 12259 | |
pRRL Vector | gift from Dr. Kam Leong (Columbia University) | ||
psPax2 Packaging Plasmid | Addgene | 12260 | |
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004505 | |
Stable Z Stage Warmer | Bioptechs | 403-1926 | |
Venus Emission Filter | Semrock | FF01-571/72 |