Här presenterar vi ett protokoll för samtidig användning av Förster resonans energi överföring-baserade spänning sensorer för att mäta protein belastning och fluorescens återhämtning efter fotoblekning att mäta protein dynamics möjliggör mätning av kraft-känslig protein dynamiken inom levande celler.
Celler känna och reagera på fysiska ledtrådar i deras miljö genom att omvandla mekanisk stimuli till biokemiskt-detectable signaler i en process som kallas mechanotransduction. Ett avgörande steg i mechanotransduction är överföringen av krafter mellan de yttre och inre miljöerna. Att överföra krafter, det måste finnas en ihållande, obruten fysisk koppling som skapas av en serie av protein-protein interaktioner. För ett visst protein-protein interaktioner, mekanisk belastning kan antingen har ingen effekt på samverkan, leda till snabbare disassociation av interaktionen, eller ens stabilisera interaktionen. Förstå hur molekylära belastning dikterar protein omsättningen i levande celler kan ge värdefull information om det mekaniska tillståndet av ett protein, som i sin tur belysa dess roll i mechanotransduction. Befintliga tekniker för att mäta kraft-känsliga protein dynamics antingen saknar direkta mätningar av protein belastning eller förlita sig på de mätningar som utförs utanför det cellulära sammanhanget. Här beskriver vi ett protokoll för Förster resonans energi överföring-fluorescens återhämtning efter fotoblekning (bandet-FRAP) teknik, som möjliggör mätning av kraft-känsliga protein dynamiken inom levande celler. Denna teknik är potentiellt tillämpliga på någon bandet-baserade spänning sensor, att underlätta studiet av kraft-känsliga protein dynamics i mängd subcellulära strukturer och i olika celltyper.
Den extracellulära miljön är en rik källa till både biokemiska och fysiska ledtrådar som dikterar cell beteende. Särskilt kan den fysiska naturen i närmiljön medla viktiga cellulära funktioner, inklusive celltillväxt, migration och differentiering1,2,3,4. Dysreglering av mekaniken i närmiljön är en kritisk komponent för många sjukdomar som ännu inte har tillräcklig behandlingar, såsom cancer5, åderförkalkning6och fibros7. En fullständig förståelse av hur celler omvandlar fysiska stimuli till biokemiskt-detectable signaler, en process som kallas mechanotransduction, kräver förtydligandet av de molekylära mekanismer som medla kraft överföring, både in och ut ur cellerna och inom flera subcellulära strukturer.
Inuti subcellulära strukturer vänder proteiner ständigt över; bindande och uppdelningen baserat på styrkan i deras interaktioner med bindande partner8. För krafter överförs framgångsrikt över fysiska avstånd, måste det finnas en obruten kedja av protein-protein interaktioner, vilket innebär att en proteinets omsättning måste vara långsam nog att bevara och överföra kraft till dess bindande partner9. Medan protein-protein interaktioner består vanligen av flera icke-kovalenta bindningar mellan protein domäner, konceptualiseras samspelet ofta som en bunden stat som kan övergå till en obunden stat under olika villkor10, 11. för ett visst protein-protein interaktioner, är det möjligt att kraft kan har ingen effekt på livslängden av interaktionen, känd som en ”perfekt bond”, minska livslängden på interaktionen, känd som en ”slip bond”, eller öka livslängden på samspelet , känd som en ”catch bond”10. Således finns det ett intrikat förhållande mellan protein belastning och protein dynamik, som vi kallar kraft-känsliga dynamics.
För att förstå effekten av belastning på bond dynamics, har ett antal mycket informativ experiment utförts på nivån singel-molekyl. Med isolerade proteiner eller fragment av proteiner och manipulation tekniker såsom magnetiska pincetter, optisk pincett och atomic force microscopy, har dessa studier visat kraft-känsliga protein-protein interaktioner för flera relevanta proteiner11,12. Båda integriner13 och cadherins14, som är transmembrana proteiner viktiga för att bilda cell-matrix och cell-cell interaktioner, respektive, har visat förändringar i dynamics på grund för att ladda. I cellen, vinculin rekryteras till båda talin15 och α-catenin16 i en kraft-beroende sätt och kan bilda fångst med aktin17, indikerar en avgörande roll för vinculin på både fokal sammanväxningar (FAs) och adherens föreningspunkter (AJs ) under belastning. Singel-molekyl studier tillåta för isolering av specifika protein-protein interaktioner och ge entydiga resultat, men de hänsyn inte till komplexiteten i den cellulära miljön.
Landmärke experiment visat att flera subcellulära strukturer, inklusive FAs och AJs, är mechanosensitive, och uppvisar förbättrad församlingen svar på internt genererad eller externt appliceras laster18,19, 20,21,22. Flera teoretiska modeller har dessutom föreslagit att mechanosensitive församlingen kunde drivas av kraft-känsliga protein dynamics23,24,25. För att undersöka dessa kraft-känsliga dynamiken inom levande celler, har några indirekta metoder vidtagits. FRAP och relaterade tekniker ger en relativt enkel metod för att mäta protein dynamics i celler26,27,28,29. Mätning av protein belastning har dock varit mer begränsad. En typisk metod är att jämföra protein dynamics i celler med och utan exponering för en cytoskeletal-hämmare används för att minska totala cell kontraktilitet8,30,31. Begreppsmässigt är detta en jämförelse mellan en hög belastning och låg belastning. Dock finns det ingen kvantifiering av belastningen över proteinet i antingen tillstånd, och det kan finnas oavsiktliga biokemiska effekter av hämmaren, sådan förlusten av viktiga bindande platser längs en F-aktin filament. Ett annat tillvägagångssätt, specifika för FAs, har varit att mäta total kraft ansträngning på substraten av FA använder dragkraft force microscopy ungefärliga molekylär belastning och undersöka förhållandet med dynamiken i ett enda protein inom FA32. Medan detta tillvägagångssätt möjliggör kvantifiering av totala kraften, ger den inte molekylärt specifik information. FAs består av över 200 olika proteiner, av vilka många kan bära lasten33. Således mäta total kraft utdata från en FA potentiellt skymmer möjligheten att flera kraft överföring vägar och på ett tillförlitligt sätt ger inte ett mått på belastningen på ett specifikt protein.
Till skillnad från tidigare metoder i Mekanobiologi, tillkomsten av bandet-baserade spänning sensorer kan direkt mätning av laster upplevs av specifika proteiner inuti levande celler34,35,36. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar bandet-baserade spänning sensorer med FRAP-baserade mått av protein dynamics. Vi hänvisar till denna teknik som bandet-FRAP. Detta tillvägagångssätt möjliggör samtidig mätning av protein belastning och protein dynamik, vilket möjliggör bedömning av kraft-känsliga protein dynamiken i levande celler (figur 1). BANDET-FRAP tekniken har redan tillämpats till studien av kraft-känsliga dynamiken i de mekaniska linker protein vinculin37. Spänning sensorer har utvecklats för många proteiner som är relevanta i en mängd olika subcellulära strukturer. Till exempel har sensorer utvecklats för vinculin34 och talin38,39 i FAs, cadherins och catenins i AJs40,41,42, nesprin i den nukleära LINC komplexa 43, α-actinin44 och filamin36 i cytoskelettet och MUC-1 i de glykokalyx45, bland annat46. Likaså är FRAP en vanligt förekommande teknik har använts på mechanosensitive proteiner inom focal sammanväxningar8,31, adherens föreningspunkter47, aktin cortex26och nucleus48. Framåt, bandet-FRAP tekniken bör vara allmänt tillämpliga på någon av dessa befintliga sensorer eller nyligen utvecklat sensorer, vilket möjliggör mätningar av kraft-känsliga dynamik i en mängd olika subcellulära strukturer och sammanhang. Detta slutet tillhandahåller vi en detaljerad, generaliserad protokoll för att genomföra bandet-FRAP tekniken tillämpas i dessa olika system. Förhoppningsvis kan en mängd olika experiment klarlägga roller olika mechanosensitive proteiner reglerar kraft överföring och medla cell beteende.
BANDET-FRAP metoden möjliggör direkt mätning av kraft-känsliga protein dynamics, en egenskap som har varit svårt att direkt söka inuti levande celler. Känsligheten av protein dynamics och molekylär belastning är kritiska till proteinets funktion som en kraft sändare eller givaren. Lastning krävs för överföring av både internt genererade och externt-tillämpad styrkor, kallas mechanotransmission, och för omvandlingen av dessa styrkor till biokemiskt-detectable signaler, som kallas mechanotransduction. Men …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av en National Science Foundation karriär Award (NSF-CMMI-14-54257) samt bidrag från American Heart Association (16GRNT30930019) och National Institutes of Health (R01GM121739-01) tilldelas Dr Brenton Hoffman och en nationell Science Foundation Graduate Research Fellowship tilldelas Katheryn Rothenberg. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av NSF eller NIH.
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25300062 | |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
60x Objective NA1.35 | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Automated Stage | Prior Scientific | H117EIX3 | |
Custom Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp | T450/514rpc | |
Custom mTFP1 Emission Filter | Chroma Technology Corp | ET485/20m | |
Custom mTFP1 Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET450/30x | |
Custom Venus Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET514/10x | |
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium | Sapphire | MC102 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D5796 | with L-glutamine and sodium bicarbonate |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | |
Fibronectin, Human | Corning | 47743-654 | |
FRAPPA Calibration Slide | Andor | provided along with FRAPPA unit | |
FRAPPA System with 515 nm Laser | Andor | ||
Glass-bottomed Fluoro Dishes | World Precision Instruments | FD35 | |
HEK293-T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hexadimethrine Bromide, Polybrene | Sigma Aldrich | H9268-5G | |
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D6429 | |
Inverted Fluorescent Microscope | Olympus | IX83 | |
JMP Pro Software | SAS | ||
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels | Sutter Instruments | LB10-NW | |
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb | Sutter Instruments | LS/OF30 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
MATLAB Software | Mathworks | ||
MEM Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher | 11140050 | |
MetaMorph for Olympus | Olympus | ||
Micro-Humidification System | Bioptechs | 130708 | |
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
Objective Heater Medium | Bioptechs | 150819-13 | |
OptiMEM | Thermo Fisher | 31985070 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
pMD2.G Envelope Plasmid | Addgene | 12259 | |
pRRL Vector | gift from Dr. Kam Leong (Columbia University) | ||
psPax2 Packaging Plasmid | Addgene | 12260 | |
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004505 | |
Stable Z Stage Warmer | Bioptechs | 403-1926 | |
Venus Emission Filter | Semrock | FF01-571/72 |