Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.
Zellen spüren und reagieren auf körperliche Signale in ihrer Umgebung durch die Umwandlung der mechanischen Reize in biochemisch nachweisbar Signale in einem Prozess namens Mechanotransduktion. Ein entscheidender Schritt in Mechanotransduktion ist die Übertragung der Kräfte zwischen den internen und externen Umgebungen. Kräfte zu übertragen, muss eine nachhaltige, ungebrochen körperliche Verbindung erstellt durch eine Reihe von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Für ein gegebenes Protein-Protein-Interaktion mechanischer Belastung haben entweder keine Auswirkungen auf die Interaktion, zu schneller Distanzierung der Interaktion führen oder sogar stabilisieren die Interaktion. Verstehen, wie molekulare Last diktiert, dass Protein-Umsatz in lebenden Zellen wertvolle Informationen über den mechanischen Zustand eines Proteins, im Gegenzug seine Rolle bei der Mechanotransduktion Aufklärung liefern kann. Bestehende Techniken zur Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik fehlen direkte Messungen des Proteins Last oder verlassen Sie sich auf die Messungen außerhalb des zellulären Kontexts. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Förster Resonanz Energie Transfer-Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz (Bund-FRAP) Technik, ermöglicht die Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen. Diese Technik gilt möglicherweise für jeden Bund-basierte Spannung Sensor erleichtern das Studium der Kraft-Sensitive Proteindynamik in unterschiedlichsten subzellulären Strukturen und in verschiedenen Zelltypen.
Die extrazelluläre Umgebung ist eine reiche Quelle von biochemischen und physikalischen Signale, die ihr Verhalten der Zelle bestimmen. Insbesondere kann die physische Beschaffenheit der Mikroumgebung wichtige Zellfunktionen einschließlich Zellwachstum, Migration und Differenzierung1,2,3,4vermitteln. Dysregulation der Mechanik von der Mikroumgebung ist eine kritische Komponente für viele Krankheiten, die noch nicht ausreichende Behandlungen, wie z. B. Krebs5, Atherosklerose6und Fibrose7verfügen. Ein vollständiges Verständnis der wie Zellen physikalischen Reize in biochemisch nachweisbar Signale umwandeln, ein Prozess Mechanotransduktion bezeichnet, erfordert die Aufklärung der molekularen Mechanismen vermitteln Kraftübertragung, sowohl in als auch außerhalb der Zellen und in mehreren subzelluläre Strukturen.
Im Inneren der subzellulären Strukturen sind Proteine ständig umdrehen; Bindung und loslösen, basierend auf der Stärke ihrer Interaktionen mit verbindlichen Partner8. Für Kräfte erfolgreich über eine räumliche Distanz hinweg übertragen werden muss eine ununterbrochene Kette von Protein-Protein-Interaktionen, was bedeutet, dass ein Protein-Umsatz langsam genug, um aufrecht zu erhalten und Kraft zu seinen verbindlichen Partner9übertragen werden muss. Während Protein-Protein-Interaktionen in der Regel von mehreren nicht-kovalente Bindungen zwischen den Protein-Domänen bestehen, ist die Interaktion häufig als gebundenen Staat konzipiert, die in einem ungebundenen Zustand unter verschiedenen Bedingungen10, übergehen kann 11. für ein gegebenes Protein-Protein-Interaktion ist es möglich, dass Kraft keine Wirkung auf die Dauer der Interaktion haben, bekannt als eine “ideale Bond”, reduzieren die Lebensdauer der Interaktion, bekannt als “Slip-Bond”, oder erhöhen die Lebensdauer der Interaktion , bekannt als ein “Fang Bond”10. So gibt es eine komplizierte Beziehung zwischen Protein Last und Proteindynamik, die wir als Kraft-Sensitive Dynamik bezeichnen.
Zum Verständnis der Auswirkungen der Belastung auf die Anleihe Dynamik, wurden eine Reihe von hochinformativen Experimente auf der Einzelmolekül-Ebene durchgeführt. Mit isolierten Proteine oder Fragmente von Proteinen und Manipulationstechniken wie magnetische Pinzette, optische Pinzette und Rasterkraftmikroskopie, zeigten diese Studien Kraft-Sensitive Protein-Protein-Interaktionen für mehrere relevante Proteine-11,–12. Beide Integrine13 und Cadherine14, die transmembranen Proteine wichtig zur Bildung Zellmatrix und Zell-Zell-Interaktionen, bzw. sind, zeigten Veränderungen in der Dynamik durch geladen. Innerhalb der Zelle Vinkulin wird auf beide Talin15 und α-Catenin16 in einer Kraft-abhängigen Weise eingestellt, und bilden eine Fang-Anleihe mit Aktin17, zeigt eine entscheidende Rolle für Vinkulin bei fokalen Adhäsionen (FAs) und Adherens Junctions (AJs ) unter Last. Einzelmolekül-Studien für die Isolierung von spezifischen Protein-Protein-Interaktionen zu ermöglichen und eindeutige Ergebnisse liefern, aber sie nicht die Komplexität der zellulären Umgebung entfallen.
Landmark Experimente zeigten, dass mehrere subzelluläre Strukturen, einschließlich FAs und AJs, Mechanosensitive und verbesserte Montage als Reaktion auf intern generierten oder äußerlicher Anwendung Lasten18,19aufweisen, 20,21,22. Darüber hinaus haben mehrere theoretische Modelle vorgeschlagen, dass Mechanosensitive Montage durch Kraft-Sensitive Protein Dynamics23,24,25gefahren werden konnte. Um diese Kraft-Sensitive Dynamiken innerhalb von lebenden Zellen zu untersuchen, wurden einige indirekte Ansätze unternommen. FRAP und verwandte Techniken bieten eine relativ einfache Methode zur Messung von Proteindynamik Zellen26,27,28,29. Jedoch wurde die Messung von Protein Last mehr beschränkt. Ein typisches Vorgehen soll Proteindynamik in Zellen mit und ohne Exposition gegenüber einem Zellskelett Inhibitor verwendet, um allgemeine Zelle Kontraktilität8,30,31zu vergleichen. Im Prinzip handelt es sich um einen Vergleich zwischen einer hohen Belastung und niedrigen Lastzustand. Allerdings gibt es keine Quantifizierung der Last über das Protein in keinem der Staaten, und möglicherweise gibt es biochemische Nebeneffekte des Inhibitors, so den Verlust von wichtigen Bindestellen entlang einer F-Aktin-Filament. Ein weiterer Ansatz, speziell für FAs, wurde zur Messung der Gesamtkraft Anstrengung auf dem Substrat durch das FA mit Traktion Rasterkraftmikroskopie um ungefähre molekulare Last und untersuchen Sie die Beziehung mit der Dynamik eines einzigen Proteins innerhalb der FA32. Während dieser Ansatz die Quantifizierung der Gesamtkraft ermöglicht, bietet es keine molekular spezifische Informationen. FAs bestehen aus mehr als 200 verschiedene Proteine, von die viele Last33tragen können. So Messausgang die Gesamtkraft von einem FA möglicherweise verdeckt die Möglichkeit, mehrere Kraft Übertragungswege und zuverlässig liefert ein Maß für die Belastung auf ein bestimmtes Protein.
Im Gegensatz zu früheren Ansätzen in Mechanobiology, das Aufkommen der Bund-basierte Spannung Sensoren ermöglicht die direkte Messung von Lasten erlebt durch bestimmte Proteine in lebenden Zellen34,35,36. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Bund-basierte Spannung Sensoren mit FRAP Maß Proteindynamik verbindet. Wir bezeichnen diese Technik als Bund FRAP. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Messung von Protein Last- und Proteindynamik, so dass die Bewertung der Kraft-Sensitive Proteindynamik in lebenden Zellen (Abbildung 1). Bereits, hat die Bund FRAP-Technik für die Untersuchung von Kraft-und Kleinschreibung Dynamik der mechanischen Linker Protein Vinkulin37angewendet. Spannung-Sensoren wurden für zahlreiche Proteine entwickelt, die in einer Vielzahl von subzellulären Strukturen relevant sind. Zum Beispiel sind Sensoren für Vinkulin34 und Talin38,39 in FAs, Cadherine und Catenins in AJs40,41,42, Nesprin in der nuklearen LINC Komplex entwickelt worden 43, α-Actinin44 und Filamin36 in dem Zytoskelett und MUC-1 in der Glycocalyx45, unter anderem46. In ähnlicher Weise ist FRAP eine häufig verwendete Technik auf Mechanosensitive Proteine innerhalb der fokalen Adhäsionen8,31, Adherens Junctions47Aktin Kortex26und Kern48verwendet worden ist. Voran, die Bund-FRAP Technik breit anwendbar zu sein sollte dieser vorhandenen Sensoren oder neu entwickelte Sensoren zur Messung von Kraft-und Kleinschreibung Dynamik in einer Vielzahl der subzellulären Strukturen und Zusammenhänge ermöglicht. Zu diesem Zweck bieten wir eine detaillierte, generalisierte Protokoll für die Umsetzung der Bund-FRAP-Technik in diese unterschiedlichen Systeme anwendbar. Hoffentlich wird dies eine Vielzahl von Experimenten, die Aufklärung der Rollen der verschiedenen Mechanosensitive Proteine bei der Regulierung der Kraftübertragung und bei der Vermittlung Zelle Verhalten ermöglichen.
Die Bund-FRAP-Methode ermöglicht direkte Messung von Kraft-Sensitive Protein Dynamics, eine Eigenschaft, die schwierig war, direkt in lebenden Zellen zu untersuchen. Die Empfindlichkeit der Proteindynamik molekulare Belastung ist entscheidend für die Funktion des Proteins als Kraft Sender oder Wandler. Beladung ist erforderlich für die Übertragung der beiden intern generierten und äußerlicher Anwendung Kräfte, genannt Mechanotransmission und für die Umwandlung von jenen Kräften in biochemisch nachweisbar Signale…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation CAREER Award (NSF-CMMI-14-54257) sowie Zuschüsse aus der American Heart Association (16GRNT30930019) und die National Institutes of Health (R01GM121739-01) verliehen an Dr. Brenton Hoffman und Angehöriger unterstützt. Science Foundation Graduate Research Fellowship an Katheryn Rothenberg vergeben. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der NSF oder NIH.
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25300062 | |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
60x Objective NA1.35 | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Automated Stage | Prior Scientific | H117EIX3 | |
Custom Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp | T450/514rpc | |
Custom mTFP1 Emission Filter | Chroma Technology Corp | ET485/20m | |
Custom mTFP1 Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET450/30x | |
Custom Venus Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET514/10x | |
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium | Sapphire | MC102 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D5796 | with L-glutamine and sodium bicarbonate |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | |
Fibronectin, Human | Corning | 47743-654 | |
FRAPPA Calibration Slide | Andor | provided along with FRAPPA unit | |
FRAPPA System with 515 nm Laser | Andor | ||
Glass-bottomed Fluoro Dishes | World Precision Instruments | FD35 | |
HEK293-T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hexadimethrine Bromide, Polybrene | Sigma Aldrich | H9268-5G | |
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D6429 | |
Inverted Fluorescent Microscope | Olympus | IX83 | |
JMP Pro Software | SAS | ||
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels | Sutter Instruments | LB10-NW | |
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb | Sutter Instruments | LS/OF30 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
MATLAB Software | Mathworks | ||
MEM Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher | 11140050 | |
MetaMorph for Olympus | Olympus | ||
Micro-Humidification System | Bioptechs | 130708 | |
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
Objective Heater Medium | Bioptechs | 150819-13 | |
OptiMEM | Thermo Fisher | 31985070 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
pMD2.G Envelope Plasmid | Addgene | 12259 | |
pRRL Vector | gift from Dr. Kam Leong (Columbia University) | ||
psPax2 Packaging Plasmid | Addgene | 12260 | |
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004505 | |
Stable Z Stage Warmer | Bioptechs | 403-1926 | |
Venus Emission Filter | Semrock | FF01-571/72 |