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Bioengineering

फ्लोरोसेंट तकनीक का एक संयोजन का उपयोग कर कोशिकाओं के रहने में बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता का मापन

doi: 10.3791/58619 Published: November 2, 2018

Summary

यहां, हम Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण आधारित तनाव सेंसरों के एक साथ उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान प्रोटीन की गतिशीलता को मापने के लिए photobleaching के बाद प्रोटीन लोड और प्रतिदीप्ति वसूली को मापने के लिए बल के प्रति संवेदनशील की माप को सक्षम करने जीवित कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन गतिशीलता ।

Abstract

कोशिकाओं भावना और mechanotransduction बुलाया एक प्रक्रिया में जैव रासायनिक-जासूसी संकेतों में यांत्रिक उत्तेजनाओं में परिवर्तित करके अपने वातावरण में भौतिक संकेतों का जवाब. mechanotransduction में एक महत्वपूर्ण कदम बाहरी और आंतरिक वातावरण के बीच बलों के संचरण है । बलों को संचारित करने के लिए, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की श्रृंखला के द्वारा बनाए गए निरंतर, अटूट शारीरिक संबंध होना चाहिए । एक दिया प्रोटीन-प्रोटीन संपर्क के लिए, यांत्रिक लोड या तो बातचीत पर कोई प्रभाव नहीं है, बातचीत के तेजी से संबंध है, या यहां तक कि बातचीत को स्थिर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । कैसे आणविक लोड हुक्म समझ में रहने वाले कोशिकाओं में प्रोटीन कारोबार एक प्रोटीन के यांत्रिक राज्य के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं, बारी में mechanotransduction में अपनी भूमिका elucidating । बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता को मापने के लिए मौजूदा तकनीक या तो प्रोटीन लोड के प्रत्यक्ष माप कमी या सेलुलर संदर्भ के बाहर प्रदर्शन माप पर भरोसा करते हैं । यहां, हम Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली (झल्लाहट-frap है) तकनीक है, जो जीवित कोशिकाओं के भीतर बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता के माप में सक्षम बनाता है । इस तकनीक संभवतः किसी भी झल्लाहट आधारित तनाव संवेदक के लिए लागू है, बल के अध्ययन की सुविधा-सेलुलर संरचनाओं की विविधता में संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता और विभिंन प्रकार के सेल में ।

Introduction

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extracellular पर्यावरण दोनों जैव रासायनिक और भौतिक संकेतों है कि सेल व्यवहार हुक्म का एक समृद्ध स्रोत है । विशेष रूप से, microenvironment की शारीरिक प्रकृति प्रमुख सेलुलर कार्यों मध्यस्थता कर सकते हैं, सेल विकास, प्रवास सहित, और भेदभाव1,2,3,4. microenvironment के यांत्रिकी के Dysregulation कई रोगों है कि अभी तक पर्याप्त उपचार नहीं है के लिए एक महत्वपूर्ण घटक है, इस तरह के कैंसर के रूप में5, atherosclerosis6, और फाइब्रोसिस7. कैसे कोशिकाओं जैव रासायनिक-जासूसी संकेतों में शारीरिक उत्तेजनाओं को बदलने की एक पूरी समझ, एक प्रक्रिया mechanotransductioned, आणविक बल संचरण मध्यस्थ तंत्र के elucidation की आवश्यकता है, दोनों में और कोशिकाओं के बाहर और कई उपसेलुलर संरचनाओं के भीतर ।

सेलुलर संरचनाओं के अंदर, प्रोटीन लगातार बदल रहे हैं; बाध्यकारी और बाध्यकारी भागीदारों के साथ उनकी बातचीत की ताकत के आधार पर बाइंडिंग8. बलों के लिए सफलतापूर्वक एक भौतिक दूरी भर में प्रेषित किया जा करने के लिए, वहां प्रोटीन के एक अटूट श्रृंखला-प्रोटीन बातचीत होना चाहिए, जिसका अर्थ है कि एक प्रोटीन कारोबार को बनाए रखने और अपने बाध्यकारी साथी9बल संचारित करने के लिए पर्याप्त धीमी होना चाहिए । जबकि प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत आम तौर पर कई गैर से मिलकर बनता है प्रोटीन डोमेन के बीच बांड आबंध, बातचीत अक्सर एक बाध्य राज्य के रूप में धारणा है कि विभिंन शर्तों10के तहत एक असीम राज्य के लिए संक्रमण कर सकते हैं, 11. एक दिया प्रोटीन-प्रोटीन संपर्क के लिए, यह संभव है कि बल बातचीत के जीवनकाल, एक "आदर्श बंधन" के रूप में जाना जाता है पर कोई प्रभाव नहीं हो सकता है, बातचीत के जीवनकाल कम, एक "पर्ची बांड" के रूप में जाना जाता है, या बातचीत के जीवनकाल में वृद्धि , एक "पकड़ो बांड"10के रूप में जाना जाता है । इस प्रकार, प्रोटीन लोड और प्रोटीन गतिशीलता के बीच एक जटिल संबंध है, जिसे हम बल-संवेदी गतिशीलता के रूप में संदर्भित करते हैं ।

बांड गतिशीलता पर लोड के प्रभाव को समझने की दिशा में, अत्यधिक जानकारीपूर्ण प्रयोगों की एक संख्या एकल-अणु स्तर पर प्रदर्शन किया गया है । अलग प्रोटीन, या प्रोटीन और चुंबकीय चिमटी, ऑप्टिकल चिमटी, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में हेरफेर तकनीक के टुकड़े का उपयोग करना, इन अध्ययनों से कई प्रासंगिक के लिए बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का प्रदर्शन किया है प्रोटीन्स11,12. दोनों integrins13 और cadherins14, जो transmembrane प्रोटीन सेल-मैट्रिक्स और सेल-सेल बातचीत, क्रमशः के गठन के लिए महत्वपूर्ण हैं, लोड करने के कारण गतिशीलता में परिवर्तन का प्रदर्शन किया है । सेल के भीतर, vinculin दोनों टलीं15 और α-catenin16 के लिए एक बल पर निर्भर तरीके से भर्ती है और17actin के साथ एक कैच बांड फार्म कर सकते हैं, दोनों फोकल आसंजन (फास) और vinculin जंक्शनों पर adherens के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत (AJs ) के अंतर्गत लोड । एकल अणु अध्ययन विशिष्ट प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत और उपज अस्पष्ट परिणाम के अलगाव के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन वे सेलुलर वातावरण की जटिलता के लिए खाते में नहीं है ।

मील का पत्थर प्रयोगों का प्रदर्शन किया है कि कई उपसेलुलर संरचनाओं, जिनमें शामिल है फास और AJs, mechanosensitive हैं, और प्रदर्शन के जवाब में बढ़ाया विधानसभा आंतरिक रूप से उत्पंन या बाह्य लागू-लोड18,19, 20,21,22. इसके अतिरिक्त, कई सैद्धांतिक मॉडल का सुझाव दिया है कि mechanosensitive विधानसभा बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता23,24,25से प्रेरित हो सकता है । जीवित कोशिकाओं के भीतर इन बल संवेदनशील गतिशीलता की जांच करने के लिए, कुछ अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण लिया गया है । frap है और संबंधित तकनीक कोशिकाओं में प्रोटीन गतिशीलता को मापने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल पद्धति प्रदान26,27,28,29. हालांकि, प्रोटीन लोड की माप अधिक सीमित किया गया है । एक ठेठ दृष्टिकोण के साथ कोशिकाओं में प्रोटीन गतिशीलता की तुलना करने के लिए और एक cytoskeletal अवरोधक के लिए जोखिम के बिना समग्र सेल सिकुड़ना8,30,31को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । धारणा, यह एक उच्च लोड और कम लोड राज्य के बीच एक तुलना है । हालांकि, वहां या तो राज्य में प्रोटीन भर में लोड का कोई ठहराव है, और वहां अवांछित अवरोध करनेवाला के जैव रासायनिक प्रभाव हो सकता है, इस तरह के एक एफ actin रेशा के साथ महत्वपूर्ण बाध्यकारी साइटों की हानि । एक और दृष्टिकोण, करने के लिए विशेष है, को मापने के लिए एफए द्वारा सब्सट्रेट पर कुल बल परिश्रम के लिए कर्षण बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग लगभग आणविक लोड करने के लिए और एफए३२के भीतर एक प्रोटीन की गतिशीलता के साथ संबंध की जांच करने के लिए किया गया है । हालांकि इस दृष्टिकोण कुल बल के ठहराव के लिए अनुमति देता है, यह आणविक विशिष्ट जानकारी प्रदान नहीं करता है । फास से अधिक २०० विभिंन प्रोटीन से बना रहे हैं, जिनमें से कई लोड३३सहन कर सकते हैं । इस प्रकार, एक एफए के कुल बल उत्पादन को मापने संभावित कई बल संचरण रास्ते की संभावना अस्पष्ट और मज़बूती से एक विशिष्ट प्रोटीन पर लोड का एक उपाय प्रदान नहीं करता है.

mechanobiology में पिछले दृष्टिकोण के विपरीत, झल्लाहट आधारित तनाव सेंसर के आगमन कोशिकाओं३४,३५,३६रहने वाले अंदर विशिष्ट प्रोटीन द्वारा अनुभवी भार के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है । यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि झल्लाहट आधारित तनाव सेंसर frap है-आधारित उपाय के साथ प्रोटीन की गतिशीलता को जोड़ती है पेश करते हैं । हम झल्लाहट के रूप में इस तकनीक का उल्लेख-frap है । इस दृष्टिकोण प्रोटीन लोड और प्रोटीन गतिशीलता के एक साथ माप सक्षम बनाता है, इस प्रकार के रहने वाले कोशिकाओं में बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता के आकलन की अनुमति (चित्रा 1) । पहले से ही, झल्लाहट-frap है तकनीक के अध्ययन के लिए लागू किया गया है सेना के प्रति संवेदनशील मैकेनिकल लिंकर प्रोटीन vinculin३७की गतिशीलता । तनाव सेंसर कई प्रोटीन है कि सेलुलर संरचनाओं की एक किस्म में प्रासंगिक है के लिए विकसित किया गया है । उदाहरण के लिए, सेंसर vinculin के लिए विकसित किया गया है३४ और टलीं३८,३९ में फास, cadherins और catenins में AJs४०,४१,४२, nesprin परमाणु LINC परिसर में ४३, α-actinin४४ और filamin३६ में cytoskeleton, और MUC-1 में glycocalyx४५, अंय लोगों के बीच४६। इसी तरह, frap है एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया तकनीक फोकल आसंजन8,31, adherens जंक्शनों४७, actin प्रांतस्था26, और नाभिक४८के भीतर mechanosensitive प्रोटीन पर इस्तेमाल किया गया है । आगे बढ़ते, झल्लाहट-frap है तकनीक इन मौजूदा सेंसरों या नव विकसित सेंसरों में से किसी के लिए मोटे तौर पर लागू किया जाना चाहिए, उपसेलुलर संरचनाओं और संदर्भों की एक विस्तृत विविधता में बल के प्रति संवेदनशील गतिशीलता के माप के लिए अनुमति देता है. इस अंत की ओर, हम झल्लाहट-frap है इन विभिंन प्रणालियों में लागू तकनीक को लागू करने के लिए एक विस्तृत, सामान्यीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । उंमीद है, यह प्रयोग की एक विस्तृत विविधता बल संचरण को विनियमित करने में विभिंन mechanosensitive प्रोटीन की भूमिका elucidating और मध्यस्थता सेल व्यवहार में सक्षम हो जाएगा ।

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Protocol

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1. इमेजिंग के लिए नमूने उत्पन्न

  1. छुरा एक्सप्रेस तनाव संवेदक वांछित सेल प्रकार में निर्माण ।
    1. क्लोन तनाव संवेदक pRRL वेक्टर या अंय वायरल अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में निर्माण ।
      नोट: कई अलग आणविक क्लोनिंग उपकरण प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग सहित इस कदम को प्राप्त करने के लिए उपलब्ध हैं, विस्तार ओवरलैप, और गिब्सन विधानसभा३५. pRRL वेक्टर लेंती वायरल transduction में प्रयोग किया जाता है और मानव cytomegalovirus (सीएमवी) प्रमोटर के उपयोग के माध्यम से प्रोटीन उत्पादन की एक पर्याप्त डिग्री सक्षम बनाता है । विभिंन वैक्टर एक विशेष संदर्भ के लिए आवश्यक हो सकता है । उदाहरण के लिए, सीएमवी प्रमोटर कुछ सेल प्रकार४९में मौन है । इसके अतिरिक्त, केवल झल्लाहट आधारित सेंसर कि mTFP1 और वीनस A206K के रूप में मजबूत अनुक्रम समरूपता, कमी है कि स्थिर सेल लाइनों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त । सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन युक्त सेंसर की संभावना मुताबिक़ पुनर्संयोजन५०के अधीन हो जाएगा ।
    2. मानक वायरस उत्पादन विधियों५१का उपयोग कर psPax2 और pMD2. G पैकेजिंग plasmids का उपयोग कर मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं में lentivirus उत्पन्न.
      चेतावनी: Lentivirus ही ठीक से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए एक सुरक्षा के स्तर पर 2 प्रयोगशाला पर्यावरण ।
      नोट: यह कोशिकाओं और पैकेजिंग plasmids के संयोजन pRRL के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त है । अंय प्रणालियों अंय वैक्टर के साथ की आवश्यकता हो सकती है ।
    3. Transduce मानक transduction प्रोटोकॉल५२ का उपयोग कर वायरस के साथ वांछित कोशिकाओं और उपयोग प्रवाह cytometry५३ कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए एक समरूप लगभग अंतर्जात स्तर३७पर प्रत्येक निर्माण व्यक्त जनसंख्या का चयन । सेल चयन के बाद, प्रयोगों तुरंत आयोजित किया जा सकता है, या कोशिकाओं को बाद में उपयोग के लिए क्रायोजेनिक जमे हुए किया जा सकता है । एक दिया स्थिर सेल लाइन के लिए 2 फ्रीज-गल चक्र से अधिक नहीं है ।
      नोट: सेल प्रोटीन में कमी लाइनों के उपयोग के लिए अध्ययन किया जा (जैसे, vinculin तनाव संवेदक के साथ प्रयोग के लिए vinculin-/MEFs) झल्लाहट प्रयोगों में शोर अनुपात के रूप में अच्छी तरह से सीमा से अधिक अभिव्यक्ति कलाकृतियों के लिए संकेत में वृद्धि होगी । इस तरह के स्थिर माउस भ्रूण fibroblast (MEF) लाइनों अभिव्यक्ति या सेंसर की गिरावट के महत्वपूर्ण नुकसान से पहले लगभग 15 मार्ग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है स्पष्ट है । यदि वायरल आधारित तरीकों वांछित नहीं हैं, वाणिज्यिक रिएजेंट के ढेर सारे के अनुसार एक उपयुक्त प्लाज्मिड में तनाव सेंसरों के साथ सेल प्रकार की एक किस्म transfect के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के मुताबिक इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे pcdna 3.1 । इष्टतम अभिव्यक्ति 24-48 ज निंनलिखित अभिकर्मक होगा ।
  2. सेल सीडिंग के लिए सब्सट्रेट तैयार करें ।
    1. 4, ३५ मिमी गिलास तली व्यंजन मोल ।
    2. एक सेल संस्कृति हूड में कार्य, एक 15 मिलीलीटर विहित ट्यूब में, 10 µ g/ml fibronectin के 4 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) में सेल संस्कृति हुड में बाँझ पंजाबियों का उपयोग कर समाधान । धीरे ट्यूब पलटना एक बार मिश्रण करने के लिए और समाधान सेल संस्कृति हूड में 5 मिनट के लिए बैठते हैं ।
      नोट: ECM प्रोटीन की एकाग्रता या प्रकार के अन्य सेल प्रकारों के लिए समायोजित करना पड़ सकता है । उपलब्ध कराई गई शर्तों MEFs के लिए उपयुक्त हैं ।
    3. प्रत्येक गिलास तली हुई डिश पर fibronectin समाधान के पिपेट 1 मिलीलीटर ।
    4. कमरे के तापमान पर या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए व्यंजन पर fibronectin समाधान छोड़ दें ।
    5. महाप्राण fibronectin समाधान, पंजाबियों के साथ एक बार कुल्ला, और पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. तैयार सब्सट्रेट पर कोशिकाओं बीज.
    1. एक 6 सेमी संस्कृति पकवान में उपखेती के लिए उपयुक्त एक संगम प्रतिशत पर ब्याज की कोशिकाओं के साथ शुरू करो ।
      नोट: विभिन्न सेल प्रकार अलग सेल संस्कृति की स्थिति और उपखेती प्रोटोकॉल की आवश्यकता होगी. यह अनुभाग MEFs के लिए उपयुक्त दिशानिर्देश प्रदान करता है । आम तौर पर, MEFs से पहले ८५% संगम के लिए उगाया जाता है ।
    2. एक सेल संस्कृति हूड के भीतर काम कर रहे हैं, एक बार सेल कुल्ला के साथ 3 पंजाबियों की मिलीलीटर । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ०.०५% Trypsin-EDTA और मशीन की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. 6 cm डिश के लिए पूरा मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें, कोशिकाओं को इकट्ठा, और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में जगह है ।
      नोट: पूर्ण मीडिया के लिए संयोजन उपयोग किए जा रहे कक्ष प्रकार पर निर्भर करेगा । MEFs के लिए, पूरा मीडिया अक्सर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% एंटीबायोटिक-Antimycotic (युक्त Amphotericin बी, पेनिसिलिन, और Streptomycin), और एक 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) समाधान के साथ उच्च ग्लूकोज Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम के रूप में परिभाषित किया गया है ।
    4. 5 मिनट के लिए १००० x g पर नीचे कोशिकाओं स्पिन ।
    5. मीडिया महाप्राण और पूरा मीडिया के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
    6. fibronectin-लेपित कांच के व्यंजन से पंजाबियों को हटा दें । १.५ मिलीलीटर के अंतिम खंड के लिए उपयुक्त पूर्ण मीडिया के साथ प्रत्येक fibronectin-लेपित ग्लास डिश पर कोशिकाओं और बीज ३०,००० कोशिकाओं गिनती ।
      नोट: इस कोशिका घनत्व MEFs के लिए उपयुक्त है और कोशिकाओं है कि छू नहीं कर रहे हैं की आबादी के लिए नेतृत्व करेंगे, लेकिन बेहद विरल नहीं. सटीक कक्ष संख्या अंय कक्ष प्रकार या अंय इमेजिंग चैंबर के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
    7. कोशिकाओं 4 के लिए प्रसार करने के लिए अनुमति दें एच निम्नलिखित सीडिंग. प्रसार के 2 घंटे में, विकास मीडिया महाप्राण, और इमेजिंग मीडिया के साथ एक बार कुल्ला, इमेजिंग मीडिया के १.५ मिलीलीटर जा ।
      नोट: यह प्रसार समय MEFs के लिए उपयुक्त है, लेकिन अंय कोशिकाओं के लिए परिवर्तित करने की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि, अधिक से अधिक 6-8 ज की मशीन अवधि पूरा मीडिया में सीरम से ECM प्रोटीन की महत्वपूर्ण जमाव को बढ़ावा मिलेगा । इमेजिंग मीडिया पूरा मीडिया के रूप में एक ही परिवर्धन शामिल होना चाहिए, लेकिन ऑप्टिकली स्पष्ट किया जाना चाहिए और किसी भी यौगिकों कि इमेजिंग चैनलों में fluoresce शामिल नहीं है, जैसे flavins, या बुझाने प्रतिदीप्ति, जैसे phenol लाल के रूप में । एक आम तौर पर उपयोगी इमेजिंग मीडिया है DMEM-gfp लाइव सेल विज़ुअलाइज़ेशन मीडिया 10% FBS और 1% NEAA समाधान के साथ पूरक । यदि बैकग्राउंड autofluorescence अस्वीकार्य उच्च है, तो सीरम की मात्रा कम की जा सकती है. प्रारंभिक चढ़ाना के बाद एक मीडिया परिवर्तन संभव नहीं है, तो कोशिकाओं को सीधे एक trypsin अवरोध करनेवाला के साथ पूरक इमेजिंग मीडिया में resuspend किया जा सकता है.

2. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप सेट अप

  1. माइक्रोस्कोप को चालू करें ।
    1. चाप दीपक को पहले चालू करें ।
      नोट: एक चाप लैंप एक विद्युत चुंबकीय पल्स, जो अंय उपकरणों है कि पहले से ही है पर नुकसान कर सकते है जारी करेंगे ।
    2. फिल्टर पहिया नियंत्रक, स्वचालित चरण नियंत्रक, माइक्रोस्कोप-कंप्यूटर इंटरफेस, और कैमरा चालू करें ।
    3. frap है लेज़र और लेज़र स्थिति नियंत्रकों को चालू करें ।
      चेतावनी: उच्चस्तरीय पराबैंगनीकिरण आंखों के लिए हानिकारक हो सकता है अगर सीधे देखा । यह खुर्दबीन सिस्टम को विंयस्त करने के लिए सिफारिश की है लेजर उत्तेजना से आंख के टुकड़ों को निर्देशित किया जा रहा है, जो ब्लीचिंग के दौरान frap है बीम पथ में एक दर्पण ले जाने के लिए नमूना की ओर लेजर को प्रतिबिंबित और संचरण को रोकने के द्वारा पूरा किया जा सकता है को ऐपिस ।
    4. कंप्यूटर और ओपन माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर को चालू करें ।
    5. चाप लैंप और frap है लेजर के लिए 15 मिनट के लिए गर्म करने की अनुमति दें ।
  2. frap है लेजर जांचना ।
    1. लेज़र कॉन्फ़िगरेशन विंडो खोलें । नमूने के लिए लेजर जोखिम के लिए उचित frap है रोशनी सेटिंग्स के लिए (पल्स) के दौरान प्रदीप्ति सेटिंग सेट करें । केवल स्वीकारकर्ता fluorophore इमेजिंग के लिए उपयुक्त दीप्ति सेटिंग्स के लिए (इमेजिंग के दौरान) रोशनी सेटिंग सेट करें.
    2. समंवय प्रणाली सेटिंगके तहत जांच करने के उद्देश्य का चयन करें । अचयनित मैन्युअल अंशांकन बिंदुओं पर क्लिक करें और अंशांकन के दौरान प्रदर्शन छवियोंकी जाँच.
    3. १०,००० µs और दालों की संख्या को १०० तक रखने के लिए आवास का समय निर्धारित करें ।
    4. अंशांकन स्लाइड प्लेस, ethidium ब्रोमाइड से बना एक गिलास स्लाइड और एक coverslip के बीच सील, coverslip पक्ष के साथ नीचे मंच अनुकूलक में ।
      चेतावनी: Ethidium ब्रोमाइड एक mutagen है और दस्ताने का उपयोग कर संभाला जाना चाहिए । यदि स्लाइड समझौता है, तो संस्था के दिशानिर्देशों के अनुसार निपटारा करें ।
    5. स्लाइड की सतह, प्रतिभाशाली संकेत के साथ फोकल विमान के रूप में पहचाने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए स्वीकारकर्ता प्रदीप्ति सेटिंग्स का प्रयोग करें । कोटिंग में छोटे दोषों ध्यान केंद्रित करने में सहायता करने के लिए दिखाई जाएगी ।
    6. स्लाइड को इमेजिंग विमान में यूनिफ़ॉर्म प्रतिदीप्ति के साथ किसी क्षेत्र में ले जाएं ।
    7. सेटिंग बनाएंपर क्लिक करें । सॉफ्टवेयर अंशांकन प्रक्रिया शुरू होगा, स्वचालित रूप से ब्लीचिंग और प्रक्षालित बिंदु की स्थिति का पता लगाने ।
    8. अंतिम छवि का आकलन करके सफल अंशांकन सुनिश्चित करें, जो कि प्रक्षालित अंक के 3 x 3 ग्रिड को समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए और ध्यान में रखना चाहिए । भविष्य में संदर्भ के लिए अंशांकन छवि को बचाओ ।
    9. अंशांकन स्लाइड को निकालें और सुरक्षित रूप से संग्रहीत करें । अंशांकन प्रत्येक प्रयोग शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए, लेकिन नमूनों के बीच प्रदर्शन करने की जरूरत नहीं है.

3. झल्लाहट इमेजिंग के लिए पैरामीटर्स चुनें

  1. 4% paraformaldehyde के लिए 10 min. paraformaldehyde समाधान के साथ तनाव संवेदक व्यक्त कोशिकाओं के उत्पन्न नमूनों में से एक को ठीक मेथनॉल मुक्त होना चाहिए, अक्सर के रूप में उन्हें कहा जाता ग्रेड, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की denaturing को रोकने के लिए. निर्धारण के बाद पंजाबियों में जगह.
    चेतावनी: Paraformaldehyde समाधान विषाक्त कर रहे हैं । यह कदम एक धुएं के हुड में किया जाना चाहिए और संस्थागत नीतियों के अनुसार समाधान का निपटारा किया जाना चाहिए ।
    नोट: यह अनुकूलन प्रोटीन गतिशीलता पर निर्भर नहीं करता है, और एक निश्चित नमूना सेल स्वास्थ्य के बारे में चिंता किए बिना अधिकतम इमेजिंग समय के लिए अनुमति देता है ।
  2. नमूना तीन बार पंजाबियों के साथ कुल्ला और पंजाबियों में छोड़ दें ।
    नोट: सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बढ़ते मीडिया का उपयोग fluorophore गुणों को प्रभावित करेगा, जो नमूने को झल्लाहट इमेजिंग५४के लिए अनुपयुक्त बनाता है । आदर्श रूप में, कोशिकाओं को तुरंत imaged किया जाएगा, लेकिन 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ा जा सकता है । अब प्रतीक्षा बार नमूना की गिरावट में परिणाम होगा ।
  3. नमूना इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप स्टेज धारक में रखें ।
  4. बहु-आयामी प्राप्ति (एमडीए) उपकरण खोलें । तीन चैनलों की एक अनुक्रमिक इमेजिंग की स्थापना: केवल उत्तेजना और उत्सर्जन (स्वीकारकर्ता चैनल), दाता उत्तेजना और स्वीकार उत्सर्जन (झल्लाहट चैनल), और दाता केवल उत्तेजना और उत्सर्जन (दाता चैनल) ।
    नोट: वहां तरीकों की छवि के नमूने झल्लाहट की एक किस्म है । तीन चैनल या "तीन घन" प्रणाली झल्लाहट क्षमता को मापने के साधन के साथ युग्मित इमेजिंग की विधि झल्लाहट आधारित तनाव सेंसरों५५,५६के लिए सिफारिश की है । इस दृष्टिकोण तेज, सरल, विनाशकारी है, केवल एक मानक प्रतिदीप्ति इमेजिंग माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है, और विभिंन दिनों और इमेजिंग setups भर में प्रयोगों की तुलना में सक्षम बनाता है ।
  5. 10% के ५०० एमएस और एक तटस्थ घनत्व (एन डी) फिल्टर के एक जोखिम समय का उपयोग नमूना स्कैन । ब्याज की एक संरचना करने के लिए स्पष्ट स्थानीयकरण के साथ तनाव संवेदक व्यक्त एक सेल का पता लगाएं ।
  6. ५०० ms या प्रत्येक इमेजिंग चैनल के लिए वांछित लंबाई और १००% की एक एन डी फिल्टर के एक जोखिम समय का चयन करें और एक झल्लाहट छवि अनुक्रम प्राप्त करते हैं ।
  7. प्रत्येक इमेजिंग चैनल में ब्याज की उपसेलुलर संरचनाओं पर संवेदक की औसत तीव्रता का अनुमान लगाएं । कम संकेतों अनुचित सुधार का अनुमान है, गैर-डिटेक्टरों में रैखिकता, या पृष्ठभूमि संकेतों का महत्वपूर्ण योगदान के कारण गलत परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एक अनुमानित दिशानिर्देश के लिए कैमरे की गतिशील रेंज के 10% से ऊपर तीव्रता के लिए लक्ष्य है (यानी, एक 16 बिट कैमरे के लिए, तीव्रता ६,००० से ऊपर होना चाहिए) ।
    नोट: समान ऑप्टिकल सेटिंग्स (एक्सपोजर टाइम्स, फिल्टर, उद्देश्यों, और कैमरा लाभ या बिन्नी के रूप में अन्य चर) की तुलना में किया जाएगा कि सभी झल्लाहट प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इन सेटिंग्स के किसी भी बदलने की राशि झल्लाहट है कि या तो उत्पंन है में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व करेंगे/ झल्लाहट दक्षता माप इन सेटिंग से स्वतंत्र हैं, लेकिन अंशांकन क्षमता झल्लाहट निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं. सिद्धांत रूप में, अंशांकन कारकों के विभिन्न सेट अलग ऑप्टिकल सेटिंग्स से झल्लाहट क्षमता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह अनुशंसित नहीं है. ब्लीचिंग या phototoxicity विभिंन सेटिंग्स के बीच अलग हो सकता है, नकली परिणाम पैदा ।
  8. देखने के एक ही क्षेत्र के एक दूसरे झल्लाहट छवि अनुक्रम प्राप्त । प्रत्येक इमेजिंग चैनल में सेंसर की औसत तीव्रता की तुलना करके फ्रेम के बीच photobleaching का अनुमान लगाएं । Photobleaching एक ंयूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए, अधिमानतः संकेत के 1-5% से कम नुकसान ।
  9. photobleaching को ंयूनतम करते समय तीव्रता को अधिकतम करने के लिए इमेजिंग पैरामीटर समायोजित करें । मोटे समायोजन के लिए, प्राप्ति के दौरान उपयोग किए जा रहे ND फ़िल्टर परिवर्तित करें । बेहतर समायोजन के लिए, २५० ms के चरणों में एक्सपोज़र समय परिवर्तित करें ।
  10. दोहराएं चरण ३.५ – ३.८ तक पर्याप्त संकेत प्राप्त किया जा सकता जब तक photobleaching ंयूनतम ।
    नोट: आमतौर पर, vinculin-/-MEFs में vinculin तनाव संवेदक के लिए सेटिंग्स १,५०० एमएस, १,५०० ms हैं, और १,००० एमएस दाता के लिए, झल्लाहट, और स्वीकारकर्ता चैनल क्रमशः । इष्टतम मूल्यों रोशनी प्रणाली, उद्देश्य, फिल्टर सेट, और सेंसर अभिव्यक्ति स्तर के प्रकार के साथ भिन्न हो जाएगा ।

4. frap है इमेजिंग के लिए पैरामीटर्स चुनें

  1. आसपास के क्षेत्र या धूप के कारण बिना ब्याज के क्षेत्र (ROI) के पूर्ण ब्लीचिंग सुनिश्चित करने के लिए लेज़र सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ करें.
    1. 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ तनाव संवेदक व्यक्त कोशिकाओं के उत्पन्न नमूनों में से एक को ठीक करें ।
      नोट: यह अनुकूलन प्रोटीन गतिशीलता पर निर्भर नहीं करता है, और एक निश्चित नमूना सेल स्वास्थ्य के बारे में चिंता किए बिना अधिकतम इमेजिंग समय के लिए अनुमति देता है । इससे मोबाइल प्रोटीन द्वारा ब्लीचिंग की वसूली को भी रोका जा सकेगा, ब्लीचिंग के प्रभाव से होने वाले अलगाव के लिए अनुमति, तेजी से किसी भी प्रभाव से बचने, प्रसार-मध्यस्थता प्रतिदीप्ति ब्लीचिंग की घटनाओं के बीच होने वाली वसूली और ले पहली पोस्ट-ब्लीच छवि ।
      चेतावनी: Paraformaldehyde समाधान विषाक्त कर रहे हैं । यह कदम एक धुएं के हुड में किया जाना चाहिए और संस्थागत नीतियों के अनुसार समाधान का निपटारा किया जाना चाहिए ।
    2. पंजाबियों के साथ नमूना 3 बार कुल्ला और पंजाबियों में छोड़ दें ।
      नोट: सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बढ़ते मीडिया का उपयोग fluorophore गुणों को प्रभावित करेगा, frap है इमेजिंग५४के लिए अनुपयुक्त नमूना बना रहा है । आदर्श रूप में, कोशिकाओं को तुरंत imaged किया जाएगा, लेकिन 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ा जा सकता है । अब प्रतीक्षा बार नमूना की गिरावट में परिणाम होगा ।
    3. नमूना इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप स्टेज धारक में रखें ।
    4. लेज़र कॉन्फ़िगरेशन विंडो खोलें । १,००० µs और 10 दालों की एक लेजर निवास समय की स्थापना के साथ शुरू, जिसका अर्थ है कि रॉय भर में स्कैन में प्रत्येक स्थान पूर्ण शक्ति लेजर के १०,००० µs प्राप्त होगा
      नोट: एक ५०० मेगावाट, ५१५ एनएम लेजर ब्लीचिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह चुनिंदा ब्लीच वीनस A206K, vinculin तनाव संवेदक में स्वीकार्य, अधिक से अधिक कुशलता के साथ चुना गया था । यदि झल्लाहट अंय फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ तनाव सेंसर आधारित उपयोग किया जाता है, लेजर के एक अंय प्रकार के लिए कार्यरत हो सकता है ।
    5. ब्याज की एक संरचना के लिए स्पष्ट स्थानीयकरण के साथ तनाव संवेदक एक्सप्रेस और एक छवि प्राप्त करने के लिए एक सेल का पता लगाएं ।
    6. बनाएं एक आयताकार रॉय ब्लीच करने के लिए क्षेत्र की रूपरेखा और रॉय स्थान की दुकान । लेजर पल्स । नमूना की एक और छवि स्नैप ।
      नोट: बॉक्स का आकार लगभग पूरे एफए का आकार होना चाहिए । ध्यान रखा जाना चाहिए कि बॉक्स का आकार काफी प्रयोगों में भिंन नहीं है । ब्लीच्ड क्षेत्र सावधानी से प्रोटीन जिनकी गतिशीलता प्रसार से प्रभावित होते है में निगरानी की जानी चाहिए । यह transmembrane प्रोटीन में एक संभावित चिंता का विषय है, जैसे cadherins४७, या प्रोटीन है कि धीरे फैलाना27,५७
    7. जाँच करके photobleaching की गुणवत्ता की जांच करें कि पूरे रॉय ब्लीच किया गया है कि इस तरह की तीव्रता पृष्ठभूमि के स्तर के पास है । इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि वहां कोई ब्लीचिंग रॉय के बाहर है ।
    8. के रूप में रॉय के बाहर महत्वपूर्ण ब्लीचिंग उत्प्रेरण के बिना लागत पर ब्लीचिंग की एक महत्वपूर्ण राशि प्राप्त करने की आवश्यकता के रूप में लेजर सेटिंग्स समायोजित करें । मोटे समायोजन के लिए, बढ़ाएं और १०० µs के चरणों में निवास समय कम है, और ठीक समायोजन के लिए, बढ़ा और 5 दालों के चरणों में दालों की संख्या कम है ।
    9. दोहराएं चरण 4.1.5 – 4.1.8 ंयूनतम सेटिंग पर पहुंच जब तक रॉय पूरी तरह से बंद लक्ष्य photobleaching के बिना ब्लीच है ।
      नोट: phototoxicity उत्प्रेरण के बिना एक पर्याप्त प्रारंभिक ब्लीचिंग मूल्य प्राप्त करने frap है विश्लेषण का एक महत्वपूर्ण पहलू है । लेजर सेटिंग्स का उपयोग करें कि निश्चित नमूनों में एक पूर्ण ब्लीच में परिणाम । सामान्य तौर पर, वांछित ब्लीचिंग स्तर को प्राप्त करने के लिए फोटॉनों की न्यूनतम संख्या का उपयोग किया जाना चाहिए. इसके अलावा, ब्लीचिंग प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत प्रयोगों के दौरान संगत रखा जाना चाहिए, के रूप में परिवर्तन प्रोटीन गतिशीलता५८की माप को प्रभावित कर सकते हैं.
  2. समय चूक मापदंडों का अनुकूलन पूरी तरह से ब्याज के प्रोटीन की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए जबकि photobleaching ंयूनतम ।
    1. सूक्ष्म सेट अप लाइव सेल इमेजिंग के लिए तैयार है, अधिमानतः एक गर्म चरण और उद्देश्य के साथ ही सह2 नियंत्रण के साथ । 20 मिनट के लिए equilibrate करने की अनुमति दें ।
      नोट: imaged कोशिकाओं के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए, तापमान और पीएच इमेजिंग पोत में बनाए रखा जाना चाहिए । गर्म चरणों और उद्देश्य हीटर की एक किस्म आसानी से ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेल के तापमान को बनाए रख सकते हैं । कई मीडिया प्रकार के लिए पीएच के नियंत्रण के एक सिकुड़नेवाला पंप के उपयोग के द्वारा पूरा किया जा सकता है humidified 5% सह2 पास नमूना पर 15 मिलीलीटर/वैकल्पिक रूप से, यदि सह2 नियंत्रण अनुपलब्ध है, तो लाइव इमेजिंग मीडिया HEPES युक्त करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए बड़े पीएच परिवर्तन रोकें ।
    2. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप स्टेज धारक में तनाव संवेदक व्यक्त कोशिकाओं के उत्पन्न नमूनों में से एक प्लेस. 10 मिनट के लिए equilibrate करने की अनुमति दें ।
    3. एमडीए उपकरण का उपयोग करना, एक समय की स्थापना के लिए 3-5 छवियां पूर्व ब्लीच, ब्लीच रॉय प्राप्त करने के लिए चूक, और 10-60 छवियां ले जारी है ।
      नोट: के लिए vinculin पर, इमेजिंग हर 5 5 मिनट के बाद ब्लीच के लिए अत्यधिक ब्लीचिंग31शुरू करने के बिना गतिशीलता का पालन करने के लिए पर्याप्त है । इमेजिंग दर और कई अंय प्रोटीन के लिए अवधि के लिए उपयोगी प्रारंभिक अंक साहित्य४७,४८,५९,६०में पाया जा सकता है ।
    4. एक पर्याप्त सिग्नल के लिए शोर अनुपात, छवि के लिए ब्याज की संरचना को बनाए रखते हुए, प्रकाश करने के लिए नमूने के जोखिम को कम करने कि स्वीकार्य इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग करें. एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु एन डी फिल्टर और जोखिम समय झल्लाहट के दौरान स्वीकारकर्ता की इमेजिंग के लिए आवश्यक का आधा है ।
    5. ब्याज की एक संरचना के लिए स्पष्ट स्थानीयकरण के साथ तनाव संवेदक व्यक्त एक सेल का पता लगाएं और एक छवि स्नैप.
    6. एक आयताकार रॉय आकर्षित करने के लिए जहां ब्लीच करने के लिए और रॉय स्थान की दुकान पर प्रकाश डाला । समय चूक शुरू करते हैं ।
    7. संभावित समस्याओं के लिए छवियों के परिणामस्वरूप सेट की जांच करें ।
      1. फ्रेम के बीच प्रतिदीप्ति वसूली में पर्याप्त कूदता (प्रारंभिक तीव्रता के 10% से अधिक) कर रहे हैं, फ्रेम के बीच समय-कदम को कम ।
      2. यदि समय पर प्रतिदीप्ति का एक महत्वपूर्ण वैश्विक नुकसान (प्रारंभिक तीव्रता के 5-10% से अधिक) है, के बाद लिया छवियों की संख्या कम ब्लीच और/या इमेजिंग सेटिंग्स को बदलने के लिए प्रकाश नमूना के जोखिम को कम ।
      3. यदि प्रतिदीप्ति वसूली समय-चूक के अंत तक नहीं पठारी है, समय-चूक की कुल लंबाई में वृद्धि ।
    8. तदनुसार समय चूक मापदंडों को समायोजित करें और दोहराएं कदम 4.2.5 – 4.2.7 जब तक प्रतिदीप्ति वसूली पर्याप्त रूप से वैश्विक तस्वीर-नमूने को नुकसान के बिना कब्जा कर लिया है ।

5. प्राप्त झल्लाहट-frap है डेटा

  1. सूक्ष्म सेट अप लाइव सेल इमेजिंग के लिए तैयार है, अधिमानतः एक गर्म चरण और उद्देश्य के साथ ही सह2 नियंत्रण के साथ । 20 मिनट के लिए equilibrate करने की अनुमति दें ।
    1. छवि वाले कोशिकाओं के स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने के लिए, इमेजिंग चैंबर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखें । पीएच बनाए रखने के लिए 15 मिलीलीटर/मिनट पर नमूना पर 5% CO2 humidified पास करने के लिए एक सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग करें ।
    2. वैकल्पिक रूप से, यदि सह2 नियंत्रण अनुपलब्ध है, HEPES युक्त लाइव इमेजिंग मीडिया का उपयोग बड़े पीएच परिवर्तन से रोकने के लिए ।
  2. एमडीए उपकरण खोलें और अलग फिल्टर सेट सहित झल्लाहट इमेजिंग मापदंडों, के साथ सेट ।
  3. इस एमडीए को MDA_FRET_Dateके नाम से प्रयोगात्मक फोल्डर में सेव करें ।
  4. अलग फिल्टर सेट, समय चूक सेटिंग्स, और पूर्व ब्लीच अधिग्रहण के बाद लेजर पल्स करने के लिए पत्रिका सहित frap है इमेजिंग मापदंडों के साथ एक और एमडीए सेट.
  5. इस एमडीए को MDA_FRAP_Dateके नाम से प्रयोगात्मक फोल्डर में सेव करें । एमडीए विंडो बंद कर देता है ।
  6. स्क्रीन के शीर्ष पर उपकरण पट्टी में, जर्नल का चयन करें | रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें
  7. एमडीए विंडो खोलें, लोड MDA_FRET_Date राज्य और प्रेस अधिग्रहण। फिर MDA_FRAP_Date राज्य और प्रेस अधिग्रहणलोड ।
  8. अधिग्रहण के अंत में, उपकरण पट्टी में स्क्रीन के शीर्ष पर, जर्नल का चयन करें | रिकॉर्डिंग रोकें
  9. इस जर्नल को FRETFRAP_Date के नाम से प्रयोगात्मक फ़ोल्डर में सहेजें और इसे आसान पहुंच के लिए किसी उपकरण पट्टी में जोड़ें । एमडीए विंडो बंद कर देता है ।
  10. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप धारक में तनाव संवेदक व्यक्त कोशिकाओं के उत्पन्न नमूनों में से एक प्लेस. 10 मिनट के लिए equilibrate करने की अनुमति दें ।
  11. अधिग्रहण के तहत छवि अधिग्रहण का उपयोग कर नमूना नेविगेट न्यूनतम जोखिम समय और एन डी फिल्टर के साथ प्राप्त करने के लिए ब्याज की कोशिकाओं की पहचान ।
  12. डिवाइसेस पर नेविगेट करके निरंतर फ़ोकस सेट करें । ध्यान दें। मैंयुअल रूप से सही इमेजिंग विमान तक पहुंचने तक नमूने पर ध्यान केंद्रित ।
  13. निरंतर फ़ोकस सेटकरें पर क्लिक करके सिस्टम को समायोजित करने के लिए प्रतीक्षा करें, और निरंतर ध्यान केंद्रित करना प्रारंभ
    नोट: यह आवश्यक नहीं है, लेकिन काफी frap है रिकवरी curves की गुणवत्ता में सुधार क्योंकि यह नमूना बाहर की ओर बहती से रोकता है ।
  14. ब्याज की एक संरचना के लिए स्पष्ट स्थानीयकरण के साथ तनाव संवेदक व्यक्त एक सेल का पता लगाएं और एक छवि स्नैप.
  15. एक आयताकार रॉय आकर्षित करने के लिए जहां ब्लीच को उजागर । ROI स्थान संग्रहीत करते हैं.
  16. प्रारंभ FRETFRAP_Date जर्नल, जो frap है समय-चूक के प्रारंभ के बाद झल्लाहट छवियों का अधिग्रहण शुरू हो जाएगा ।
  17. दोहराएं चरण 5.14-5.16 तक 10-15 छवि सेट प्राप्त कर रहे हैं ।
    नोट: माप को एक ही कक्ष में दोहराया नहीं जा सकता । एक बार photobleaching होता है, झल्लाहट डेटा अविश्वसनीय है ।

6. झल्लाहट का विश्लेषण करें-frap है डेटा

  1. झल्लाहट पसंद के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण ।
    नोट: वहां ratiometric झल्लाहट६२ और झल्लाहट सूचकांक३४,३५सहित छवि और quantitate झल्लाहट६१, के लिए कई तरीके हैं । हालांकि, यह अत्यधिक झल्लाहट-frap है डेटा की व्याख्या के लिए क्षमता५५,६३ के अनुमान का उपयोग करने के लिए अनुशंसित है । इस विषय की और अंवेषण के लिए चर्चा देखें । के लिए संवेदनशील उत्सर्जन और झल्लाहट क्षमता की गणना, कस्टम सॉफ्टवेयर https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public पर हॉफमैन लैब से उपलब्ध है ।
  2. ब्लीच किया गया था कि प्रत्येक उपसेलुलर संरचना के लिए प्रासंगिक मापदंडों को बढ़ाता है. इस औसत झल्लाहट सूचकांक/दक्षता और औसत प्रारंभिक स्वीकार्य तीव्रता (एकाग्रता के लिए आनुपातिक) शामिल है लेकिन यह भी रॉय आकार के रूप में भौतिक मापदंडों को शामिल कर सकते है चाहिए ।
  3. frap है पसंद के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण ।
    नोट: quantitate frap है26,27,28,29के लिए कई तरीके हैं । मुख्य प्रयोगात्मक चिंताओं में ब्लीचिंग के बाद ब्लीचिंग के लिए लेखांकन शामिल हैं, पृष्ठभूमि तीव्रता में परिवर्तन, और अत्यधिक गतिशील उपसेलुलर संरचनाओं के translocation, जैसे फोकल आसंजन. ब्लीचिंग सुधार और पृष्ठभूमि रोशनी में बदलाव गैर के विश्लेषण के माध्यम से पूरा किया जा सकता है-प्रक्षालित और गैर छवियों के फ्लोरोसेंट क्षेत्रों । अत्यधिक गतिशील सेलुलर संरचनाओं, विशेष रूप से उन अत्यधिक वृद्धि या विधानसभा गतिशीलता दिखा मानक frap है विश्लेषण के साथ असंगत है और विश्लेषण नहीं किया जाना चाहिए । साथ ही, डेटा को सामान्य करने के तरीके की एक किस्म है । प्रदान की दिशा निर्देशों सरलतम विश्लेषण के लिए कर रहे हैं ।
  4. ब्लीचिंग प्रभाव के लिए रिकवरी डेटा को सही और फिर पूर्व ब्लीच तीव्रता को सामान्य. वसूली के आधे समय को बढ़ाता है और निम्नलिखित समीकरण के अनुसार मोबाइल अंश28,३४:
    एमएफ-(एमएफ-आर) ई- टी.
    जहां MF मोबाइल अंश है, आर प्रारंभिक वसूली है, और कश्मीर वसूली दर है । वसूली के आधे समय के द्वारा निर्धारित किया जाता है:
    τ1/2 = ln 2/
    नोट: इन विश्लेषणों६४ के साथ ही ImageJ plugins की एक किस्म को पूरा करने के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर संकुल की एक किस्म है । कस्टम सॉफ्टवेयर https://gitlab.oit.duke.edu/HoffmanLab-Public पर हॉफमैन लैब से उपलब्ध है । अधिक विश्लेषण स्थितियों जहां प्रसार ब्याज की प्रोटीन की गतिशीलता को प्रभावित करता है के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, एकाधिक समय तराजू वसूली में स्पष्ट कर रहे हैं, या गैर मानक ब्लीचिंग geometries का उपयोग किया जाता है ।

7. झल्लाहट की व्याख्या-frap है डेटा

  1. प्रत्येक रॉय सहित के लिए प्रासंगिक जानकारी संकलित करें: झल्लाहट सूचकांक/दक्षता, स्वीकार्यता तीव्रता, frap है आधा समय, frap है मोबाइल अंश ।
    नोट: झल्लाहट सूचकांक या दक्षता के लिए रॉय के भीतर प्रोटीन भर में औसत लोड निर्धारित किया जाता है । स्वीकारकर्ता तीव्रता प्रोटीन के स्थानीय एकाग्रता उपाय । वसूली के आधे समय प्रोटीन गतिशीलता का एक उपाय है । एक छोटे आधे समय और अधिक तेजी से कारोबार इंगित करता है । frap है मोबाइल अंश रॉय कि सक्रिय रूप से अधिक बदल रहा है भीतर प्रोटीन की मात्रा उपाय । एक बड़ा मोबाइल अंश इंगित करता है कि रॉय के भीतर प्रोटीन का एक बड़ा प्रतिशत से अधिक मोड़ रहा है ।
  2. प्रोटीन कारोबार की दर और राशि पर स्थानीय एकाग्रता के प्रभाव की जांच करने के लिए, साजिश frap है आधा समय और प्रारंभिक स्वीकार्यता तीव्रता के खिलाफ मोबाइल अंश ।
  3. प्रोटीन टर्नओवर दर और राशि पर प्रोटीन भार के प्रभाव की जांच करने के लिए, भूखंड frap है आधा समय और मोबाइल अंश के खिलाफ झल्लाहट सूचकांक/
    नोट: प्रोटीन या संरचना पर निर्भर करता है, यह भी संरचना आकार या सनक के रूप में भौतिक मापदंडों के प्रभाव की जांच करने के लिए दिलचस्प हो सकता है, प्रोटीन लोड या कारोबार पर.

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Representative Results

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झल्लाहट-frap है दो फ्लोरोसेंट तकनीक, झल्लाहट और frap है के संयोजन से बना है । हम प्रोटीन लोड के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित के रूप में, हम झल्लाहट-आधारित तनाव सेंसर३४,४६इस्तेमाल किया । इन सेंसरों अक्सर एक flagelliform linker (आंकड़ा 1a) से जुड़ा है, ऐसे mTFP1 और VenusA206K के रूप में दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन से मिलकर एक तनाव संवेदन मॉड्यूल पर आधारित हैं । जब मॉड्यूल एक प्रोटीन के सिर और पूंछ डोमेन के बीच रखा गया है, यह उपाय करने के लिए प्रोटीन भर में लागू लोड संभव है । जब झल्लाहट डेटा का विश्लेषण, छवियों को स्वीकारकर्ता चैनल में लिया तनाव सेंसर स्थानीयकरण और एकाग्रता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है, के रूप में इस संकेत झल्लाहट (चित्र 1b) के स्वतंत्र है. झल्लाहट दक्षता की गणना के बाद, प्रोटीन लोड एक वर्णमिति पैमाने पर जहां कूलर रंग की ओर झल्लाहट क्षमता में कमी प्रोटीन लोड में वृद्धि इंगित करता है पर visualized किया जा सकता है, और लाल रेंज में झल्लाहट क्षमता कम प्रोटीन लोड संकेत मिलता है ( चित्र 1b) । frap है इमेजिंग ब्लीच के लिए एक लेजर का उपयोग करके आयोजित किया जाता है स्वीकारकर्ता एक एकल सेलुलर संरचना में fluorophore और समय पर निगरानी वसूली (चित्रा 1C) । परिणामस्वरूप सामान्यीकृत frap है वक्र वसूली और मोबाइल अंश (चित्रा 1 डी) के आधे समय सहित प्रोटीन गतिशीलता, का वर्णन मापदंडों को निकालने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है । क्योंकि झल्लाहट और frap है विश्लेषण एक ही सेल पर प्रदर्शन किया गया था, औसत प्रोटीन लोड और एक उपसेलुलर संरचना में कारोबार एक बिंदु के रूप में रची जा सकती है । इमेजिंग एकाधिक कोशिकाओं कई बिंदुओं की पैदावार और एक उभरती हुई प्रवृत्ति का संकेत कर सकते हैं कि क्या एक प्रोटीन अस्थिर है (चित्रा 1E) या आणविक भार (चित्रा 1F) द्वारा स्थिर.

vinculin तनाव संवेदक (VinTS) छुरा vinculin नल में व्यक्त MEFs बहुत स्पष्ट रूप से सेल भर में फैला है, के रूप में स्वीकारकर्ता चैनल छवि (चित्रा 2a) को देखकर देखा के लिए स्थानीयकरण । स्वीकार्य चैनल छवि एक विभाजन मुखौटा है कि एक अद्वितीय आईडी के साथ प्रत्येक व्यक्ति एफए की पहचान करता है, नेत्रहीन अलग रंग (चित्रा बी) द्वारा निर्दिष्ट बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । विभाजन एल्गोरिथ्म "पानी" विधि पर आधारित है और लगभग चमक के क्रम में, पहले३४,६५वर्णित के रूप में फास लेबल । विभाजन परिणाम एक द्विआधारी मुखौटा है जो फिर झल्लाहट दक्षता परिणाम (चित्रा 2c) के लिए लागू किया जाता है में बदल रहे हैं, और प्रत्येक अद्वितीय एफए के भीतर औसत झल्लाहट क्षमता (चित्रा 2d) की गणना की है । अतिरिक्त गुण एक समान तरीके से एक एफए के लिए गणना की जा सकती, औसत स्वीकारकर्ता तीव्रता, आकार, सनक, और कक्ष के भीतर स्थान सहित. इस तरह, जो भी एफए frap है के लिए चुना जाता है अद्वितीय एफए आईडी और संबंधित संपत्तियों के लिए मिलान किया जा सकता है ।

frap है इमेजिंग और विश्लेषण कई कारकों है कि नियंत्रित किया जा सकता है के प्रति संवेदनशील है, लेजर और इमेजिंग पैरामीटर सहित, और कुछ कारकों है कि नियंत्रित नहीं किया जा सकता है, जैसे समग्र एफए स्थिरता26,27,28, 29. उदाहरण के लिए, बहुत अधिक समय-चूक इमेजिंग के दौरान प्रकाश के लिए जोखिम frap है डेटा की व्याख्या में प्रमुख मुद्दों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हालांकि ब्लीच नहीं किए गए नियंत्रण फास के विश्लेषण के लिए समय के साथ छोटे photobleaching के लिए सामान्य करने के लिए उपयोग किया जा सकता, प्रकाश करने के लिए नमूना का बहुत अधिक जोखिम के साथ, जिसके परिणामस्वरूप frap है वक्र एक प्रारंभिक वसूली सामान्यीकृत तीव्रता में एक डुबकी के बाद से पता चलता है कि किसी घातांक फ़ंक्शन के साथ सटीक रूप से फ़िट नहीं हो सकता । इस प्रभाव को डेटा में लगातार मनाया जाता है, तो यह या तो जोखिम समय कम करने के लिए इमेजिंग पैरामीटर्स को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए आवश्यक है, इमेजिंग फ़्रेम के बीच समय-चरण बढ़ाएँ, या समय-चूक की लंबाई कम करने के लिए नमूना का एक्सपोज़र करने के लिए प्रकाश ।

frap है डेटा का एक और उदाहरण है कि व्याख्यात्मक है, जब एफए कि translocates28वसूली के दौरान तेजी से photobleached था । अत्यधिक translocation का एक प्रतिनिधि मामला चित्रा 3में दिखाया गया है । प्रारंभिक छवि, जहां ROIs चुना जाता है, एफए स्थिरता (3ए) का संकेत नहीं देता है । समय के साथ प्रक्षालित एफए निगरानी, यह जल्दी से प्रारंभिक स्थिति से दूर ले जाता है और स्वचालित ट्रैकिंग photobleaching (चित्रा 3ए) निम्नलिखित कम फ्लोरोसेंट संकेत के कारण तुरंत पालन करने में असमर्थ है. परिणामस्वरूप frap है वक्र एक कूद के साथ मामूली वसूली का एक प्रारंभिक चरण से पता चलता है जब प्रतिदीप्ति के लिए पर्याप्त सॉफ्टवेयर एफए का पता लगाने और रॉय (चित्र बी) ले जाने के लिए बरामद किया है । यह वक्र किसी घातांक फ़ंक्शन द्वारा सफलतापूर्वक फ़िट नहीं किया जा सकता । एफए के तेजी से translocation भी पता चलता है कि एफए संरचना अस्थिर है । इस प्रकार, अस्थिर फास एक ही झल्लाहट-frap है विश्लेषण में स्थिर फास, दोनों तकनीकी और जैविक समस्याओं के कारण के रूप में शामिल नहीं किया जाना चाहिए ।

संतोषजनक झल्लाहट और frap है डेटा के साथ, अगले कदम एक साथ प्रोटीन लोड और गतिशीलता का आकलन करके झल्लाहट-frap है विश्लेषण पूरा कर रहा है । चित्रा 4a तीन vinculin नल MEFs छुरा VinTS व्यक्त की झल्लाहट दक्षता नक्शे से पता चलता है । सफेद में उल्लिखित फास frap है विश्लेषण के लिए चुना गया है, और स्वीकार तीव्रता समय पर दिखाए जाते हैं । इन तीन फास लोड की विभिन्न मात्रा के अंतर्गत vinculin है और एक भिन्न vinculin पुनर्प्राप्ति प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करें । वसूली के आधे समय की गणना और प्रत्येक एफए में औसत झल्लाहट दक्षता के खिलाफ साजिश रचने के द्वारा इन गुणों को बढ़ाता है vinculin की कुल प्रवृत्ति बढ़ लोड (चित्रा 4B) द्वारा स्थिर किया जा रहा है दर्शाता है । हालांकि, झल्लाहट क्षमता के खिलाफ साजिश रची मोबाइल अंश कोई प्रवृत्ति नहीं दिखाता है, सुझाव है कि मोबाइल अंश आणविक भार (फिगर 4c) द्वारा विनियमित नहीं है. एमिनो एसिड ५० में VinTS में एक बिंदु उत्परिवर्तन का परिचय (A50I) को रोकने के लिए दिखाया गया है vinculin के भीतर एक प्रमुख बाध्यकारी भागीदार के लिए बाध्यकारी, टलीं६६। इस प्रोटीन-प्रोटीन संपर्क के परिवर्तन vinculin बल-संवेदी गतिशीलता को प्रभावित करता है । Vinculin अशक्त MEFs छुरा व्यक्त VinTS A50I अलग सेल और एफए morphologies, अलग Vinculin लोडिंग प्रोफाइल, और अलग Vinculin गतिशीलता (चित्रा 4d) है । वसूली और झल्लाहट क्षमता का आधा समय बढ़ाता है और साजिश रचने से पता चलता है कि जब vinculin-टलीं बातचीत परेशान है, vinculin में वृद्धि लोड (चित्रा 4E) द्वारा अस्थिर है, जबकि मोबाइल अंश कोई प्रवृत्ति से पता चलता है (चित्रा 4F ).

Figure 1
चित्रा 1: झल्लाहट के सिद्धांतों-frap है तकनीक । (क) की योजनाबद्ध झल्लाहट आधारित तनाव संवेदक मॉड्यूल (TSMod) ब्याज की एक प्रोटीन और झल्लाहट संकेत पर तनाव के प्रभाव में डाला. (ख) संवेदनशील उत्सर्जन का उपयोग झल्लाहट यों तो, छवियों दाता संकेत पर कब्जा करने के लिए ले जाया जाता है (नहीं दिखाया गया), स्वीकार संकेत, और झल्लाहट संकेत । उचित सुधार के साथ, झल्लाहट छवि कितना तनाव सेंसर करने के लिए लागू किया जा रहा है कल्पना करने के लिए एक वर्णमिति पैमाने सौंपा जा सकता है । (ग) frap है स्वीकारकर्ता संकेत है, जो सीधे एकाग्रता के लिए आनुपातिक है का उपयोग कर आयोजित किया जाता है । (घ) frap है इमेजिंग विश्लेषण समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता के curves कि प्रोटीन गतिशीलता का निर्धारण करने के लिए गणितीय मॉडल का उपयोग फिट हो सकता है पैदा करता है । (ङ, च) जब झल्लाहट और frap है संयुक्त कर रहे हैं, एक एकल एफए में बल और कारोबार मापा जा सकता है । कई कोशिकाओं में कई फास मापने प्रोटीन लोड और प्रोटीन कारोबार के बीच एक रिश्ता पैदावार । इस विश्लेषण में, एक संबंध में वृद्धि हुई कारोबार के साथ लोड को संबद्ध एक बल-अस्थिर राज्य (ङ) के रूप में संदर्भित किया जाता है । इस विश्लेषण में, एक रिश्ता है जिसमें वृद्धि हुई लोड कम कारोबार के साथ संबद्ध एक बल-स्थिर राज्य (एफ) के रूप में जाना जाता है । यह आंकड़ा Rothenberg एट अल से संशोधित किया गया है । ३७. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 2
चित्रा 2: एफए पहचान और झल्लाहट विश्लेषण । (क) एक vinculin अशक्त MEF स्वीकारकर्ता चैनल में visualized VinTS व्यक्त, जहां तीव्रता vinculin की स्थानीय एकाग्रता इंगित करता है । स्केल बार = 30 µm. (ख) फास स्वीकारकर्ता चैनल के आधार पर विभाजित कर रहे हैं एक एफए आईडी मुखौटा बनाने के लिए जहां प्रत्येक एफए एक अद्वितीय आईडी आवंटित किया जाता है, यहाँ विभिन्न रंगों के रूप में दिखाया गया है, लगभग चमक के क्रम में. (ग) एफए आईडी मुखौटा एक द्विआधारी मुखौटा में बदल जाता है और झल्लाहट क्षमता छवि पर लागू करने के लिए केवल फास पर झल्लाहट दक्षता मान दिखाने के लिए । (घ) प्रत्येक एफए के भीतर झल्लाहट क्षमता प्रत्येक एफए, जो एफए आईडी के साथ जुड़ा हुआ है के लिए एक भी मूल्य प्राप्त करने के लिए औसत है आउटपुट डेटा तालिका में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक translocating एफए का उदाहरण । (क) एक vinculin अशक्त VinTS A50I उत्परिवर्ती संवेदक व्यक्त MEF स्पष्टता के लिए औंधा रंग तालिका के साथ, स्वीकारकर्ता चैनल में visualized है । स्केल बार = 30 µm । ब्लैक में उल्लिखित एफए को ब्लीचिंग के लिए चयनित किया गया । ज़ूम-इन छवियों के साथ समय पर एफए प्रगति दिखाने के लाल रूपरेखा का संकेत है जहां सॉफ्टवेयर एफए की पहचान की । स्केल बार = 2 µm. (B) में डेटा से परिणामी सामान्यीकृत frap है वक्र (A) । वहां एक लगभग 5% के बाद तीव्रता में छलांग है 3 एफए translocating से जल्दी सॉफ्टवेयर के लिए पर्याप्त वसूली एफए स्थान में परिवर्तन का पता लगाने के लिए जिसके परिणामस्वरूप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि झल्लाहट-frap है परिणाम । (क) Vinculin अशक्त MEFs VinTS व्यक्त पूरे सेल (स्केल बार = 30 µm) के औसत झल्लाहट दक्षता छवियों के रूप में प्रदर्शित के साथ ज़ूम-उल्टे स्वीकारकर्ता चैनल छवियों frap है वसूली प्रगति दिखा (स्केल बार = 2 µm). (ख) frap है वसूली के आधे समय ३२ कोशिकाओं के लिए झल्लाहट क्षमता के खिलाफ साजिश रची, (क) में कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व अंक के साथ लाल रंग में प्रकाश डाला । (ग) frap है मोबाइल अंश (ख) में एक ही कोशिकाओं के लिए झल्लाहट क्षमता के खिलाफ साजिश रची । (घ) Vinculin अशक्त MEFs VinTS A50I उत्परिवर्ती सेंसर व्यक्त पूरे सेल की औसत झल्लाहट दक्षता छवियों के रूप में प्रदर्शित (स्केल बार = 30 µm) के साथ ज़ूम-उल्टे स्वीकारकर्ता चैनल छवियों frap है वसूली प्रगति दिखा रहा है (स्केल बार = 2 µm). (ङ) frap है वसूली के आधे समय 21 कोशिकाओं के लिए झल्लाहट दक्षता के खिलाफ साजिश रची, (डी) में कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व अंक के साथ लाल रंग में प्रकाश डाला । (च) frap है मोबाइल अंश (ई) में एक ही कोशिकाओं के लिए झल्लाहट क्षमता के खिलाफ साजिश रची । डेटा मूलतः Rothenberg एट अल में प्रकाशित किया गया । ३७ और यहां एक नए स्वरूप में कल्पना कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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झल्लाहट-frap है विधि बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता, एक संपत्ति है कि सीधे रहने वाले कोशिकाओं के अंदर जांच करने के लिए मुश्किल हो गया है की प्रत्यक्ष माप के लिए अनुमति देता है । प्रोटीन गतिशीलता आणविक लोड करने के लिए की संवेदनशीलता एक शक्ति ट्रांसमीटर या transducer के रूप में है प्रोटीन समारोह के लिए महत्वपूर्ण है । लोडिंग दोनों आंतरिक रूप से उत्पंन और बाह्य लागू बलों के संचरण के लिए आवश्यक है, mechanotransmission कहा जाता है, और जैव रासायनिक-जासूसी संकेतों में उन बलों के रूपांतरण के लिए, mechanotransduction कहा जाता है । हालांकि, लोड में परिवर्तन अवधि एक प्रोटीन बाध्य रहता है, इस प्रकार प्रभावित कर सकते हैं, कम समय एक प्रोटीन लोड असर खर्च करता है, कम मौका बल अंय प्रोटीन या transduced को एक जैव रासायनिक-पता लगाने के संकेत में फैलता है और महसूस किया है । झल्लाहट-frap है विधि एक व्यापक सेलुलर संदर्भ के भीतर पहुँचा जा करने के लिए बल के संवेदनशील गतिशीलता के आणविक पैमाने पर माप की अनुमति देकर आणविक और सेलुलर स्तर के बीच की खाई को पाटने. इसके अलावा, यह इन माप के लिए अनुमति देता है, जबकि intracellular या extracellular वातावरण या तो जैव रासायनिक या यांत्रिक perturbing लिया जाएगा । इस तकनीक को किसी भी झल्लाहट आधारित तनाव संवेदक, सेलुलर संरचनाओं और extracellular संदर्भों की एक किस्म में प्रोटीन यांत्रिक राज्य की जांच के लिए अनुमति देने के लिए लागू किया जाना चाहिए ।

सुनिश्चित करना है कि वांछित झल्लाहट-frap है माप इमेजिंग मापदंडों के अनुकूलन और डेटा विश्लेषण और व्याख्या प्रदर्शन शामिल प्राप्त कर रहे है में महत्वपूर्ण कदम । इमेजिंग मापदंडों के अनुकूलन के रूप में प्रोटोकॉल के भीतर वर्णित है, के लिए नमूना धूप सीमा आवश्यक है, जबकि वांछित संरचनाओं और गतिशीलता के लिए अनुमति देने के लिए विशिष्ट और झल्लाहट की गणना के लिए पर्याप्त संकेत शक्ति के लिए । एक विशेष सेल लाइन और ब्याज के प्रोटीन के लिए इन इमेजिंग मापदंडों की स्थापना पर जल्दी अलग प्रयोगात्मक समूहों के बीच प्रत्यक्ष तुलना की सुविधा होगी । यह ध्यान देने योग्य है कि इस तरह के हित के प्रोटीन या अवरोधों का परिचय बदलने के रूप में प्रणाली के लिए परिवर्तन, प्रोटीन स्थानीयकरण में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते है (जिससे संकेत तीव्रता फेरबदल) और गतिशीलता । अनुकूलित मापदंडों सभी प्रयोगात्मक स्थितियों में स्पष्ट, सटीक माप सक्षम होना चाहिए । इसलिए, यह पैरामीटर है कि उपयोगी होने के चरम अंत में नहीं है चुनने के लिए सिफारिश की है, उदाहरण के लिए, बमुश्किल शोर से संकेत भेद करने में सक्षम किया जा रहा ।

जबकि इस प्रोटोकॉल में इमेजिंग एक epifluorescence माइक्रोस्कोप और संलग्न frap है लेजर मॉड्यूल के लिए वर्णित किया गया था, झल्लाहट-frap है अन्य इमेजिंग प्रणालियों के लिए लागू है. उदाहरण के लिए, इस तकनीक लाइन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है-स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कताई डिस्क फोकल सूक्ष्मदर्शी एक संलग्न photobleaching मॉड्यूल के साथ । इमेजिंग सेटिंग्स धूप या अत्यधिक photobleaching कारण के बिना पर्याप्त संकेत करने के लिए शोर को प्राप्त करने के लिए एक अनुरूप फैशन में अनुकूलित किया जाना चाहिए । विशेष रूप से झल्लाहट इमेजिंग के विषय में, उच्च क्वांटम दक्षता डिटेक्टरों fluorophore क्षति उत्प्रेरण के बिना सफल झल्लाहट गणना के लिए पर्याप्त संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । वहां अलग झल्लाहट या frap है एक फोकल माइक्रोस्कोप६७,६८,६९, जो झल्लाहट के लिए अनुकूलन गाइड frap है इमेजिंग इस्तेमाल किया जा सकता है का उपयोग इमेजिंग का वर्णन के एक नंबर रहे हैं ।

प्रयोग के बाद, डेटा विश्लेषण ध्यान से व्यवहार किया जाना चाहिए और एक reproducible में प्रदर्शन, अधिमानतः स्वचालित, तरीके से । ब्लीच करने से पहले एक ही कक्ष में 2-3 से अधिक सेलुलर क्षेत्रों में असमर्थता के कारण प्रोटीन के उपलब्ध पूल के बहुत ज्यादा है, इस तकनीक का प्रवाह अपेक्षाकृत सीमित है । इस प्रकार, डेटा सेट अक्सर इमेजिंग के कई दिनों में संयुक्त कर रहे हैं, डेटा के अनुरूप उपचार की आवश्यकता होती है । दोनों झल्लाहट और frap है डेटा विश्लेषण के साथ चुनौतियों का प्रस्ताव । झल्लाहट सूचकांक और झल्लाहट क्षमता माप प्रोटीन लोड की एक ठहराव के लिए अनुमति देते हैं । झल्लाहट सूचकांक एक रिश्तेदार उपाय है कि सूक्ष्मदर्शी सेटिंग्स पर अत्यधिक निर्भर है, जबकि झल्लाहट क्षमता माप निरपेक्ष और माइक्रोस्कोप सेटिंग्स५५,७०के स्वतंत्र हैं । हम हाल ही में दिखाया गया है कि एक पहले से विकसित विधि "तीन घन इमेजिंग" का उपयोग करने के लिए संवेदनशील उत्सर्जन है कि आम तौर पर झल्लाहट सूचकांक के साथ quantified कर रहे है की माप से झल्लाहट दक्षता निर्धारित किया जा सकता है जब झल्लाहट का प्रयोग आधारित तनाव सेंसर५६ . झल्लाहट दक्षता की माप की आवश्यकता है अगर तनाव सेंसरों द्वारा निरपेक्ष बलों के अनुभव की माप के लिए कर रहे हैं गणना३४. झल्लाहट एक्सप्रेस-आधारित तनाव सेंसर, उच्च मार्ग संख्या पर विशेष रूप से स्थिर कोशिकाओं, recombine या सेंसर नीचा कर सकते हैं, अनुपयोगी झल्लाहट डेटा५०के लिए अग्रणी. यह आसानी से पहचाना जाता है जब दाता की गणना-झल्लाहट क्षमता३७,५६ की गणना के दौरान स्वीकार अनुपात लेकिन झल्लाहट का उपयोग कर सूचकांक का पता लगाने के लिए कठिन हो सकता है । जब एक झल्लाहट आधारित तनाव संवेदक के साथ शुरू, यह एक बड़े डेटा सेट प्राप्त करने के लिए सहायक हो सकता है (> 50 कक्षों) केवल झल्लाहट डेटा के हित के निर्माण के लिए की उंमीद की सीमा की पहचान करने के लिए क्षमता झल्लाहट । साथ ही, frap है डेटा बहुत मोबाइल, जैसे कि तेज़ी से फिसलने या कोडांतरण है कि तीव्र संरचनाओं से निकालने के लिए कठिन हो सकता है । संरचनाओं के एक उपजनसंख्या का चयन या सेल चढ़ाना शर्तों को अनुकूलित करने के लिए इस प्रभाव को कम करने में मदद कर सकते है इस मुद्दे ।

अवधारणा में, झल्लाहट-frap है किसी भी सेलुलर क्षेत्र में किसी भी झल्लाहट आधारित संवेदक के लिए लागू किया जा सकता है, उचित अनुकूलन के साथ । व्यवहार में, यह पर्याप्त यांत्रिक लोड के तहत नहीं कर रहे हैं कि प्रोटीन के बल-संवेदी गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए मुश्किल हो सकता है या कि कुछ सेकंड के बहुत ही कम टाइमस्केल पर या मिनट के दसियों के लंबे टाइमस्केल पर वसूली के आधे समय है. एकल अणु अध्ययन से परिणाम प्रोटीन है कि रहने वाले कोशिकाओं के भीतर बल के प्रति संवेदनशील गतिशीलता प्रदर्शित कर सकते है करने के लिए बात कर सकते हैं । इस प्रकार अब तक, यह कई एफए और अज प्रोटीन13,14,15,16 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ cytoskeletal तत्वों७१,७२,७३शामिल हैं । अनायास, झल्लाहट आधारित सेंसर इन प्रोटीन४६के कई के लिए डिजाइन किया गया है । इन परिणामों के हित के एक प्रोटीन के चयन मार्गदर्शन कर सकते हैं; हालांकि, यह उंमीद नहीं की जानी चाहिए कि झल्लाहट frap है डेटा बिल्कुल इन एकल अणु अध्ययन से परिणाम दर्पण होगा । वास्तव में, जैव रासायनिक विनियमन, अंय प्रोटीन के साथ बातचीत, और स्थानीय cytoskeletal संरचना अस्पष्ट हो सकता है, या बदल, प्रोटीन पर बलों के प्रभाव-प्रोटीन बातचीत । इन जटिलताओं का निरीक्षण करने की क्षमता झल्लाहट-frap है दृष्टिकोण की एक अनूठी ताकत है ।

कोशिका और ब्याज के प्रोटीन के लिए जोड़तोड़ का एक संयोजन प्रोटीन गतिशीलता को विनियमित करने में महत्वपूर्ण कारकों स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, यह एक सेंसर है कि बल-असंवेदनशील है, या तो हटाने या एक बल-बाध्यकारी डोमेन३५,७४ के उत्परिवर्तन के माध्यम से के रूप में वहां के बल पर प्रोटीन कारोबार की गतिशीलता की निर्भरता नहीं होना चाहिए सहायक हो सकता है रिपोर्ट संवेदक । इसके अतिरिक्त, अंय महत्वपूर्ण बाध्यकारी साइटों या प्रोटीन में फास्फारिलीकरण साइटों के उत्परिवर्तनों कैसे ब्याज की प्रोटीन विनियमित किया जा रहा है की एक और पूरी तस्वीर प्रदान कर सकते हैं । सेल या पर्यावरण cytoskeletal अवरोधकों के माध्यम से या सब्सट्रेट गुण (उदा. extracellular मैट्रिक्स या कठोरता) बदलकर, क्रमशः, मदद कर सकते हैं कि कैसे करने के लिए प्रोटीन की सेना के प्रति संवेदनशील गतिशीलता का जवाब बदलने के माध्यम से वैश्विक परिवर्तन कर यांत्रिक perturbations. प्रोटीन लोड और बल के साथ-साथ संवेदनशील गतिशीलता प्रोटीन के अन्य भौतिक गुणों के बारे में जानकारी का मेल करने के लिए ब्याज की प्रोटीन की यांत्रिक राज्य स्थापित करने में मदद कर सकते हैं । इस स्थानीयकरण और एक उपसेलुलर संरचना७५,७६के भीतर प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत शामिल कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, प्रोटीन अलग अनुरूप राज्यों में रहते हैं, यहां तक कि एक ही सेलुलर संरचना के भीतर,७६,७७संदर्भ के आधार पर सकता है । प्रोटीन लोड, गतिशीलता, स्थानीयकरण, और अनुरूप सभी एक साथ आंतरिक रूप से जनित और बाह्य लागू बलों द्वारा प्रभावित किया जा सकता है३७,७६,७८,७९, हुक्म एक बल संचरण और mechanotransduction में प्रोटीन की भूमिका । झल्लाहट-frap है विधि और प्रोटीन और जोड़तोड़ की एक किस्म के साथ अपनी क्षमता संगतता के बहुमुखी प्रतिभा थोक यांत्रिकी, प्रोटीन गतिशीलता, और mechanosensitive संकेतन के बीच बातचीत के elucidation सक्षम होना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार (NSF-CMMI-14-54257) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (16GRNT30930019) और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R01GM121739-01) डॉ Brenton हॉफमैन और एक राष्ट्रीय को संमानित किया से अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया साइंस फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप Katheryn Rothenberg को सम्मानित किया । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि NSF या NIH के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72

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References

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फ्लोरोसेंट तकनीक का एक संयोजन का उपयोग कर कोशिकाओं के रहने में बल के प्रति संवेदनशील प्रोटीन गतिशीलता का मापन
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Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).More

Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).

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