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Bioengineering

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

Published: November 02, 2018
doi:
10.3791/58619
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

ここでは、プロトコルを提案フェルスター共鳴の同時使用のため力感受性の測定を有効にするタンパク質ダイナミクスを測定するため退色後蛋白質負荷と蛍光の回復を測定するエネルギー転送ベースのテンション センサー細胞内蛋白質の原動力。

Abstract

細胞感覚し、機械的刺激をメカノトランスダクションと呼ばれるプロセスで生化学的に検出可能な信号に変換することによって、環境内の物理的な手がかりに対応します。メカノトランスダクションの重要なステップは、外部と内部の環境の間の力の伝達です。強制的に送信する、一連の蛋白質蛋白質の相互作用によって作成された持続的な切れ目のない物理的なリンケージがあります。特定の蛋白質蛋白質の相互作用の機械的負荷いずれかがない場合の相互作用に及ぼす影響、相互作用の高速化解除につながる、あるいは安定の相互作用。どのように分子の負荷についての生きている細胞の蛋白質の転換は順番メカノトランスダクションにおけるその役割の解明蛋白質の力学状態に関する貴重な情報を提供できるが決まります。力感受性タンパク質ダイナミクスを測定するための既存の技術か蛋白質負荷の直接測定を欠いている、携帯電話のコンテキストの外部で実行する測定に依存します。ここでは、生きた細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定を可能にする (フレット FRAP) フォトブリーチング法後蛍光共鳴エネルギー伝達蛍光回復のためのプロトコルについて述べる。この手法は、潜在的力感受性タンパク質ダイナミクス細胞レベル下の構造の様々 な異なる種類の細胞の研究を促進する任意のフレット ベース張力センサーに適用されます。

Introduction

細胞外の環境は、細胞のふるまいを指示する生化学的および物理的な手がかりの豊富なソースです。特に、微小環境の物理的性質はキーの細胞などの細胞の増殖、移行、および分化1,2,3,4を仲介することができます。制御の仕組みの不全、癌5、アテローム性動脈硬化の6、および線維症7などの適切な治療をしていない多くの病気に重要なコンポーネントです。細胞が物理的な刺激を生化学的に検出可能な信号に変換する方法を完全に理解、プロセス メカノトランスダクションと呼ばれる、力の伝達、細胞の内外の両方に関わる分子メカニズムの解明が必要ですし、複数細胞内構造体。

細胞レベル下の構造の中タンパク質は常に裏返し;バインドとバインドのパートナー8との相互作用の強さに基づいてバインド解除。物理的な距離間で正常に送信される力の蛋白質蛋白質の相互作用、タンパク質の代謝回転が維持し、そのバインディング パートナー9に力を伝達できるほど低速である必要があることを意味の切れ目のない連鎖があります。相互作用はしばしば異なる条件10,の下で非連結状態に移行できるバインド済み状態として概念化蛋白質蛋白質の相互作用は一般のいくつか非共有結合性タンパク質のドメイン間をで構成、11します特定の蛋白質蛋白質の相互作用の力がなし「理想的な絆」として知られている相互作用の寿命に影響を及ぼす、「スリップの絆」として知られている相互作用の有効期限を短縮または相互作用の寿命を延ばすことが可能だ。、「キャッチ絆」10として知られています。したがって、蛋白質負荷と我々 は敏感なダイナミクスとして参照する蛋白質ダイナミクスの複雑な関係があります。

結合ダイナミクスに及ぼす荷重の解明、分子レベルで非常に有益な実験の数を行った。孤立したタンパク質やタンパク質の原子間力顕微鏡光ピンセットや磁気ピンセットなど操作技術の断片を使用して、これらの研究は関連性の高いいくつかの敏感なタンパク質間相互作用を実証しています。タンパク質11,12。両方インテグリン13とカドヘリン14、膜貫通タンパク質細胞マトリックスと細胞間の相互作用をそれぞれ形成のために重要であるロードによるダイナミクスの変化を示しています。細胞内ビンキュリンが15と α-カテニン16をタリンと両方に力依存的に募集し、アクチン17, ストレスファイバー (FAs)、アドヘレンスジャンクション (AJs ビンキュリンの重要な役割を示すキャッチ結合を形成することができます。) 負荷の下で。単一分子の研究特定タンパク質-タンパク質相互作用の分離を可能にする、彼らは細胞の環境の複雑さを考慮しない、明確な結果をもたらします。

画期的な実験実証 FAs、AJs を含む、いくつかの細胞内構造を受容が内部的に生成または外部から適用荷重18,19への応答で強化されたアセンブリを展示、 20,21,22。さらに、いくつかの理論的モデルは、力感受性タンパク質ダイナミクス23,24,25機械アセンブリを運転できることを示唆しています。生きた細胞内でこれらの敏感なダイナミクスを調べるいくつかの間接的なアプローチが取られています。縛ると関連技術は、細胞26,27,28,29タンパク質の動態を測定するため比較的単純な方法論を提供します。ただし、蛋白質負荷の測定はより制限されています。典型的なアプローチは、タンパク質の動態と全体的な細胞収縮8,30,31を減らすために使用される細胞骨格阻害剤への露出なしのセルを比較することです。概念的には、これは高負荷と低負荷の状態の比較です。ただし、いずれかの状態で蛋白質間で負荷の定量化がないと阻害剤, F-アクチン フィラメントに沿ってキー結合部位のような損失の生化学的な効果を意図しない可能性があります。別のアプローチは、FAs に固有は、分子の負荷を概算し、FA32内の単一蛋白質の動態との関係を調べる牽引力顕微鏡を用いた FA による基板上の合計の力運動を測定してきました。このアプローチは、合計の力の定量化により、分子固有の情報は提供されません。FAs はロード33を耐えることができる多くの以上の 200 の異なるタンパク質から成っています。したがって、可能性のある FA の力の合計出力の測定力伝送経路の複数の可能性が不明瞭、特定のタンパク質では負荷の測定を確実に提供されません。

フレット ベース張力センサーの出現により直接、メカノバイオロジーで従来のアプローチとは異なり細胞34,35,36生活の中の特定のタンパク質によって発生する負荷の測定。タンパク質ダイナミクスの FRAP ベース メジャーとフレット ベース張力検出器を組み合わせたプロトコルを紹介します。我々 はフレット FRAP としてこの技法を参照してください。この方法は、蛋白質負荷と細胞 (図 1) の力感受性タンパク質ダイナミクスの評価をこのように蛋白質の原動力の同時測定できます。既に、フレット FRAP テクニックは機械的リンカー蛋白質ビンキュリン37の敏感なダイナミクスの研究に適用されています。張力検出器は、様々 な細胞内構造に関連している多数の蛋白質のために開発されています。たとえば、センサーはビンキュリン タリンと34 38,39 FAs、カドヘリンと AJs40,41,42, 複雑な核のバイオスで nesprin でカテニン発現で開発されています。43α-アクチニン44フィラミン36骨格と、糖衣45、他の中の MUC 146。同様に、FRAP は一般的に使用される手法は、焦点接着斑8,31、単接合47、アクチン皮質26、および核48内の機械受容蛋白質で使用されています。今後は、これらの既存のセンサーまたは新しくフレット FRAP 技術はいずれかに広く適用する必要がありますさまざまな細胞レベル下の構造およびコンテキストの敏感な現象の測定を可能にするセンサーを開発しました。この終わりに向かってフレット FRAP 手法適用これらの異なるシステムでの実装の詳細、一般化されたプロトコルを提供します。うまくいけば、これはさまざまな力の伝達を調節する、細胞の挙動を媒介に様々 な機械受容タンパク質の機能解明の実験になります。

Protocol

1. イメージングのためのサンプルを生成します。 目的のセル型で安定高速張力センサー構造です。 PRRL ベクトルまたは他のウイルスの発現プラスミドに張力センサー構造を複製します。注: いくつかの異なる分子クローニング ツール、拡張子とギブソン アセンブリ35重複制限酵素の使用を含むこのステップを達成するために利用できます。PRRL ベクトル遺伝…

Representative Results

フレット FRAP は、2 つの蛍光技術の組み合わせから成っている、フレットと縛る。我々 は蛋白質負荷の影響に焦点を当てて、フレット ベース張力センサー34,46を使用しました。これらのセンサーはセンシング モジュール mTFP1 と flagelliform リンカー (図 1 a) によって接続されている VenusA206K などの 2 つ?…

Discussion

フレット FRAP メソッドを力感受性タンパク質ダイナミクス、生きた細胞の内部を直接調べることは困難されているプロパティの直接計測できます。分子の負荷をタンパク質ダイナミクスの感度力送信機またはトランスデューサーとして蛋白質の機能に不可欠です。読み込みが内部的に生成された両方の伝送に必要なして生化学的検出信号にそれらの力の変換、メカノトランスダクションと呼?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、アメリカ心臓協会 (16GRNT30930019)、国立衛生研究所 (R01GM121739-01) ブレントン ホフマン博士と国民に授与されるからの補助金だけでなく、国立科学財団のキャリア賞 (NSF-CMMI-14-54257) によって支えられました。科学財団大学院研究奨学金キャサリン ・ ローゼンバーグに授与します。内容は著者の責任と NSF や NIH の公式見解を必ずしも表さない。

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72
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Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).
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