여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.
셀 감지 하 고 mechanotransduction를 호출 하는 과정에서 화학적 감지 신호에 기계적 자극을 변환 하 여 그들의 환경에서 실제 신호에 응답. Mechanotransduction에 중요 한 단계는 외부와 내부 환경 사이 힘의 전송 이다. 전송 세력, 지속적인된 끊어지지 물리적 결합 단백질-단백질 상호 작용의 일련에 의해 생성 되어야 합니다. 주어진된 단백질-단백질 상호 작용에 대 한 기계적 부하 중 상호 작용에 아무런 영향을 가질 수 있습니다, 그리고 상호 작용의 더 빠른 분열에 또는 안정화 상호 작용. 살아있는 세포에 있는 단백질 회전율 차례로 elucidating mechanotransduction에서의 역할, 단백질의 기계적 상태에 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다 지시 어떻게 분자 부하를 이해 한다. 힘에 민감한 단백질 역학을 측정 하기 위한 기존의 기술 단백질 부하의 직접 측정을 부족 하거나 세포 컨텍스트 외부에서 수행 하는 측정에 의존 합니다. 여기, 우리는 photobleaching (무서 워 졸라) 기술, 살아있는 세포 내에서 힘에 민감한 단백질 역학의 측정을 가능 하 게 후 포스터 공명 에너지 전송 형광 복구에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 잠재적으로 다양 한 subcellular 구조와 다른 세포 유형 힘에 민감한 단백질 역학의 연구를 촉진 어떤 긴장 무서 워 기반 센서에 적용 됩니다.
세포 외 셀 동작을 지정 하는 생 화 학적 및 물리적 단서의 풍부한 원천입니다. 특히,는 microenvironment의 물리적 특성 키 세포 기능, 세포 성장, 감 별 법1,2,3,4, 마이그레이션, 등 중재 수 있습니다. microenvironment의 역학의 Dysregulation 아직 없는 암5, 아 테 롬6, 섬유 증7등 적절 한 치료는 많은 질병에 중요 한 구성 요소입니다. 세포 화학적 감지 신호에 물리적 자극을 변환 하는 방법의 완벽 한 이해, 프로세스 mechanotransduction 되 나, 필요 힘 전송, 모두에 세포에서 중재 하는 분자 메커니즘의 해명 및 내 여러 subcellular 구조.
Subcellular 구조, 내부 단백질은 지속적으로 선회; 바인딩 고 강도 바인딩 파트너8와 그들의 상호 작용에 따라 바인딩. 물리적 거리에 걸쳐 성공적으로 전송 될 세력 단백질 단백질 상호 작용, 단백질의 매출 유지 하 고 그것의 바인딩 파트너9힘을 전송 하는 속도가 느린 해야 의미의 파손 되지 않는 사슬 해야 합니다. 상호 작용 다른 조건10, 에서 언바운드 상태로 전환 수 바인딩된 상태로 종종 개념 동안 단백질 단백질 상호 작용은 일반적으로의 여러 비-공유 결합 사이 단백질 도메인 구성, 11. 주어진된 단백질-단백질 상호 작용을 위해 힘 “이상적인 본드” 라고 하는 상호 작용의 수명에 영향을, “슬립 본드” 라고 하는 상호 작용의 수명을 감소 또는 상호 작용의 수명을 늘릴 수는 가능 하다 “캐치 본드”10로 알려진. 따라서, 단백질 로드와 힘 민감한 역학 지칭 단백질 역동성 사이 복잡 한 관계가 이다.
채권 역학에 부하의 영향을 이해, 향해 매우 유익한 실험의 수 단일 분자 수준에서 수행 되었습니다. 고립 된 단백질, 또는 단백질 및 조작 기술이 자기 핀셋, 광학 핀셋, 원자 힘 현미경 검사 법의 파편을 사용 하 여,이 학문은 설명 했다 힘에 민감한 단백질 단백질 상호 작용에 관련 단백질11,12. 두 integrins13 및 cadherins14이 막 횡단 단백질 형성 세포-매트릭스와 세포 세포 상호 작용, 각각에 대 한 중요 한, 역학 때문에 변경 로드 설명 했다. 셀 내에, vinculin 힘 종속 방식에서 모두 중부15 와 α-catenin16 보충 하 고 말라17, 초점 유착 (FAs)와 외화 접합 (AJs에서 vinculin에 대 한 중요 한 역할을 나타내는 캐치 유대를 형성 수 있습니다. ) 부하. 단일 분자 연구 특정 단백질-단백질 상호 작용의 격리에 대 한 허용 하 고 모호 하지 않은 결과, 하지만 그들은 세포 환경의 복잡성에 대 한 계정을 하지 않습니다.
획기적인 실험 시연 AJs, FAs 등 여러 subcellular 구조, mechanosensitive, 고 전시 내부적으로 생성 또는 외부 적용 부하18,19에 향상 된 어셈블리 20,,2122. 또한, 몇 가지 이론적 모델 mechanosensitive 어셈블리 힘에 민감한 단백질 역동성23,,2425에 의해 구동 될 수 있는 제안 했다. 살아있는 세포 내에서 이러한 힘 민감한 역학 검사, 몇 가지 간접 접근 촬영 되었습니다. FRAP 및 관련된 기술 셀26,27,,2829단백질 역학을 측정 하기 위한 비교적 간단한 방법론을 제공 합니다. 그러나, 단백질 부하의 측정 더 제한 되었습니다. 일반적인 방법은 셀 전체 세포 수축8,,3031을 줄이기 위해 사용 cytoskeletal 억제제에 노출 없이 단백질 역동성을 비교할 것입니다. 개념적으로, 이것은 높은 부하와 낮은 부하 상태 사이의 비교입니다. 그러나, 거기 아무 정량화 부하의 단백질에서 어느 상태에 이며 억제제, F 걸 필 라 멘 트에 따라 키 바인딩 사이트의 손실 등의 의도 하지 않은 생 화 확 적인 효과 있을 수 있습니다. 또 다른 방법은, FAs, 관련 FA 견인 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 분자 부하 대략적인 FA32내 단일 단백질의 역학 관계를 조사 하 여 기판에 총 힘 노력을 측정 하고있다. 총 힘의 부 량이 접근이 방식을 사용 하면, 그것은 분자로 특정 정보를 제공 하지 않습니다. FAs는 많은 부하33을 견딜 수 있는 200 개 이상의 서로 다른 단백질의 구성 되어 있습니다. 따라서, 잠재적으로 FA의 총 힘 출력을 측정 여러 힘 전송 경로 가능성을 가린다 고 안정적으로 부하의 측정을 특정 단백질에 제공 하지 않습니다.
Mechanobiology에 이전 접근, 달리 무서 워 기반 긴장 센서의 출현 수 직접 생활 안에 특정 단백질에 의해 발생 하는 부하의 측정 셀34,,3536. 여기, 선물이 FRAP 기반 측정 단백질 역동성의 긴장 초조해 기반 센서를 결합 하는 프로토콜. 우리 졸라 무서 워 서이 기술을 참조 하십시오. 이 방법은 단백질 부하 및 살아있는 세포 (그림 1)의 힘에 민감한 단백질 역학 평가 되므로 단백질 역동성의 동시 측정을 수 있습니다. 이미, 무서 워 졸라 기술 기계 링커 단백질 vinculin37의 힘-민감한 역학의 연구에 적용 되었습니다. 장력 센서 다양 한 subcellular 구조에에서 관련 된 수많은 단백질을 위해 개발 되었습니다. 예를 들어 센서 vinculin34 와 중부38,39 FAs, cadherins 및 AJs40,,4142, 복잡 한 핵 링컨에서 nesprin에에서 catenins에 개발 되었습니다. 43, α-actinin44 , filamin36 , 골격 및 MUC-1는 glycocalyx45, 다른 사람 사이에46. 마찬가지로, FRAP 초점 유착8,31, 외화 접속점47, 말라 피26, 및 핵48mechanosensitive 단백질에 일반적으로 사용 되는 기술 사용 되었습니다입니다. 이러한 기존의 센서 또는 새로 무서 워 졸라 기술에 광범위 하 게 적용 해야 앞으로, 이동 센서, 다양 한 subcellular 구조 및 상황에에서 힘 민감한 역학의 측정에 대 한 수 있도록 개발. 이 끝, 무서 워 졸라 기술 적용이 다른 시스템에 구현 하기 위한 상세한, 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다. 바라 건 대,이 다양 한 실험 elucidating 다양 한 mechanosensitive 단백질 힘 전송 규제 및 셀 행동 중재의 역할을 수 있게 된다.
무서 워 졸라 메서드 힘에 민감한 단백질 역동성, 살아있는 세포 내부 직접 조사 하기 어려운 속성의 직접 측정 하기 위한 수 있습니다. 분자 중에 단백질 역동성의 감도 힘 송신기 또는 변환기로 단백질의 기능에 중대 하다. 로드는 내부적으로 생성 된 둘 다의 전송에 대 한 필요 그리고 외부에서 적용 된 힘, mechanotransmission, 라는 화학적 감지 신호로 그 세력의 변환에 대 한 mechanotransduction 라는. 그…
The authors have nothing to disclose.
이 작품에서 미국 심장 협회 (16GRNT30930019) 및 건강의 국가 학회 (R01GM121739-01) 박사 Brenton 호프만 국민에 게 수 여 교부 금 뿐만 아니라 국립 과학 재단 경력 포상 (NSF-CMMI-14-54257)에 의해 지원 되었다 과학 재단 대학원 연구 장학금 Katheryn 다니는에 수 여. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 NSF 나 NIH의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25300062 | |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
60x Objective NA1.35 | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Automated Stage | Prior Scientific | H117EIX3 | |
Custom Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp | T450/514rpc | |
Custom mTFP1 Emission Filter | Chroma Technology Corp | ET485/20m | |
Custom mTFP1 Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET450/30x | |
Custom Venus Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET514/10x | |
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium | Sapphire | MC102 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D5796 | with L-glutamine and sodium bicarbonate |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | |
Fibronectin, Human | Corning | 47743-654 | |
FRAPPA Calibration Slide | Andor | provided along with FRAPPA unit | |
FRAPPA System with 515 nm Laser | Andor | ||
Glass-bottomed Fluoro Dishes | World Precision Instruments | FD35 | |
HEK293-T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hexadimethrine Bromide, Polybrene | Sigma Aldrich | H9268-5G | |
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D6429 | |
Inverted Fluorescent Microscope | Olympus | IX83 | |
JMP Pro Software | SAS | ||
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels | Sutter Instruments | LB10-NW | |
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb | Sutter Instruments | LS/OF30 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
MATLAB Software | Mathworks | ||
MEM Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher | 11140050 | |
MetaMorph for Olympus | Olympus | ||
Micro-Humidification System | Bioptechs | 130708 | |
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
Objective Heater Medium | Bioptechs | 150819-13 | |
OptiMEM | Thermo Fisher | 31985070 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
pMD2.G Envelope Plasmid | Addgene | 12259 | |
pRRL Vector | gift from Dr. Kam Leong (Columbia University) | ||
psPax2 Packaging Plasmid | Addgene | 12260 | |
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004505 | |
Stable Z Stage Warmer | Bioptechs | 403-1926 | |
Venus Emission Filter | Semrock | FF01-571/72 |