Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de ressonância Förster, sensores de tensão baseados na transferência de energia para medir proteína carga e fluorescência recuperação após fotobranqueamento para medir a dinâmica da proteína, permitindo a medição de força-sensível dinâmica da proteína dentro de células vivas.

Abstract

Células detetam e respondem às pistas físicas em seu ambiente, convertendo estímulos mecânicos em sinais bioquimicamente detectável em um processo chamado mechanotransduction. Um passo crucial no mechanotransduction é a transmissão de forças entre os ambientes internos e externos. Para transmitir forças, deve haver um enlace físico sustentado e contínuo, criado por uma série de interações da proteína-proteína. Para uma interação da proteína-proteína dada, carga mecânica ou não pode ter nenhum efeito sobre a interação, levar a uma dissociação mais rápida da interação, ou mesmo estabiliza a interação. Compreensão molecular como carga dita rotatividade de proteína em pilhas vivas pode fornecer informações valiosas sobre o estado mecânico de uma proteína, por sua vez, elucidar seu papel na mechanotransduction. Técnicas existentes para medição dinâmica força-sensível da proteína ou faltam de medições directas da carga de proteína ou dependem as medições realizadas fora do contexto celular. Aqui, descrevemos um protocolo para a recuperação de fluorescência-transferência de energia de ressonância de Förster depois fotobranqueamento (FRET-FRAP) técnica, que permite a medição da dinâmica de força-sensível da proteína dentro de células vivas. Esta técnica é potencialmente aplicável a qualquer sensor de tensão baseado no traste, facilitando o estudo da dinâmica de proteínas sensíveis à força em uma variedade de estruturas subcelulares e em diferentes tipos de células.

Introduction

O ambiente extracelular é uma rica fonte de sinais bioquímicos e físicos que ditar o comportamento da célula. Em particular, a natureza física do microambiente pode mediar principais funções celulares, incluindo o crescimento celular, migração e diferenciação^1,2,3,4. Desregulação da mecânica do microambiente é um componente crítico para muitas doenças que ainda não dispõem de tratamentos adequados, tais como câncer⁵, aterosclerose⁶e fibrose⁷. Uma compreensão completa de como as células convertem a estímulos físicos em sinais bioquimicamente detectável, um processo denominado mechanotransduction, requer a elucidação dos mecanismos moleculares mediando a transmissão de força, tanto dentro e fora das células e dentro de várias estruturas subcelulares.

Dentro de estruturas subcelulares, proteínas estão constantemente ligados; vinculação e desvinculação baseado na força de suas interações com parceiros⁸de vinculação. Para as forças ser transmitida com sucesso através de uma distância física, devem haver uma cadeia ininterrupta de interações proteína-proteína, significa que o volume de negócios de uma proteína deve ser lenta o suficiente para sustentar e transmitir a força de sua vinculação parceiro⁹. Enquanto as interações da proteína-proteína geralmente consistem de vários não-covalentes entre os domínios da proteína, a interação é muitas vezes conceituada como um estado ligado que pode a transição para um estado desacoplado sob diferentes condições^{10, 11}. para uma interação da proteína-proteína dada, é possível que a força pode ter n efeito sobre o tempo de vida da interação, conhecido como um vínculo”ideal”, reduzir o tempo de vida da interação, conhecido como uma “ligação de deslizamento” ou aumentar o tempo de vida da interação , conhecido como um “laço de captura”¹⁰. Assim, há uma intrincada relação entre carga de proteína e proteína dinâmica, que nos referimos como sensíveis à força dinâmica.

Para compreender o efeito da carga sobre a dinâmica do vínculo, uma série de experimentos altamente informativos foram realizada no nível único-molécula. Usando proteínas isoladas, ou fragmentos de proteínas e de técnicas de manipulação como uma pinça magnética, pinça óptica e microscopia de força atômica, estes estudos têm demonstrado as interações da proteína-proteína de força-sensível para vários relevantes proteínas^11,12. Ambas as integrinas¹³ caderinas e¹⁴, que são proteínas transmembrana importantes para a formação de interações célula-matriz e célula-célula, respectivamente, demonstraram alterações na dinâmica devido ao carregar. Dentro da célula, vinculina é recrutada para ambos talin¹⁵ e α-catenina¹⁶ de forma dependente da força e pode formar um vínculo de capturas com actina¹⁷, indicando um papel crucial para vinculina aderências focais (FAs) e entroncamentos adherens (AJs ) sob carga. Único-molécula estudos permitem o isolamento de interações proteína-proteína específica e produzem resultados ambíguos, mas eles não representam a complexidade do ambiente celular.

Experimentos de Marco demonstraram que várias estruturas subcelulares, incluindo FAs e AJs, são mechanosensitive e apresentam montagem reforçada em resposta às cargas geradas internamente ou externamente aplicado^{18,19, 20,21,22}. Além disso, vários modelos teóricos sugeriram que mechanosensitive montagem poderia ser movida pela força-sensível proteína dinâmica^23,24,25. Para examinar essas dinâmicas de força-sensível dentro de células vivas, foram tomadas algumas abordagens indiretas. FRAP e técnicas relacionadas fornecem uma metodologia relativamente simples para medir a dinâmica da proteína em células^26,,^27,28,29. No entanto, a medição da carga de proteína tem sido mais limitada. Uma abordagem típica é comparar a dinâmica da proteína nas células com e sem a exposição a um inibidor do citoesqueleto, usado para reduzir o total celular contratilidade^8,30,31. Conceitualmente, esta é uma comparação entre uma carga alta e baixa carga de estado. No entanto, há não há quantificação da carga em toda a proteína em nenhum dos Estados, e pode haver efeitos bioquímicos não intencionais do inibidor, tal a perda dos sítios de ligação chave ao longo de um filamento de F-Actina. Uma outra abordagem, específica para FAs, tem sido para medir a força total de esforço sobre o substrato pela FA usando microscopia de força de tração para aproximar a carga molecular e examinar a relação com a dinâmica de uma única proteína dentro da FA³². Enquanto essa abordagem permite a quantificação da força total, ele não fornece informação molecular específica. FAs são constituídos por mais de 200 diferentes proteínas, muitas das quais podem suportar carga³³. Assim, medindo a força total de saída de um FA potencialmente obscurece a possibilidade de vários caminhos de transmissão de força e não confiável fornece uma medida da carga em uma proteína específica.

Ao contrário de abordagens anteriores em mechanobiology, o advento dos sensores de tensão baseado em FRET permite direto^34,35,36células de medição de cargas vivida por proteínas específicas dentro da vida. Aqui, apresentamos um protocolo que combina sensores de tensão baseado em FRET com medida FRAP-baseado da dinâmica da proteína. Nos referimos a esta técnica como FRET-FRAP. Esta abordagem permite a medição simultânea de carga de proteína e proteína dinâmica, permitindo assim a avaliação da dinâmica força-sensível proteína em células vivas (Figura 1). Já, a FRET-FRAP técnica foi aplicada para o estudo da dinâmica da mecânica vinculador proteína vinculina³⁷força-sensível. Sensores de tensão foram desenvolvidos por inúmeras proteínas que são relevantes em uma variedade de estruturas subcelulares. Por exemplo, os sensores foram desenvolvidos para vinculina³⁴ e talin^38,39 no FAs, as caderinas e catenins em AJs^40,41,42, nesprin no LINC nuclear complexo ⁴³, α-actinin⁴⁴ e FBLIM1³⁶ no citoesqueleto e MUC-1 nos glicocálix⁴⁵, entre outros⁴⁶. Da mesma forma, FRAP é que uma técnica comumente utilizada tem sido utilizada em proteínas mechanosensitive dentro as aderências focais^8,31, aderente junções⁴⁷, actina córtex²⁶e núcleo⁴⁸. Seguindo em frente, que a técnica de FRET-FRAP deve ser amplamente aplicável a qualquer destes sensores existente ou recém desenvolvido sensores, permitindo as medições de força-sensível dinâmica em uma ampla variedade de contextos e estruturas subcelulares. Nesse sentido, nós fornecemos um protocolo detalhado, generalizado para implementar a técnica FRET-FRAP aplicável nestes sistemas diferentes. Esperemos que isto irá permitir uma grande variedade de experimentos para elucidar o papel de várias proteínas mechanosensitive na regulação da transmissão de força e na mediação do comportamento celular.

Protocol

1. gerar amostras para a imagem latente Construção de sensor tensão estàvel expressa no tipo de célula desejada. Clone construção de sensor de tensão em vetor pRRL ou outro plasmídeo de expressão viral.Nota: Várias ferramentas de clonagem moleculares diferentes estão disponíveis para realizar essa etapa, incluindo o uso de enzimas de restrição, se sobrepõem a extensão e montagem Gibson35. O vetor pRRL é usado na transdução viral lenti e permite um elevado …

Representative Results

FRET-FRAP é feito da combinação de duas técnicas fluorescentes, FRET e FRAP. Como enfocamos os efeitos da carga de proteína, usamos sensores de tensão baseado em FRET34,46. Estes sensores baseiam-se frequentemente uma tensão de sensoriamento módulo constituído por duas proteínas fluorescentes, tais como mTFP1 e VenusA206K, ligados por um vinculador flagelliform (figura 1A). Quando o módulo …

Discussion

O método FRET-FRAP permite a medida direta da dinâmica de força-sensível da proteína, uma propriedade que tem sido difícil sondar diretamente dentro de células vivas. A sensibilidade da dinâmica de proteínas de carga molecular é fundamental para a função da proteína, como uma força transmissor ou transdutor. Carregamento é necessário para a transmissão de ambos gerado internamente e forças aplicadas externamente, chamado mechanotransmission e para a conversão dessas forças em sinais detectáveis por b…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25300062
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
60x Objective NA1.35	Olympus	UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Gibco	15240-062
Automated Stage	Prior Scientific	H117EIX3
Custom Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp		T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter	Chroma Technology Corp		ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium	Sapphire	MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D5796	with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30396.03
Fibronectin, Human	Corning	47743-654
FRAPPA Calibration Slide	Andor		provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser	Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes	World Precision Instruments	FD35
HEK293-T Cells	ATCC	CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene	Sigma Aldrich	H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D6429
Inverted Fluorescent Microscope	Olympus	IX83
JMP Pro Software	SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels	Sutter Instruments	LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb	Sutter Instruments	LS/OF30
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
MATLAB Software	Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids	Thermo Fisher	11140050
MetaMorph for Olympus	Olympus
Micro-Humidification System	Bioptechs	130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Objective Heater Medium	Bioptechs	150819-13
OptiMEM	Thermo Fisher	31985070
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
pMD2.G Envelope Plasmid	Addgene	12259
pRRL Vector			gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid	Addgene	12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge	Thermo Fisher	75004505
Stable Z Stage Warmer	Bioptechs	403-1926
Venus Emission Filter	Semrock	FF01-571/72