JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Published: November 02, 2018
doi:
10.3791/58619
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Abstract

Hücreleri hissediyorum ve mekanik uyaranlara mechanotransduction denen bir süreç biyokimyasal olarak algılanabilir sinyallere dönüştürerek kendi ortamlarında fiziksel ipuçları yanıtlar. Mechanotransduction çok önemli bir adım güçleri iç ve dış ortamlar arasında iletimi yapılır. İletmeye zorlar, protein-protein etkileşimlerinin bir dizi tarafından oluşturulan sürekli, kesintisiz bir fiziksel bağlantı olması gerekir. Verilen protein-protein etkileşimi için mekanik yük ya da etkileşim üzerinde bir etkisi olabilir, etkileşimin daha hızlı ayırma için kurşun ya da etkileşim stabilize etmek. Nasıl moleküler yük anlama protein devir oranı canlı hücreler, buna karşılık mechanotransduction rolü elucidating bir protein, mekanik durumu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir belirler. Kuvvet duyarlı protein dynamics ölçmek için varolan teknikleri protein yük doğrudan ölçümleri eksikliği veya hücresel bağlam dışında gerçekleştirilen ölçümlere kullanmaz. Burada, biz kuvvet duyarlı protein dynamics canlı hücreler içinde ölçüm sağlar photobleaching (FRET sıkı bağlamak) tekniği sonra Förster rezonans enerji transferi-floresan kurtarma için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu teknik potansiyel olarak herhangi bir gerginlik FRET tabanlı sensörü, kuvvet duyarlı protein dynamics hücre altı yapıları çeşitli ve farklı hücre tipleri çalışma kolaylaştırmak için geçerlidir.

Introduction

Hücre dışı ortam hücre davranış dikte fiziksel ve biyokimyasal cues zengin bir kaynağıdır. Özellikle, microenvironment fiziksel yapısı anahtar hücresel işlevler, hücre büyümesi, geçiş ve farklılaşma1,2,3,4de dahil olmak üzere arabuluculuk. Bozukluk microenvironment mekaniğinin henüz yeterli tedavi, kanser5, ateroskleroz6ve fibrozis7gibi var mı birçok hastalık için önemli bir bileşenidir. Nasıl fiziksel uyaranlara biyokimyasal olarak algılanabilir sinyalleri hücreleri dönüştürme tam bir anlayış, bir süreç mechanotransduction olarak adlandırdığı, aydınlatma güç iletim, içine ve hücrelere arabuluculuk moleküler mekanizmaları gerektirir ve birden çok hücre altı yapıları içinde.

Hücre altı yapıları içinde proteinler sürekli dönüm; bağlama ve ortakları8binding ile ilişkileri gücüne dayalı kesmeden. Başarılı bir şekilde fiziksel bir mesafe iletilebilmesi için güçlerini için protein-protein etkileşimleri, protein ciro sürdürmek ve onun bağlama ortak9güç iletimi yeterince yavaş olmalıdır anlam zinciri olmalı. Protein-protein etkileşimler genellikle, birkaç sigara-Kovalent bağlar protein etki alanları arasında oluşur iken, etkileşim kez farklı koşullarda10, altında ilişkisiz bir duruma geçiş yapabileceğini ilişkili bir devlet olarak kavramsallaştırma 11. verilen protein-protein etkileşimi için kuvvet etkisi üzerinde bir “ideal bond” olarak bilinen etkileşim, ömrünü, ömür boyu bir “slip bond” olarak bilinen etkileşimin azaltmak ya da etkileşim ömrünü artırmak Hayır olabilir mümkündür , bir “catch bond”10da bilinir. Böylece, protein yük ve biz kuvvet duyarlı dynamics bakın protein dinamikleri arasında karmaşık bir ilişki vardır.

Yük etkisi bond dynamics anlayış doğru son derece bilgilendirici deneyler bir dizi tek molekül düzeyde gerçekleştirilmiş. İzole protein veya proteinler ve manipülasyon teknikleri manyetik cımbız, Optik cımbız ve atomik kuvvet mikroskobu gibi parçaları kullanarak, bu çalışmalar için birkaç ilgili kuvvet duyarlı protein-protein etkileşimleri göstermiştir proteinler11,12. Transmembran proteinler hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri, sırasıyla şekillendirme için önemli olan her iki integrinler13 ve kaderin14, yüklemek için dinamikleri değişiklik göstermiştir. Hücre içinde vinculin her iki talin15 ve α-catenin16 için bir kuvvet bağlı şekilde oluşturulmuştur ve aktin17vinculin fokal yapışıklıklar (FAs) ve adherens kavşaklar (AJs için çok önemli bir rol gösteren, bir catch Bono oluşabilir ) yük altında. Tek molekül çalışmaları belirli protein-protein etkileşimleri yalıtım için izin ve kesin sonuçlar, ama onlar hücresel ortamı karmaşıklığı için hesap yapmak.

Landmark deneyler FAs ve AJs, dahil olmak üzere birkaç hücre altı yapıları mechanosensitive vardır ve dahili olarak oluşturulan veya dışarıdan uygulanan yük18,19yanıt olarak geliştirilmiş derleme sergi gösterdi, 20,21,22. Ayrıca, çeşitli teorik modeller mechanosensitive derleme kuvvet duyarlı protein dynamics23,24,25tarafından tahrik tavsiye ettiler. Bu kuvvet duyarlı dinamikler canlı hücreler içinde incelemek için birkaç dolaylı yaklaşımlar atılmıştır. Sıkı bağlamak ve ilgili teknikleri protein dynamics hücreleri26,27,28,29ölçmek için nispeten basit bir yöntem sağlar. Ancak, protein yük ölçümü daha sınırlı olmuştur. Protein dynamics ve genel hücre contractility8,30,31azaltmak için kullanılan bir hücre iskeleti inhibitörü maruz olmayan hücrelerdeki karşılaştırmak için tipik bir yaklaşımdır. Kavramsal olarak, bu yüksek yük ve düşük yük durumu arasında bir fark var. Ancak, her iki devlet arasında protein hiçbir miktar yük yoktur ve engelleyici, böyle bir F-aktin Filaman boyunca anahtar bağlayıcı siteleri kaybı istenmeyen biyokimyasal etkileri olabilir. Başka bir yaklaşım, FAs için belirli toplam kuvvet efor moleküler yük yaklaşık ve SK32içinde tek bir protein dinamikleri ile ilişkiyi incelemek için çekiş kuvveti mikroskopisi kullanılarak FA tarafından substrat olarak ölçmek için olmuştur. Bu yaklaşım toplam kuvvet miktar için izin verirken, tatlı bilgi sağlamaz. FAs birçoğu yük33ayı 200’den fazla farklı proteinlerin oluşur. Böylece, bir SK toplam güç çıkışını potansiyel olarak ölçüm birden çok güç iletim yolları olasılığı gizler ve güvenilir bir şekilde yük ölçüsü belirli bir protein sağlamaz.

Mechanobiology önceki yaklaşımlar, FRET tabanlı gerilim sensörler gelişiyle doğrudan sağlar ölçüm spesifik proteinlerin yaşam içinde yaşadığı yük hücreleri34,35,36. Burada, FRET tabanlı gerilim sensörler protein dynamics sıkı bağlamak tabanlı ölçü ile birleştiren bir iletişim kuralı mevcut. Biz bu teknik için FRET sıkı bağlamak bakın. Bu yaklaşım protein yük ve protein dinamikleri, böylece canlı hücreler (Şekil 1) kuvvet-duyarlı protein dinamiklerini değerlendirmesini sağlayan eşzamanlı ölçüm sağlar. Zaten, mekanik bağlayıcı protein vinculin37kuvvet duyarlı dinamikleri çalışma odasına perde sıkı bağlamak tekniği uygulanmıştır. Gerginlik sensörler hücre altı yapıları çeşitli ilgili çok sayıda proteinler için geliştirilmiştir. Örneğin, sensörler vinculin34 ve talin38,FAs, kaderin ve catenins AJs40,41,42, nesprin nükleer LINC karmaşık içinde39 için geliştirilmiştir. 43, α-Aktinin44 ve filamin36 sitoiskeleti ve MUC-1 glycocalyx45, diğerleri arasında ‘46. Benzer şekilde, yaygın olarak kullanılan bir teknik mechanosensitive proteinler odak yapışıklıklar8,31, adherens kavşaklar47, aktin korteks26ve çekirdek48içinde üzerinde kullanılan sıkı bağlamak ‘s. Varolan bu sensörler veya yeni perde sıkı bağlamak tekniği için geniş uygulanabilir olmalıdır ilerlemeye sensörler, kuvvet duyarlı dynamics hücre altı yapıları ve bağlamlarda geniş çeşitli ölçümler için izin geliştirdi. Bu amaçla doğru biz perde sıkı bağlamak tekniği bu farklı sistemlerde geçerli uygulama için ayrıntılı, genelleştirilmiş bir protokol sağlar. Umarım, bu çok çeşitli rolleri çeşitli mechanosensitive protein güç iletim düzenleyen ve hücre davranış arabuluculuk elucidating deneyler sağlayacaktır.

Protocol

1. görüntüleme için örnekleri oluşturmak İstediğiniz hücreye stabil hızlı gerilim sensör yapısı. Gerilim Algılayıcısı yapı clone pRRL vektör ya da diğer viral ifade plazmid.Not: Birkaç farklı moleküler klonlama aracı enzimleri kullanımı da dahil olmak üzere bu adımı ulaşmak, uzantı ve Gibson derleme35örtüşme hazırdır. PRRL vektör lenti viral iletim kullanılır ve insan sitomegalovirüs (CMV) düzenleyici kullanılarak protein üretiminin…

Representative Results

ÜZÜLMEK, FRET-sıkı bağlamak iki floresan teknik kombinasyonu yapılır ve sıkı bağlamak. Biz protein yük etkileri üzerinde duruldu gibi biz perde tabanlı gerilim sensörler34,46kullanılır. Bu sensörler sık sık mTFP1 ve VenusA206K, bir flagelliform bağlayıcı (Şekil 1A) tarafından bağlı gibi iki floresan protein içeren modülü algılama bir gerginlik temel alır. Modül baş ve …

Discussion

Kuvvet duyarlı protein dinamikleri, doğrudan canlı hücreler içinde soruşturma zor olan bir özelliği doğrudan ölçümü için FRET sıkı bağlamak yöntemi sağlar. Protein dynamics moleküler yük duyarlılığını bir kuvvet verici veya dönüştürücü olarak protein’ın çalışması için önemlidir. Yükleme hem de dahili olarak oluşturulan iletimi için gereklidir ve dışarıdan uygulanan kuvvetler, mechanotransmission aradı ve biyokimyasal olarak algılanabilir sinyalleri bu kuvvetlere dönüştür…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser hibe Amerikan Kalp Derneği (16GRNT30930019) ve ulusal Dr Brenton Hoffman ve bir Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM121739-01) yanı sıra Ulusal Bilim Vakfı Kariyer Ödülü (NSF-CMMI-14-54257) tarafından desteklenmiştir Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu Katheryn Rothenberg için ödüllendirildi. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NSF veya NIH resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma’ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . The interactions of retroviruses and their hosts. , (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. . Generating Stable Cell Lines with Lentivirus Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016)
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique–influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches–a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

Force-sensitive Protein DynamicsFluorescent TechniquesMechanobiologyVinculinTalinCadherinsNesprinTension Sensor ConstructFibronectinFRAP LaserAcceptor FluorophoreMechanically-sensitive ProteinsCell-cell InteractionsCell-environment InteractionsMolecular ScaleLiving Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image