Summary
우리는 봄에는에 셀 무료 유전자 식 실험을 수행 하기 위해 사용 될 수 있는 표면에 유전자 길이 DNA 분자의 동원 정지에 대 한 간단한 석판 절차를 설명 합니다.
Abstract
있고 구조화 된 표면에 유전자의 동원 정지에 오픈 미세 생물 반응 기 시스템에서 식 프로세스를 compartmentalized 유전자의 연구 수 있습니다. 인공 세포 시스템으로 다른 접근, 달리 등 설치 유전자 표현 시 약 및 동시 배출 폐기물의 지속적인 공급에 대 한 수 있습니다. 이 동적 유전자 규정 피드백 시스템의 실현을 위한 중요 한 시간의 연장된 기간 동안 셀 무료 유전자 식 프로세스의 구현을 지원 합니다. 여기 우리 기술을 사용 하 여는 사용 하기 간단 석판 DNA 가닥 변위 반응에 따라 독점적으로 상업적으로 사용 가능한 구성 요소를 사용 하 여 유전 봄에는 제작에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리 또한 제공 하는 프로토콜 compartmentalized 유전자의 통합에입니다 (PDMS)-미세 시스템을 기반으로. 또한, 우리는 시스템 DNA와 식 믹스에 포함 된 분자 사이 분자 상호 작용의 직접적인 관측을 위해 사용 될 수 있는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경과 호환 되는지 보여줍니다.
Introduction
세포-유전자 발현 반응 생화학, 생명 공학, 및 합성 생물학에 다양 한 응용 프로그램에 대 한 큰 관심은 무료. 단백질 세포 자유로운 표현의 구조 생물학에서 수많은 연구를 위한 기초를 했다 순수 단백질 견본의 준비를 위한 수단이 되었다. 예를 들어, 셀-무료 시스템 성공적으로 어려운 셀 기반으로 식을 사용 하 여 생산 하는 단백질 단지1 또는 막 단백질2의 식에 사용 되었다. 특히, 셀-무료 유전자 발현 반응 했다 또한 19613Nirenberg 그리고 Matthaei에 의해 획기적인 실험과 함께 시작 하는 유전 코드의 구조를 명료 하 게 하는 데 사용 됩니다.
최근, 생명 공학 및 합성 생물학4,,56셀 자유로운 방법에 관심을 갱신된 되었습니다. 셀-무료 시스템 비 생물학 화합물, 증강 될 수 및 다양 한 생물학 근원의 부품을 보다 쉽게 결합 될 수 있다7. 비록 셀 무료 시스템 명백한 단점은 "성장 하 고 분할" 하지 않습니다, 그것은 오픈 셀 무료 bioreactors 기본적인 신진 대사 기능을 준비 하 고 합성 대사 간단한 탄소 및 에너지 제공 하는 때 그들을 입력8. 합성 생물학의 신흥 분야, 내 셀 무료 시스템 예측 "섀시" 구현 위한 합성 생물학 기능 되도록 약속 드립니다.
현재, 셀-무료 유전자 식 반응 중 하나를 사용 하 여 수행 됩니다 (다른 소스에서 박테리아, 효 모, 곤충 등), 셀 추출 또는 다른 응용 프로그램 (예를 들어, 최적화 된 전사/번역 시스템 간결한 대 진 핵 유전자 식, 막 단백질 등의 생산). 세균성 세포 추출 물 (일반적으로 TXTL에 게 불리는)의 준비에 대 한 인기 있는 프로토콜 V. Noireaux와 동료9에의해 최근 제공 했다. 생물 속성 철저 하 게 특징이10, 그리고 TXTL 시스템은 이미 성공적으로 사용 되어 일련의 복잡 한 생 화 확 적인 작업을 수행 하기 위해: 예를 들어, 을 통해 기능 살 균 소의 어셈블리 셀-무료 식 살 균 소 게놈11, 세균성 단백질 필 라 멘 트12, 합성 또는 셀 무료 유전자 회로13,14의 구현입니다.
셀-무료 합성 생물학에서 인기 있는 또 다른 시스템은 정화 부품15,16에서 재구성 순수한 시스템. TXTL 시스템에 비해, 그것은 포함 하지 않는다 nucleases 또는 단백질 저하 기계. 동안 선형 DNA의 저하, RNA 분자 또는 단백질은 문제점의 더 적은 순수한 시스템에서 충 경로 실제로 동적 기능 구현에 대 한 중요 한. (RecBCD)를 통해 TXTL 시스템에서 선형 유전자 템플릿의 exonuclease 저하의 영향을 줄이기 위해 최종 보호 GamS 단백질을 추가할 수 있다. TXTL와 순수 시스템 모두 상업적으로 사용할 수 있습니다.
주제를 밀접 하 게 관련 셀 무료 생물학 문제에 생 화 확 적인 반응에 구획의 효과 및 추가 인공 세포와 같은 구조 또는 protocells17,18,19의 창조의 연구 ,20. 인공 세포에 대 한 연구는 일반적으로 내부 기공을 구획 인지질 또는 다른 amphiphiles에서 만든 생 화 확 적인 반응 시스템의 캡슐화를 포함 한다. 동안 이러한 시스템 구획의 근본적인 측면 또는 cellularity 각자 복제의 출현을 탐구 하는 데 도움이, 그들은 폐쇄 시스템의 일반적인 문제를 직면 하는 것: 작동 물질 대사 및 적절 한 부재에 막 전송 메커니즘, 그것은 한정된 반응 시간의 연장된 기간에 대 한 실행을 계속 하기 어려운-연료 분자 사용 되 고 폐기물 축적.
이러한 셀을 흉내 낸 구획 내부 구획에 흥미 있는 대안 photolithographic 방법을 사용 하 여 유전 물질의 공간 조직 이다. "칩에 유전자"의 동원 정지 바이 츠만 연구소에 바-Ziv 그룹으로 10 여 년 전 개척 했다21. 주요 문제를 확인할 수 있도록 했다 중 DNA의 일반적인 흡착 및 칩 표면에 단백질의 잠재적인 변성 했다. 바-Ziv 외. "데이지", immobilization 이산화 규소 표면에 저항 분자의 긴 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 스페이서 보장에 대 한 반응성 터미널 실 란의 구성 되었다 불리는 전용된 사진 평판 저항 개발 생체 적합성, 그리고 방사선 자외선 (UV) 빛에 따라 반응 아민으로 개조 되었다 photocleavable headgroup. 그것은 데이지 유전자 길이 DNA 분자 (몇 킬로 기본적인 쌍 (kbp)의 길이)와 칩 표면에 고정 하는 데 사용 될 수 표시 되었습니다. 고분자 물리학의 관점에서 시스템 고체 기판에 융합 하는 고분자 브러쉬 표시. DNA의 전해질 특성상 이러한 브러시의 구조는 삼 투 및 기타 이온 특정 효과22,23강력 하 게 영향을.
가장 중요 한 것은, 그것은 기판 움직일 유전자 여전히 작동 하 고 베낀 고로 번역 해 RNA와 단백질 수 표시 되었습니다. 유전자 브러쉬 솔루션24에서 RNA polymerases 액세스할 수 있습니다 그리고 녹음/번역의 복잡 한 고분자 혼합물은 표면에 변성 되지. 기판에 유전 구성의 동원 정지의 장점 중 하나는 그들은 작은 선구자 분자와 어떤 폐기물 제거25 수에서 지속적으로 제공 하는 열린 미세 반응 기 시스템에서 동작할 수 있습니다. , 26.
우리는 최근 변종 (생체 전자 빔 및 감광 제)에 대 한 Bephore27, 상업적으로 사용 가능한 구성 요소에 독점적으로 근거 했다 하 고 시퀀스 특정 DNA 가닥 침공에 대 한 반응을 활용 되 나이 방법의 개발 칩 기반 인공 세포의 생성에 대 한 간단한 구현 다단계 리소 그래피 절차의 실현. 절차의 개요 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그것은 DNA 머리 핀 분자 photocleavable 그룹을 포함 하는 생체 못 레이어에 움직일을 기반으로 합니다. Photocleavage는 머리 핀의 어떤 DNA를 통해 ("전치" 표시 시퀀스를 포함 하는)의 분자 발 중재 가닥 침략에 연결 된 를 통해 수 단일 가닥 발 시퀀스를 제공 합니다.
데이지의 매우 조밀 하 고 깨끗 한 수 Bephore 잠재적으로 간단 하 게 구현 하는, "유전자 브러쉬", 특정 응용 프로그램에서 장점을. 그러나 원칙적으로,, 데이지와 Bephore 석판 수 쉽게 결합. DNA를 구성 하기 위한 DNA 가닥 변위 골드 브러쉬 활용 관련된 리소 그래피 방법 이전 황 외.에 의해 개발 되었다 하지만 하지 셀 무료 유전자 식28,29의 문맥에서 이용 되었다.
다음 프로토콜 Bephore 메서드를 사용 하 여 셀 무료 유전자 발현에 대 한 브러쉬 DNA의 생산에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 우리는 유전자 칩 조작 방법과 칩에 유전자의 공간 구조적된 동원 정지에 대 한 다단계 포토 리소 그래피의 사용을 설명 합니다. 우리는 또한 반응 챔버의 제조 및 마이크로 칩에 유전자 식 반응의 성능에 대 한 응용 프로그램 토론.
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Protocol
참고: 다른 섹션에서 단계에 대 한 시간 일정 보충 정보 (제 1)에서 주어진 다.
1. 칩 제조
참고: 기판, 실리콘이 산화물 또는 유리 슬라이드 (24 mm x 24 mm, no. 1.5; 22 m m x 50 m m, 제 4 호)의 50 nm 두꺼운 층으로 사용 하 여 실리콘 웨이퍼 (100 m m 직경, 0.525 m m 두께)로. 응용 프로그램에 따라 다른 크기와 두께 더 적합 한 수 있습니다.
- 기판 통해 는 RCA 청소 절차를 청소 (물, 암모니아 솔루션 NH3(aq) 30%와 30% 과산화 수소 H2O2 비율 5:1:1)
- 유리 비이 커에에서 물과 암모니아 솔루션을 혼합 하 고 혼합 교 반 하면서 뜨거운 접시에 70 ° C에가 열.
- 과산화 수소와 기판 추가 합니다. 더 높은 처리량에 대 한 소계 (PTFE) 보유자에 여러 기판 (특히 작은 유리 슬라이드)를 배치 합니다.
- 30 분 후 꺼내 기판, 철저 하 게 세척 병에서 물으로 린스와 질소 총 건조. 기판의 PEGylation 즉시 진행.
주의: 피부와 눈 보호를 착용 하 고 증기 두건에서 작동. 할 닫지 폐기물 컨테이너 단단히 혼합물에서 가스 방출에 대 한 허용 하기 위하여.
- 기판의 PEGylation
참고: 반복 중지 및 재개 Biotin-말뚝-Silane의 공기 수 분의 응축으로 인해 silane의 반응성을 감소 시킨다. 따라서, 적절 한 양의 Biotin-말뚝-실 란 5 mL 튜브 준비 (예: 10-20 밀리 그램) 건조 아르곤 사용까지 그들을 동결 하기 전에 그들을 채울.- Vortexing (5 mg/mL)에 의해 건조 톨루엔에 Biotin-말뚝-Silane을 디졸브.
- 증기 두건에서 (120 cm 직경, 높이 2cm) 유리 페 트리 접시에 기질을 놓습니다.
- 플라스틱 표면 전체를 덮고 기판에 솔루션 (단일 유리 커버 슬립에 대 한 ≈200 µ L, 대형 실리콘 웨이퍼에 대 한 몇 mL) 하지만 기판의 가장자리를 통해 흐르는 하는 솔루션을 피하십시오.
- 페 트리 접시를 닫습니다. 기판의 건조를 줄이기 위해, 젖은 종이 타월로 추가 커버를 추가 합니다.
- 30 분 후 이소프로필 알콜의 약 40 ml를 추가 기판 밖으로, 이소프로필 알콜으로 다시 그것을 철저 하 게 씻어 그리고 질소 총 건조 (유리 슬라이드에 대 한 기억 PEGylated 쪽). 어둠 속에서 사용까지 기판을 저장 합니다.
주의: 피부와 눈 보호를 착용 하 고 증기 두건에서 작동.
2입니다. 동원 정지에 대 한 유전자의 준비
참고: 뇌관 시퀀스, DNA 수정과 모범적인 PCR 프로토콜 보충 정보 (섹션 2-4)에 부여 됩니다.
- 수정 된 프라이 머를 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 관심사의 유전자를 증폭 하는. 한 뇌관 운반 fluorophore 시각화를 위한 형광 현미경 검사 법, 그리고 다른 뇌관은 구분 표시 순서에서 triethylene 글리콜 스페이서 PCR 통해 단일 가닥 표시 순서를 유지 하기 위하여.
- 스핀 열 정화 키트를 사용 하 여 DNA를 정화 하 고 흡수 광도 계를 사용 하 여 그것의 농도 측정. 농도 100 보다 훨씬 낮은 해서는 안 nM.
- 집중된 5 M NaCl 솔루션을 사용 하 여 1 m NaCl의 농도 조정 합니다. 높은 소금 농도 DNA 브러쉬 어셈블리 프로세스22를 촉진 한다.
3입니다. 사진 평판
참고: photocleavable DNA (PC)만 노란 빛 환경에서에서 처리 되어야 합니다. Cleanrooms 노란색 호 기존의 흰 빛 램프의 빛을 필터링을 사용할 수 있습니다.
- 기판의 준비
- Bephore-혼합 (1 µ M streptavidin, 1.5 µ M PC DNA, 7.5 µ M PH DNA 1 x PBS (인산 염 버퍼 염 분)에) 준비 및 패 시 베이 션 믹스 (10 µ M 1 x PBS에 DIS DNA, 1 mg/mL BSA (소 혈 청 알 부), 레이블 없음). 모두 몇 주 동안 냉장고에서 어둠 속에 저장할 수 있습니다.
- 유리 커터를 사용 하 여 또는 메스와 가장자리에 눌러 크리스탈 라인 실리콘 웨이퍼를 끊어서 기판 (몇 cm2) 작은 조각으로 잘라. 간단한 정렬 표시로 서 유리 커터를 사용 하 여 기판의 가장자리 쪽으로 센터에서 짧은 스크래치를 만듭니다. 불어 작은 입자에서 질소 총 칩.
- 2 구성 요소 실리콘 접착제, 예: 피 펫 팁, 감동 두 방울을 혼합 하 고 칩, 스크래치의 팁 주변을 비워 (그림 2A)의 표면에 접착제를 적용. 접착제는 세척 단계를 용이 하 게 하 고 외피에 필요한 DNA의 양을 줄여 소수 성 장벽을 제공 합니다. 나중 단계에서 접착제 수 수 쉽게 벗 겨.
- 10 µ L을 품 어 (또는 칩을 충당 하기 위해 필요한 만큼) 칩에 상 온 (RT) Bephore-믹스의. 외피, 동안 장소 예: 피 펫 팁 상자 상자에서 칩은 부분적으로 증발을 줄이기 위해 물으로 가득 합니다.
- 1 h, 칩 세척 후 제거 1 x PBS와 pipetting으로 여러 (5 x 50 µ L) 번 Bephore-믹스 언바운드.
- 칩 건조 하지 않고 가능한 많은 버퍼를 이륙 하 고 실시간에 칩에 패 시 베이 션 믹스의 10 µ L을 품 어
- 2 시간 후 씻어 칩와 언바운드 패 시 베이 션 에이전트를 제거 하려면 1 x PBS에 pipetting으로 몇 (10 x 50 µ L) 시간.
- 투영 리소 그래피
참고: 리소 그래피를 위한 물 침수 목표 x 60 똑바로 현미경 사용할 수 있습니다. 조명 시간 목적, 광원, 마스크에 따라, 기판 (실리콘 칩 또는 유리 슬라이드) 및 원하는 DNA 표면 밀도. 60 x 목표와 함께 일반적인 노출 시간 겹치는 영역 2 단계 리소 그래피에 대 일 분까지 원거리 (15 실리콘 칩, 45에 대 한 s s 유리 슬라이드에 대 한) 전체 노출에 대 한 2-3 분. 때문에 자외선 차단에 기판 위에 (융합 된 석 영)를 제외 하 고 커버 슬립을 사용 하지 마십시오.- 인쇄 포토 마스크를 잘라 (모범적인 리소 그래피 마스크와 보조 섹션 5 보조 파일 참조) 적합 한 마스크 홀더에 맞게 적절 한 크기로 필드 정지 (그림 2B)의 위치에 삽입할 수 있습니다. 정확한 다단계 리소 그래피에 대 한 정렬 표시 소유자와 마스크를 맞춥니다.
- 현미경 슬라이드에 기질을 놓고 현미경 단계로 이동 합니다. Bephore 유리 슬라이드의 패턴에 대 한 현미경 슬라이드와 리소 그래피에 대 한 어두운 배경 수 있도록 Bephore 슬라이드 사이의 검은 호 일 (예: 예비 포 일에서 인쇄 포토)를 삽입 합니다.
- 조명 경로, 기판 표면에 초점에 빨간색 필터를 삽입 하 고 노출 될 기판의 지역 예: 스크래치의 끝 지역 이동 합니다.
- 마스크 홀더, 조명 차단 넣고 UV 필터 (그림 2C)로 변경 합니다. 낮은 광도에 셔터 열고 카메라를 사용 하 여 기판에 마스크를 신속 하 게 초점.
- 카메라 빛 경로 차단 하 고 원하는 노출 시간에 대 한 높은 빛의 강도에 기판 조명.
- 현미경에서 샘플을가지고 고 조심 스럽게 제거 많은 버퍼 가능한 기판에서 그것을 건조 하지 않고.
- 표시 순서를 가진 DNA의 10-20 µ L를 추가 합니다. 장소는 젖은 상자에 기판 건조에서 그것을 유지. 2 h (micromolar 집중에 oligonucleotides) 또는 실시간에 몇 시간/하룻밤 (약 100 nM 농도에서 kbp 긴 DNA) 기판에 DNA를 품 어
- 칩에서 DNA를 제거 하 고 1 x PBS로 여러 번 씻. (특히에 대 한 긴 조각) DNA의 낭비를 줄이기 위해 기판에서 가져온 DNA를 저장 하 고 다시 사용 합니다.
- 여러 단계 리소 그래피
참고: 단일 영역에 두 개 이상의 노출의 정확한 정렬, 각도 오차를 피하기 위해 무대에서 샘플을 유지. 칩 건조 하지 않고 다는 것을 확인 하십시오. 드라이브에 전동된 스테이지를 사용 하 여 지정 된 지역에 여러 DNA 브러시는 기판에 여러 지역에서의 위치에 대 한 적절 한 정렬 표시 기판 사용할 수도 있습니다.- 첫 번째 노출 (3.2 단원), 후 기판에 표시 순서 DNA를 품 어. 첫 번째 노출에서 유래 하는 모든 바인딩 사이트 점유 된다 중요 하다. 따라서, oligonucleotides (10 µ M) 약 3 h 실시간에 품 어
- 표시 표시 유전자를 무력화 하 몇 시간 동안 그들을 기판에 배치 또는 RT에서 하룻밤 다음 세척 샘플 하 고 실시간 진행에 다음 노출을 추가 하는 또 다른 2 시간을 위한 패 시 베이 션 믹스.
- 추가 노출에 대 한 이전 단계를 반복 (3.2.3-3.3.2).
4. PDMS 장치
참고: 선호, 클린 룸에서 작동 합니다. 맥도날드 외 에 의해 설명 같은 PDMS 장치 제조 표준 프로토콜을 다음과 30
- 사진 평판을 통해 마스터 금형의 제작
- 쥡니다 아세톤 높은 전력에서 5 분에 의해 실리콘 웨이퍼 (76.2 m m 직경, 525 µ m 두께)을 청소 하 고 이소프로필 알콜와 드 이온된 물으로 린스. 나중에 15 분 동안 150 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다.
- 필요에 따라 개선 하기 위해 웨이퍼에 레지스트의 접착, 2-3 mL 접착 촉진제를 추가 하 고 2 분 동안 120 ° C를 웨이퍼 30 미 열에 대 한 3000 rpm에 회전 키를 누릅니다.
- 2-3 mL 포토 레지스트에 대 한 추가 ( 재료의 표참조). 15에 대 한 웨이퍼를 회전 s 500 rpm에서 다음 30 3000 rpm에서 s. 이 인해 20 µ m 두꺼운 층의 감광 한다. 감광 레이어를 10 분 동안 실내 온도에 휴식을 보자.
- 사전 노출 빵에 대 한 다음 5 분 동안 85 ° C에서 2 분 동안 50 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다.
- 구획의 청사진 포토 마스크에서 웨이퍼를 놓습니다. 가급적, 마스크 동기 기를 사용 하 여. 포토 마스크는 64000 dpi의 해상도 있어야 (리소 그래피 마스크와 보조 섹션 5 보조 파일 참조).
- 포토 마스크를 통해 자외선 (난-5-10 mW/cm2)과 1 분 동안 웨이퍼를 노출 합니다.
- 사후 노출 빵에 대 일 분 동안 50 ° C에서 그리고 5 분 동안 85 ° C에서 웨이퍼를 놓습니다. 진정 하 고 실 온에서 1 h 동안 휴식 웨이퍼를 하자.
- 부드럽게 비 커를 교 반 하면서 3 분에 대 한 개발자와 함께 접시에 웨이퍼를 놓습니다. 이소프로필 알콜으로 웨이퍼를 헹 구 고 질소 총 건조. 45 분 동안 130 ° C에서 뜨거운 접시에 웨이퍼를 놓습니다.
- PDMS 장치 준비
- 믹스 PDMS 기지 고 PDMS 경화제 10:1 비율에 부 어 약 5 mm의 계층까지 닫힌된 컨테이너에서 웨이퍼에 웨이퍼 위에 형성 했다. 유일한 1 m m 두께의 PDMS 장치를, 대신 코트 2 분 100 rpm에서 PDMS와 웨이퍼를 회전 합니다.
- desiccator에 컨테이너를 놓고 진공 (약 85 kPa) 약 30 분에 대 한 적용 합니다. 그런 다음, 약 70 ° c 오븐에 1-2 h에 대 한 PDMS 열.
- 웨이퍼에서 PDMS 장치를 분리 합니다. 각 구획의 1 세트에 포함 되도록 석판으로 된 PDMS를 잘라. 경우는 PDMS 미세 설치에 연결 될 것입니다, 펀치 구멍 (직경 1 m m) 입구와 콘센트 공급 채널의 끝에.
- 이소프로필 알콜와 드 이온된 수 PDMS를 청소 하 고 질소 총 건조. 먼지가 PDMS를 저장 합니다.
5.로 한정된 유전자 발현
참고: 다음 절차 설명 합니다 샘플 홀더 (그림 3)의 어셈블리를 compartmentalized 유전자 발현의 관찰에 대 한 거꾸로 현미경에 케이지 인큐베이터 온도 제어와. 홀더 쉽게 사용할 수 있는 재료와 도구 (3.5-5 m m 두꺼운 폴 리 염화 비닐 (PVC) 플라스틱, 나사 및 너트, 드릴)을 사용 하 고, 현미경의 종류에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다. 5.1 및 5.2에서 설명 하는 단계는 소유자의 두 부분을 동시에 준비가 수행 되어야 한다.
- 하단 홀더 어셈블리
- 맞춤 표시 (예: 스크래치) Bephore 칩을 준비 하 고 양면 접착 테이프 (그림 3B)를 사용 하 여 칩 홀더에 접착제. 칩 그것을 다룰 것입니다 PDMS 장치 보다 더 큰 해야 합니다.
- 하나 또는 여러 개의 유전자 칩에 고정 (2 및 3 참조).
- 다음 하단 보유자의 중앙 구멍 주위 일부 진공 그리스 추가 칩 홀더를 연결 합니다.
참고: 칩 홀더 지금 준수 하단 홀더는 그리스에 의하여 다시 x y 평면에서 칩의 위치에 대 한 가능성을 유지 하면서 합니다.
- 최고 홀더 어셈블리
- 단계 4.2.1에서에서 스핀 코팅 절차를 사용 하 여 구획 얇은 PDMS 칩을 준비 합니다. 채널을 보급 하 여 낭비와 선구자 분자의 교환 수 있도록 한쪽을 열어두고 PDMS, 가능한 작게 잘라.
- 유리 커버 슬립 (24 mm x 24 mm, no. 1.5) 및 산소 플라즈마 42에 대 한 PDMS 칩 (구획 없이 쪽)의 뒷면을 청소 s (200 W와 패러데이 케이지 샘플 0.8 mbar에서 운영 하는).
- 위쪽으로 가리키는 구획 PDMS 칩 유리 슬라이드의 가운데에 배치 합니다. 70 ° c.에 1 시간에 대 한 PDMS와 유리를 구워
- 일부 진공 그리스 최고 소유자의 큰 구멍 주위를 추가 합니다.
- 실험을 시작 하기 전에 깨끗 한 유리 슬라이드와는 PDMS 칩 42 산소 플라즈마와 친수성는 PDMS를 렌더링 하는 s.
- 최고 홀더 ( 그림 3C) 위에 PDMS와 유리 슬라이드를 놓고 그리스 (그림 3C)에 유리를 조심 스럽게 누릅니다.
- 홀더 어셈블리
- 셀-무료 식 시스템의 100 µ L를 준비 하 고 얼음에 그것을 유지.
- 조심 스럽게 칩에서 버퍼를 제거 하 고 세포 무료 식 시스템의 10 µ L로 한 번 씻. 다음으로, 칩에 셀 무료 식 시스템의 60 µ L을 추가 하 고 (이미 그림 3B에서 제거 되는) 칩의 가장자리에서 두 구성 요소 실리콘 접착제를 제거.
- PDMS에 식 시스템의 20 µ L를 추가 합니다. PDMS에 물방울을 배치 후 신속 하 게 검사는 구획은 잘 젖은 입체 현미경에서 기포 없이. 공기 방울 경우 셀 무료 식 시스템의 나머지와 함께 그들을 씻어 보십시오.
- 2 조립 나사 2 개 소유자의 챔버 및 DNA 브러쉬 정렬, 입체 현미경 작동 하 고 그래서 그리퍼 팔 아래쪽 홀더를 고정 하 조각 및 wingnuts 양손으로 쉽게 액세스할 수 있습니다 (그림 3D-F ).
- 하단 보유자에 상위 홀더를 삽입 하 고 셀 무료 식 시스템 방울 퓨즈 (그림 3D) 때까지 낮은. 여부는 구획 및 정렬 마크 x y 평면에서 비슷한 지역에는 입체 현미경을 통해 확인, 그렇지 않으면 최고 보유자와 다시 위치 최고 소유자 유리 슬라이드를 올려.
- 밑에서 나사로 죈 다는 wingnuts 그들은 소유자의 하단 쪽 터치까지. 신중 하 게 구획 및 칩은 x-y-비행기 를 통해 칩 홀더 (그림 3E)의 하단에 핸들에 정렬 하는 동안, wingnuts를 조입니다. 한 번 접촉, 강화는 wingnuts 매우 부드럽게 (그림 3 층).
참고:이 단계는 몇 가지 경험을 요구 하 고 실험 설정에 따라 다릅니다. 현미경, PDMS와 유리 사이의 액체에서 발생 하는 간섭 패턴 적용 된 힘은 너무 작고, 너무 높은에서 구획 힌트의 중심에 (DNA 브러시 또는 표현된 단백질)에서 낮은 형광 강도 동안 나타낼 수 있습니다. 압력 (보충 정보, 섹션 6 참조). - 물으로 안티 증발에 스폰지를 스프레이 상자에 소유자를 삽입. 2 구성 요소 실리콘 접착제 5 mL 주사기를 봉인 상자 (그림 3G)를 사용 하 여.
- 온도 제어 현미경 상자를 전송 및 이미지 DNA 브러시 및 형광 현미경 검사 법에 반응. 조명 없이 DNA 브러시의 형광 셀 무료 식 시스템에 사라져 요. 그럼에도 불구 하 고, 브러시 같은 브러쉬에서 반복 된 유전자 발현에 의해 표시 될 수로 그것의 활동을 유지 합니다.
참고: Bephore 유리 슬라이드를 사용 하 여 실리콘 칩 대신, PDMS 및 Bephore 칩의 위치 (위/아래) 교환할 수 있습니다, 작은 작업 거리를 가진 목표의 사용에 대 한 허용.
6. 지속적인된 식 미세 장치
참고: 실험적인 체제는 그림 4A에 표시 된 부분에서 조립 된다. 온도 제어 스테이지의 어셈블리에 대 한 내용은 보충 정보 (섹션 7)에 부여 됩니다.
- 셀-무료 식 시스템 및 튜브
- 샘플 튜브 (약 200 µ L) 셀 무료 식 시스템을 준비 합니다. 형광 염료로 표시 된 폴리스 티 렌 구슬 공급 채널을 통해 유량 나중에 모니터를 추가할 수 있습니다.
- 압력 컨트롤러에 튜브를 연결 합니다. 약 12 시간 동안 차가운 유지 하는 큰 얼음 저수지에 튜브를 놓습니다. 필요한 경우에 얼음을 리필.
참고: 압력 컨트롤러 대신, 주사기 펌프 흐름 저항 변화 예: 장기적으로 도움이 될 수도 있는 기포 때문에 실험 하는 경우에 셀 무료 식 시스템의 일정 한 흐름 율을 제공. - PTFE에 셀 무료 식 시스템 들어 있는 튜브를 연결 튜브 (내부 직경 0.8 m m)가 열된 단계에 도달. PTFE 튜브 원피스 삽입을 무딘 끝 1-2 cm 조각으로 주사기 바늘 (0.9 m m의 직경)를 끊고. 그것은 나중에 PDMS에 커넥터 될 것입니다. 무대와 튜브 (그림 4C) 사이의 배관의 길이 최소화 하십시오.
- PTFE 튜브를 냉각, 얼음 물 저수지와 연동 펌프에 연결 된 더 큰 고무 튜브 주위 랩. 스카치 테이프 (그림 4C)와 함께 그들을 테이프.
- 최고 홀더 어셈블리
- 산소 플라즈마와 PDMS 칩의 편평한 측을 청소 (42 s) 피팅 입구 및 PDMS (그림 4B)의 콘센트 구멍 현미경 슬라이드 위에 놓습니다. 머리 드릴링 유리 유리에 구멍을 미리 뚫고 수 수 있습니다. 마이크로-챔버 유리 슬라이드에 직면 하지는 다는 것을 확인 하십시오.
- PDMS 소유자의 편평한 측에 양면 접착 테이프를 적용 됩니다. 접착 테이프에서 배경 형광을 피하기 위해 소유자의 두 구멍 사이 지역에서 한 조각의 검은 호 일 (예: 리소 그래피 마스크에서)를 스틱.
- 스틱 홀더에 PDMS 칩 유리 슬라이드.
- 치료는 PDMS와 연결 된 유리를 가진 PDMS 홀더 청소기 산소 플라즈마는 플라즈마에 슬라이드 (42 s).
- 진공 그리스에 가기 홀더 큰 구멍 주위를 적용 하 고 삽입 PDMS 홀더 (그림 4B). PDMS 홀더 지금 다시 x-y 방향으로 위치에 대 한 가능성을 유지 하면서 최고 홀더 준수 합니다.
- PTFE 튜브 주사기 바늘 커넥터 PDMS 칩의 입구를 연결 합니다. 상위 홀더를 통해 PDMS에 대 한 액세스를 촉진 하기 위하여 상단 플라스틱 플레이트는이 고 다음 단계에 대 한 간단히 제거할 수 있습니다.
- PTFE 주사기 바늘 커넥터 (그림 4D) 콘센트에 (약 5cm) 튜브의 두 번째 작품을 삽입 합니다.
- 그래서 그것은 모든 방향으로 이동 하 게 자유롭게 가기 홀더에서 PDMS 홀더를 배치 합니다. 장소 열띤된 무대에 느슨하게 최고 홀더는 어떤 wingnuts 강화 없이 그림 4E 에서처럼.
- 현미경, PDMS 구획의 위치를 이동 하 고 카메라의 시야에 센터. 이 시점에서 단계를 이동 하지 마십시오.
- 무대에서는 PDMS와 상위 홀더를 제거 합니다.
- 열띤된 무대와 Bephore 유리 슬라이드
- 열띤된 무대의 온도 37 ° C를 설정
- 현미경의 시야의 중심에서 약 맞춤 표시로 이중 양면된 접착 테이프를 사용 하 여 거꾸로 형광 현미경의 온도 제어 단계로 유전자 브러쉬로 Bephore 유리 슬라이드를 (4 호)를 붙입니다. 맞춤 표시의 포지셔닝이 구획은 동일한 지역에 대략 인하 될 보장 합니다.
- 유전자의 해당 형광 채널에서 이미지를 받아 고 카메라 이미지에서의 위치를 표시 합니다.
- 유전자 브러시에서 버퍼를 제거 하지만 그것을 건조 하지 마십시오. 유전자 브러시에 셀-표현의 자유 시스템의 20 µ L을 추가 하 고 실리콘 접착제 프레임을 제거 하는 핀셋을 사용.
- 미세 설정의 조립
- 셀 무료 식 시스템은 PTFE 튜빙 채워지고 PDMS 장치의 아래쪽에 나타납니다 때까지 샘플 튜브에 압력을 추가 합니다. 또한, 10 µ L는 PDMS에 마이크로 챔버에 세포 무료 식 시스템의 플라스틱. 구획은 공기 방울의 무료 다는 것을 확인 하십시오.
- 신중 하 게 낮은 유리 슬라이드에 최고 소유자와 유전자 브러시로 마이크로 챔버를 맞춥니다. PDMS와 정렬 마크 같은 초점면에 도달 하기 전에 PDMS 홀더 뒤 작은 나사를 사용 하 여 x-y-위치 및 PDMS 장치 유전자 브러쉬 (그림 4E)의 방향을 정확 하 게 맞춥니다.
- 위치 하 고 (그림 4E) 현미경 단계로 가기 홀더를 연결 하는 나사를 따라 wingnuts 강화 하 여 유리 슬라이드 위에 PDMS를 누릅니다.
- (그림 4 층) 셀 무료 식 시스템 모니터 공급 채널 (시간당 0.5 ~ 5 µ l 사이 속도 권장 흐름)을 통해 형광 구슬의 흐름을 포함 하는 튜브에 압력을 증가. 필요한 경우는 wingnuts 강화 하 여 유리에 PDMS의 압력을 증가.
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Representative Results
2 단계 리소 그래피: 그림 5 겹치는 붙일 레이블된 표시 가닥의 패턴 유리 슬라이드에는 두 단계로 석판의 결과 보여 줍니다.
형광 단백질 유전자 브러시에서의 표현: 그림 6 고정된 DNA에서 형광 단백질 YPet의 식을 보여 줍니다. 여러 지점에서 시간에 우리는 부분적으로 형광 단백질을 표백 하 고 형광 신호의 복구를 관찰 하 여 진 식 속도 평가, 단백질 식에서 발생 하지 않는 즉각적인 복구 무시. 첫 번째 표백 후 식의 2 시간에서 형광 강도 신속 하 게 복구 고 그 값 보다는 표백 하기 전에. 4 ~ 6 시간 후 형광은 신선한 식 혼합의 공급 없이 반응 약 3-4 시간 후 종료를 나타내는 그것의 이전 강도에 복구 되지 않았다.
마이크로 커플링: 유전자 발현 마이크로 통해 추가 선구자 분자와 식 구획을 제공 하 여 오랜 시간 동안 지속 될 수 있습니다. 그림 7 YPet 이상 10 h의 식 사용 같은 시스템을 보여준다.
TIRF 관찰: Bephore 단일 분자 수준에서 DNA 브러시로 붙일 레이블된 단백질의 상호 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 특히 시끄러운 환경에서에서 리소 그래피 각각 특정 및 불특정 상호 브러시 또는 표면 사이 구별 하는 데 도움이 됩니다. 그림 8 붙일 레이블된 T7 RNA 중 합 효소 바인딩 또는 DNA 브러쉬 주위 표면에 비해 우선적으로 준수와 같은 예제를 제공 합니다.
그림 1 : Bephore 사진 평판. A. 이산화 규소 (SiO2)의 표면 가진 기판 biotinylated 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG-bt), 생체 이며의는 photocleavable DNA 머리 핀을 통해 첨부 파일에 대 한 수의 층으로 덮여 있다 biotin streptavidin의 상호 PC 시퀀스 도메인 abcb * 및 photocleavable 수정 (보라색 별)를 포함 하는 여기, 물가 PH 도메인에 때 교배와 는 *. B. 자외선 (자외선) 조명 앞 PC, 솔루션에 DNA 파편 (cb *) 방출. C-디. 발 붙일 레이블된 (녹색 별)으로 PH의 변위에 대 한 PC (b) 에이즈에 결과 단일 좌초 지역 표시 가닥. E. 또한 더, 이중 가닥 DNA (이 하 "서식 파일") 장착할 수 무늬 표면에. 이러한 DNA의 5' 끝에, 뇌관 및 표시 표시 PCR 동안 단일 가닥을 유지 하는 triethylene 글리콜 공백에 의해 구분 됩니다 표시 순서를 들고 뇌관 PCR에 의해 준비 (보충 정보 참조, 섹션 2-4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 샘플 사진 평판에 대 한 준비. A. 현미경 슬라이드 또는 다른 칩 홀더 (예: 그림 3B에서 홀더)에 정렬 마크와 Bephore 칩을 배치. 2 구성 요소 실리콘 접착제 (단계 3.1.2-3) 칩의 가장자리를 따라 소수 성 장벽을 적용 됩니다. B. 마스크 홀더에 마스크를 배치 합니다. 여기, 우리는 필드 정지의 아이리스 제거 마스크는 작은 자석에 의해 열릴 수 있다 그래서 그것의 홀더를 수정. 다단계 리소 그래피 정확한 줄 맞춤 (각도), 맞춤 홀더 및 마스크 일치 (3.2.1 단계)에 표시를 확인 하십시오. C. 칩에 탐색 하 고 칩의 정렬 표시와 함께 마스크를 정렬 하려면, 빨간 필터에 슬라이드. 자외선 노출에 대 한 UV 필터 (단계 3.2.2-5)을 삽입 합니다. 그림 이전 작업27의 지원 정보에서 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Compartmentalized 유전자 발현의 관찰에 대 한 소유자의 조립. A. 는 소유자의 부분 (눈금자 단위: cm). B c. 소유자의 위쪽 및 아래쪽 부분 패턴된 Bephore 칩 (섹션 5.1)를 들고 하단 보유자와 구획 (섹션 5.2) PDMS 칩을 들고 가기 홀더 별도로 조립 됩니다. D-f. 칩 및 PDMS는 신중 하 게 가져온 꽉 접촉으로 동시에 관찰 하 고 구획 및 입체 현미경 (단계 5.3.1-6) DNA 브러쉬를 정렬 하는 동안. G. 온도 제어, 거꾸로 현미경 홀더를 전송 하기 전에 전체 시스템 안티 증발 상자 (단계 5.3.7-8)에 캡슐화 됩니다. 그림 이전 작업27의 지원 정보에서 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Compartmentalized 유전자 발현에 대 한 미세 설치 및 샘플 홀더. A. 부분의 샘플 홀더, PDMS 장치, 온도 제어 현미경 단계 및 Bephore 유리 슬라이드 (눈금자 단위: cm). B. 현미경 슬라이드 구획 PDMS를 들고 PDMS 홀더에 붙어 고 청소기 플라즈마에서 PDMS 함께 산소 플라즈마에 노출. PDMS 다음 상위 홀더 (단계 6.2.2-5)에 삽입 됩니다. C. 셀 무료 식 시스템 튜브는 압력 컨트롤러에 연결 하 고 얼음에 배치. 셀-무료 식 시스템에 대 한 튜브 (빨간색 파선은 삽입에)은 고무 (파란색 파선) 얼음 물 (6.1 단원) 연동 펌프에 의해 양수 된다를 통해 튜브에 의해 냉각 된다. 디 튜브 PDMS 장치에 있는 입구의 위치에 연결 된다. 튜브의 또 다른 조각 (단계 6.2.6-7) 콘센트에 연결 됩니다. E. 최고 홀더는 현미경 스테이지에 배치 하 고 신중 하 게 Bephore 슬라이드 쪽으로 인하. PDMS 홀더 여전히 Bephore 칩에 유전자 브러시로 PDMS에 구획에 맞게 x-y-비행기에서 이동할 수 있습니다. wingnuts Bephore 칩 위에 PDMS를 누르고 최고 보유자 현미경 단계 (단계 6.4.1-3)를 해결 하는 데 사용 됩니다. F. 셀 무료 식 시스템에는 PDMS 마이크로 채널을 통해 펌핑입니다 그리고 유전자 발현 DNA 브러쉬에서 epifluorescence 현미경 검사 법 (6.4.4 단계)에서 모니터링할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 2 단계 사진 평판. . 붙일 oligonucleotides 표시 (녹색: ATTO 532; 레드: 알 렉 사 Fluor 647)는 Bephore 유리 슬라이드를 통해 마스크 투영 리소 그래피 45 s. C. 의 노출 시간에 연속적으로 동원 했다 A와 B, 단일 노출의 정확한 맞춤을 보여주는 subfigures의 오버레이. 스케일 바: 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 유전자 발현 들 에게만. A. Bephore 유리 슬라이드에 A DNA 브러쉬 (UV 노출 시간: 2 분), YPet (섹션 5 참조 하십시오 및 그림 3) PDMS 칩에 구획 정렬 했다 형광 성 단백질에 대 한 코딩. B. 유전자 발현 DNA와 챔버에는 PDMS 장치 외부 식 혼합 챔버를 연결 하는 채널에 따라 형성 단백질 농도 기온 변화도 가진 강한 형광 신호를 얻지 못했다. 고정된 유전자 없이 제어 챔버에 상대적으로 어두운 남아 있었다. C. 형광 강도 두 약 실 전부에 대 한 시간이 지남에 프로 파일. 2 시간 마다 형광 단백질은 부분적으로 표백 (검은 화살표) 식은 여전히 활성 상태 인지 확인 하. 4 h 후 형광 식 종료 했다 나타내는 그것의 이전 강도에 복구 되지 않았다. 바 규모: 300 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 지속적인된 compartmentalized 유전자 발현. A. Bephore 유리 슬라이드에 A DNA 브러쉬 (UV 노출 시간: 2 분), 코딩을 위한 YPet 구획 PDMS 칩에 정렬 했다. 구획은 공급 채널 (흰색 화살표) 통해 셀 무료 식 시스템이 양수 (섹션 6 및 그림 4참조)에 연결 됩니다. B. 유전자 브러시를 포함 하는 구획 셀 무료 유전자 표현 시스템에 의해 (녹색)에 YPet 식에서 형광 신호를 보여준다. 유전자 브러시 없이 인접 구획 상대적으로 어두운 남아 있습니다. 셀-무료 식 시스템의 신선한 구성 요소 공급 채널을 통과 하 고 폐기물 멀리 이송 하는 동안에 구획으로 확산. C. 형광 강도 두 약 실 전부에 대 한 시간이 지남에 프로 파일. 형광 단백질 식 여전히 활성 여부를 확인 하는 시간 (검은 화살표)에 서로 다른 지점에서 부분적으로 표백 했다. 공급 채널의 흐름으로 인해 유전자 발현 이상 10 헤 (빨간색 화살표에 의해 표시 된 빨간색 추적에 피크 기인 했다 공기 방울이 일시적으로 배수는 구획에서 솔루션)에 대 한 유지 했다. 스케일 바: 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : Bephore에 대 한 단일 분자 연구 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM) 슬라이드 유리. A. 목표 형 TIRFM 수 유리-물 인터페이스에 가까운 단일 분자 이미징. 우리가 움직일 붙일 레이블된 유전자 (녹색, ATTO 532, UV 노출 시간: 2 분)는 T7 발기인 함께 있고 정의 줄무늬와 T7 RNA 중 합 효소의 행동을 관찰 (오렌지, 알 렉 사 Fluor 647와 레이블이) 표면 상호 작용. B. 형광 이미지 고정된 유전자의 2 개의 줄무늬를 보여주는. C. T7 RNA polymerases 연결 특히 및 비-구체적으로 (단일 이미지, 50 ms 노출 시간) 표면에. 디 평균 이미지 비디오 형광의 모든 프레임에서 얻은 (서브 피겨 C에서에서 처럼 5, 000 프레임) DNA 브러시로 RNA 중 합 효소의 특정 상호 작용을 제공합니다. 스케일 바: 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Bephore 리소 그래피는 DNA 또는 RNA의 꽃무늬 동원 정지에 대 한 강력 하 고 다재 다능 한 기술입니다. 그러나, 절차-변경-실패에 대 한 원천이 될 수 있습니다 몇 가지 단계를 포함 하거나 시스템의 성능 감소.
Bephore 칩의 제조에 중요 한 단계는 표면의 생체 적합성을 제공 하는 기판의 PEGylation 이다. 여기, RCA 절차와 청소 단계 중요 하다, 때문에 그것은 또한 후속 silanization에 대 한 표면 활성화. 실제 PEGylation 동안 기판 밖으로 건조 하지 해야 합니다. 또한, Silane 못 Biotin 저장 되어야 한다 제대로 그것의 반응성 (섹션 1.2)를 보존 하 고 가교를 피하기 위하여. PEGylation의 결과 평가 하기 위해 기판 붙일 레이블된 streptavidin과 인 큐베이 팅 고 비 PEGylated 컨트롤에 비해 수 수 있습니다. 성공적으로 PEGylated 기판 컨트롤 보다 상당히 더 많은 streptavidin을 바인딩 한다.
또한, 석판 과정의 나중 단계, 칩의 건조에 불리 한 효과, 예를 들어 이미 바인딩된 DNA의 제거 또는 DNA의 높은 흡착 기판에 노출 되지 않은 지역에 발생 합니다.
(섹션 3.2) 위에서 설명 했 듯이, 리소 그래피 과정과 필요한 노출 시간 해상도 실험 설정 (목적, 광원, 등)에 따라 달라 집니다. 따라서, 첫 번째 단계에서 다양 한 노출 시간 테스트 되어야 합니다.
유전자 식 실험, 실험 설치 (현미경, 온도 제어, 등) 사용 가능한 하드웨어에 맞게 사용자 지정할 수 합니다. 우리가 보여준 이러한 두 구현, 어디 시스템 식 믹스의 증발을 줄이기 위해 상자에 캡슐화는, 짧은 실험 (4, 5 절), 및 긴 관찰 (6 단원)에 대 한 미세 장치는 연속 사용 선구자 분자의 공급입니다. 두 경우 모두, DNA의 맞춤 기판에 브러쉬 하 고는 PDMS에 구획 까다로운 단계를 표시 합니다. 따라서 패턴된 하나를 사용 하기 전에 더미 기질을이 여러 번 시도 것이 좋습니다 (보충 정보, 섹션 6 참조). 고유한 유전자의 대형 시스템의 어셈블리에서 브러쉬, 긴 외피 시간, 챔버 및 장거리, 및 패 시 베이 션의 품질에 따라 비 패턴 영역에 DNA의 흡착에 의해 오염 브러시의 정확한 각도 맞춤 수 있습니다. 실질적으로 가능한 시스템의 크기에 한계를 포즈.
이 기술 대신 Karzbrun 그 외 여러분 에 의해 입증 되었다 25를 창조한 구획 하 여 칩에 유도 결합 플라즈마 반응성 이온 에칭 (Bosch 과정), 이산화 실리콘 층의 플라즈마 강화 된 증기 증 착 (PECVD)에 의해 따라. 후 표면 기능화, 모방 및 pipetting 로봇에 의해 nanoliter DNA 방울의 배치, 구획 PDMS 덮인 유리 슬라이드 폐쇄 했다. 이 절차는 DNA를 직접 챔버, 인근 훼손의 위험 없이 구획 안에 움직일 수 수 하지만 추가적인 제조 단계 및 실험실 장비 필요 이점이 있다.
여기에 제시 된 프로토콜 셀 무료 합성 생물학에서 연구원은 칩 기반 반응 용기에 학문의 그들의 시스템 솔루션 기반 설정에서 전송 수 있습니다. 저항을 개발 하는 동안 중앙 단계 활용 DNA 가닥 변위 생체 다단계 리소 그래피 쪽으로 손쉬운 접근을 제공 독특한 DNA 시퀀스, 노출 영역의 라벨 수 있습니다. 마이크로 함께 시간의 연장된 기간 동안 유전자의 관측 식 프로세스 수 있습니다. 오픈 흐름 반응 기 조건 하에서 세포 무료 유전자 식 프로세스의 조사를 제외 하 고 동일한 방법론 고정 공간 칩 표면에 다른 생체를 구성 하 사용 될 수 있습니다. 이 단일 분자 형광 기반 실험 시연 여기와 같은 다양 한 기능 및 생물 연구에 대 한 유용한 증명 해야 합니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 기꺼이 폭스바겐 재단 (부여 번호 89 883)와 유럽 연구 위원회 (보조금 계약 번호 694410-AEDNA)이이 프로젝트에 대 한 재정 지원을 인정 한다. 석사-미 지원을 통해 GRK 2062 DFG 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180x240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
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