Summary
Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.
Abstract
Imobilização de genes em superfícies Litograficamente estruturadas permite o estudo do gene compartimentada processos de expressão em um sistema do biorreator microfluidic aberto. Em contraste com outras abordagens para sistemas celulares artificiais, tal uma configuração permite um fornecimento contínuo com reagentes de expressão de gene e drenagem simultânea de produtos residuais. Isto facilita a implementação de processos de expressão do gene sem célula durante longos períodos de tempo, o que é importante para a realização de sistemas de feedback reguladoras do gene dinâmico. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a fabricação de biochips genéticas usando uma simples de usar litográfica técnica baseada em reações de deslocamento do DNA strand, que usa exclusivamente componentes disponíveis comercialmente. Também oferecemos um protocolo sobre a integração dos genes compartimentadas com um polydimethylsiloxane (PDMS)-microfluidic sistema baseado. Além disso, mostramos que o sistema é compatível com microscopia de fluorescência (TIRF) reflexão interna total, que pode ser usada para a observação direta de interações moleculares entre o DNA e as moléculas contidas na mistura, a expressão.
Introduction
Célula-liberdade de expressão de gene reações são de grande interesse para várias aplicações de biotecnologia, bioquímica e biologia sintética. Célula-livre expressão de proteínas foi fundamental para a preparação de amostras de proteína pura, que serviram de base para inúmeros estudos em biologia estrutural. Por exemplo, sistemas de célula livre foram usados com sucesso para a expressão da proteína complexos1 ou membrana proteínas2, que são difíceis de produzir usando a expressão baseada em célula. Notavelmente, célula livre expressão gênica reações também foram utilizadas para elucidar a estrutura do código genético, começando com os inovadoras experimentos por Nirenberg e Matthaei em 19613.
Recentemente, tem havido um interesse renovado em métodos sem célula em biotecnologia e biologia sintética4,5,6. Sistemas sem célula podem ser aumentados com compostos não-biológico, e componentes de origem biológica diversa podem ser combinadas mais facilmente7. Apesar de sistemas sem célula têm a desvantagem aparente que eles não fazem "crescer e se dividir", é concebível para preparar aberto sem célula biorreatores com funções metabólicas básicas e deixá-los a sintetizar metabólitos quando fornecido com energia e carbono simples entradas8. Dentro o campo emergente da biologia sintética, sistemas sem célula prometem ser um "chassis" mais previsível para a implementação de funções biológicas sintéticas.
Atualmente, as reações de expressão do gene sem célula são realizadas utilizando célula extrai (a partir de diferentes fontes tais como bactérias, leveduras, insetos), ou sistemas de transcrição e tradução que foram otimizados para diferentes aplicações (por exemplo, procariotas vs eucariotas expressão gênica, produção de proteínas de membrana, etc.). Um protocolo popular para a preparação do extrato de célula bacteriana (comumente denominado TXTL) foi fornecido recentemente por V. Noireaux e colegas de trabalho9. Suas propriedades biofísicas tem sido completamente caracterizadas10, e o sistema TXTL foi já utilizado com sucesso para realizar uma série de tarefas bioquímicas complexas: por exemplo, o assembly de bacteriófagos funcional através de célula-livre expressão do genoma do fago11, a síntese de proteínas bacterianas filamentos12ou a implementação de circuitos de gene sem célula13,14.
Popular em biologia sintética sem célula outro sistema é o sistema puro, que é reconstituído a partir de componentes purificados15,16. Em comparação com o sistema TXTL, ele não contém nucleases ou máquinas de degradação de proteínas. Enquanto a degradação do DNA linear, moléculas de RNA ou proteínas é menos de um problema do puro sistema, caminhos de decaimento são realmente importantes para a implementação de funções dinâmicas. Para reduzir o efeito de degradação do exonuclease de modelos lineares gene no sistema TXTL (por RecBCD), a proteína de GamS extremidade-proteger tem a ser adicionado. Tanto o TXTL e o sistema puro estão comercialmente disponíveis.
Um tema intimamente relacionado às preocupações de biologia celular-free o estudo do efeito da compartimentalização em reações bioquímicas e ainda mais a criação de estruturas artificiais célula ou protocélulas17,18,19 ,20. Pesquisa sobre células artificiais normalmente envolve o encapsulamento de um sistema de reação bioquímica dentro de compartimentos vesiculares de fosfolipídios ou outros amphiphiles. Enquanto tais sistemas ajudam a explorar os aspectos fundamentais da compartimentalização, ou o surgimento de celularidade e estruturas auto-replicante, que enfrentam os problemas típicos de sistemas fechados: na ausência de um metabolismo funcional e apropriado mecanismos de transporte de membrana, é difícil manter reações compartimentadas correndo por longos períodos de tempo - usadas de moléculas de combustível e produtos de resíduos se acumulam.
Uma alternativa interessante para compartimentalização dentro desses compartimentos celulares-imitando é a organização espacial do material genético usando métodos fotolitográfica. Imobilização de "genes em um chip" foi pioneira pelo grupo no Instituto Weizmann de Bar-Ziv há mais de dez anos21. Entre as principais questões que precisavam ser resolvidos foram a adsorção não específica de DNA e a potencial desnaturação das proteínas na superfície do chip. Bar-Ziv et al desenvolveram um resist fotolitografia dedicado denominado "Daisy", que era composto de um silano reativo terminal para a imobilização das moléculas sobre superfícies de dióxido de silício, resiste um espaçador de longa polietileno glicol (PEG) que assegurou biocompatibilidade e uma headgroup photocleavable, que foi convertido em uma amina reativa após irradiação com luz ultravioleta (UV). Ficou demonstrado que a Daisy pode ser usado para imobilizar a moléculas de DNA do gene-comprimento (com comprimentos de vários quilo-pares de bases (kbp)) sobre uma superfície de chip. Polímero física ponto de vista, os sistemas representaram escovas de polímero enxertadas em um substrato sólido. Devido à natureza do polyelectrolyte do DNA, a conformação dessas escovas é fortemente afetada pela osmótica e outros efeitos íon-específicos de22,23.
O mais importante, ficou demonstrado que genes de substrato-imobilizado são ainda funcionais e podem ser transcrita e traduzida para o RNA e proteína. Escovas do gene são acessíveis para ARN-polimerase de solução24, e a mistura complexa macromolecular da transcrição/tradução não é desnaturada na superfície. Uma das vantagens da imobilização dos componentes genéticos sobre um substrato é que podem ser operados em um sistema de reator aberto microfluidic continuamente fornecido com moléculas precursoras pequenas e de produtos que resíduos podem ser removidos25 , 26.
Recentemente desenvolvemos uma variante desse método denominado Bephore (para o feixe de elétrons biocompatível e fotorresiste)27, que foi baseado exclusivamente em componentes disponíveis comercialmente e utilizadas sequência-DNA strand invasão a reacções específicas para a realização de um procedimento simples para implementar várias etapas litografia para a criação de células artificiais baseada no chip. Uma visão esquemática do processo é mostrada na Figura 1. É baseado no gancho de cabelo as moléculas de DNA que contém um grupo de photocleavable, que são imobilizadas em uma camada de PEG biocompatível. Photocleavage do gancho de cabelo apresenta uma sequência de single-stranded ponto de apoio, através do qual DNA moléculas de interesse (que contém a sequência DIS "uma substituição") podem ser anexado através de invasão de vertente mediada por ponto de apoio.
Enquanto Bephore é potencialmente mais simples de implementar, Daisy permite a realização de muito denso e limpo "gene" pincéis, que tem vantagens em certas aplicações. Em princípio, no entanto, litografia de Daisy e Bephore poderia ser facilmente combinada. Um método de litografia relacionada utilizando escovas de deslocamento de strand DNA para estruturação do DNA em ouro foi desenvolvido anteriormente por Huang et al, mas não foi utilizado no contexto da expressão de gene sem célula28,29.
O protocolo seguinte nós fornecemos que uma descrição detalhada da produção de DNA brushes para expressão do gene sem célula usando o método Bephore. Descrevemos como os chips de gene são fabricados e demonstram o uso de foto-litografia de várias etapa para a imobilização espacialmente estruturada dos genes em um chip. Discutimos também a fabricação de câmaras de reação e a aplicação de microfluídica para o desempenho das reações de expressão do gene em-microplaqueta.
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Protocol
Nota: Um calendário para as etapas nas seções diferentes consta a informação suplementar (seção 1).
1. fabricação do chip
Nota: como substratos, wafers de silício de uso (diâmetro de 100 mm, espessura de 0,525 mm) com 50 nm espessa camada de dióxido de silício ou lâminas de vidro (24 mm x 24, n. º 1.5; 22 mm x 50 mm, n º 4). Dependendo da aplicação, outros tamanhos e espessuras podem ser mais apropriadas.
- Limpeza a substratos através de uma RCA limpe procedimento (água, solução de amoníaco NH3(aq) 30% e peróxido de hidrogênio H2O2 30%, na proporção de 5:1:1)
- Misturar a solução de água e amoníaco em um copo de béquer e aquecer a mistura a 70 ° C, um prato quente, agitando.
- Adicione o peróxido de hidrogênio e o substrato. Para maior rendimento, coloque vários substratos (especialmente as lâminas de vidro pequeno) em um suporte de politetrafluoretileno (PTFE).
- Após 30 min, retire o substrato, enxaguar abundantemente com água de lavagem de garrafa e seque-o com uma arma de nitrogênio. Imediatamente prosseguir com a PEGylation do substrato.
Cuidado: Use proteção para os olhos e a pele e trabalhar em uma coifa. Não feche o recipiente de resíduos a fim de permitir a liberação do gás da mistura.
- PEGylation do substrato
Nota: Repetidos congelamentos e descongelamentos da unidade populacional de biotina-PEG-silano reduz a reatividade do silano devido à condensação da umidade do ar. Portanto, prepare-se 5 mL-os tubos com quantidades adequadas de biotina-PEG-silano (por exemplo, 10-20 mg) e enchê-los com argônio seco antes de congelá-los até o uso.- Dissolva a biotina-PEG-silano em tolueno seco vortexing (5 mg/mL).
- Coloque o substrato em um prato de petri de vidro (120 cm de diâmetro, 2 cm de altura) em uma coifa.
- Adicionar a solução (µ l de ≈200 para uma lamela de vidro único, alguns mL para uma bolacha de silicone grande) sobre o substrato, cobrindo toda a superfície, mas evitar a solução fluindo ao longo da borda do substrato.
- Feche a caixa de Petri. Para reduzir a secagem do substrato, adicione uma cobertura adicional com uma toalha de papel molhada.
- Após 30 min, adicionar aproximadamente 40 ml de álcool isopropílico, em seguida, retire o substrato, enxágue-o novamente com álcool isopropílico e seque-o com uma arma de nitrogênio (para lâminas de vidro, lembre-se do lado de peguilado). Armazene o substrato no escuro até o uso.
Cuidado: Use proteção para os olhos e a pele e trabalhar em uma coifa.
2. preparação de Genes para a imobilização
Nota: Primer sequências, modificações de DNA e um protocolo PCR exemplar constam as informações complementares (seções 2-4).
- Use primers modificados para amplificar o gene de interesse pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma primeira demão carrega um fluoróforo para visualização em microscopia de fluorescência, e o outro primer é separado da sequência de DIS por um espaçador de glicol do triethylene a fim de manter a sequência DIS single-stranded durante a PCR.
- Purificar o DNA usando um kit de purificação de coluna de rotação e medir sua concentração usando um fotómetro de absorção. A concentração não deve ser muito menor do que 100 nM.
- Ajuste a concentração de NaCl a 1 M, usando uma solução concentrada de NaCl 5 M. A alta concentração de sal facilita o DNA escova montagem processo22.
3. fotolitos
Nota: O photocleavable de DNA (PC) deve ser manuseado somente em um ambiente de amarelo-luz. Amarela folha para salas limpas pode ser usada para filtrar a luz de lâmpadas de luz brancas convencionais.
- Preparação do substrato
- Preparar a mistura de Bephore (1 µM estreptavidina, DNA de PC 1,5 µM, 7,5 µM PH DNA em 1X PBS (tampão fosfato salino)) e a passivação misturar (10 µM unlabeled DIS DNA, BSA (albumina de soro bovino), de 1 mg/mL de 1X PBS). Ambos podem ser armazenados no escuro na geladeira por várias semanas.
- Corte a carcaça em pedaços menores (alguns cm2) usando um cortador de vidro ou por quebrar uma bolacha de silicone ao longo de uma linha de cristal pressionando sobre um canto com um bisturi. Como uma marca de alinhamento simples, crie um pequeno arranhão do centro para uma aresta do substrato usando o cortador de vidro. Pequenas partículas de golpe fora o chip com uma arma de nitrogênio.
- Misture duas gotas de cola de silicone do dois-componente, por exemplo, com uma ponta da pipeta, mexendo e aplique a cola na superfície do chip, deixando a área ao redor da ponta da risque em branco (Figura 2A). A cola fornece uma barreira hidrofóbica que facilita as etapas de lavagem e reduz a quantidade de DNA necessária para a incubação do. Em uma etapa posterior, a cola pode ser facilmente removida.
- Incube 10 µ l (ou quanto for necessário para cobrir o chip) da Bephore-mistura à temperatura ambiente (RT) no chip. Durante a incubação, o chip em uma caixa, por exemplo, uma caixa de ponta da pipeta parcialmente cheio de água para reduzir a evaporação.
- Depois de 1 h, lave o chip várias vezes (5 x com 50 µ l) pipetando com PBS 1x para remover sem uma ligação Bephore-mix.
- Tire reserva tanto quanto possível sem o chip de secagem e incube 10 µ l de mistura de passivação do chip no RT
- Após 2 h, lave o chip várias vezes (10 x com 50 µ l) pipetando com PBS 1x remover agentes de passivação não acoplado.
- Litografia de projeção
Nota: Para litografia, um microscópio vertical com um 60 x objetivo de imersão de água pode ser usado. Tempos de iluminação dependem do objetivo, a fonte de luz, a máscara, densidade de superfície do substrato (slide vidro ou chip de silício) e o DNA desejado. Com um objetivo 60 x, tempos de exposição típica variaram menos de um minuto para uma litografia de duas etapas com sobreposição de regiões (15 s para chips de silício, 45 s para lâminas de vidro)-2-3 min para uma exposição completa. Não utilize uma lamela (exceto quartzo fundido) em cima do substrato, uma vez que bloqueia a luz UV.- Cortar uma impressa Fotomáscara (ver arquivo complementar com máscaras de litografia exemplar e complementar seção 5) para um tamanho adequado para caber um suporte adequado da máscara, que pode ser inserido na posição da parada de campo (Figura 2B). Para litografia precisa de várias etapa, alinhe a máscara com marcas de alinhamento sobre o titular.
- Coloque o substrato em uma lâmina de microscopia e movê-lo para o palco do microscópio. Para padronização de lâminas de vidro de Bephore, inserir folha preta (por exemplo, reposição da folha de máscaras as impressas) entre a lâmina de microscopia e Bephore slide para fornecer um fundo escuro para litografia.
- Inserir um filtro vermelho o caminho da iluminação, foco sobre a superfície do substrato e navegue até a região do substrato, que será exposto, por exemplo, a região na ponta da risque.
- Insira o suporte de máscara, bloquear a iluminação e mudar para o filtro UV (Figura 2). Em uma baixa intensidade de luz, abrir o obturador e usar a câmera para foco rapidamente a máscara sobre o substrato.
- Bloquear o caminho de luz para a câmera e iluminar o substrato em uma alta intensidade de luz para o tempo de exposição desejada.
- Tomar a amostra do microscópio e remova cuidadosamente tanto buffer possível do substrato sem secá-lo.
- Adicione 10 a 20 µ l de DNA com dis sequência de. Coloque o substrato em uma caixa molhada para mantê-lo de secagem. Incubar o DNA no substrato para 2h (oligonucleotides numa concentração micromolar) ou diversas horas/pernoite (kbp-long DNA na concentração de aproximadamente 100 nM) na RT
- Retire o chip do DNA e lavá-lo várias vezes com PBS 1x. Para reduzir o desperdício de DNA (especialmente para fragmentos mais longos), armazenar o DNA retirado do substrato e reutilizá-lo.
- Litografia de várias etapa
Nota: Para um alinhamento preciso de dois ou mais exposições em uma única área, manter a amostra no palco para evitar desalinhamento angular. Certifique-se que o chip não secar. Para o posicionamento de vários pincéis de DNA nas diferentes regiões em um substrato, use um palco motorizado para dirigir para a área designada ou usar um substrato com marcas de alinhamento apropriado.- Após a primeira exposição (seção 3.2), incube DNA com dis-sequência de no substrato. É importante que todos os sites de ligação resultantes da primeira exposição estão ocupados. Portanto, incubar oligonucleotides (10 µM) para aproximadamente 3 h no RT
- Para imobilizar os genes dis-etiquetados, colocá-los no substrato durante várias horas ou pernoite no RT, então lavar a amostra e adicione a mistura de passivação para outro 2h no RT. prosseguir com a próxima exposição.
- Para exposições adicionais, repita as etapas anteriores (3.2.3 - 3.3.2).
4. PDMS dispositivos
Nota: De preferência, trabalha em uma sala limpa. A fabricação de um dispositivo PDMS segue um protocolo padrão, como descrito por McDonald et al . 30
- Fabricação de moldes mestre através de fotolitos
- Limpar um wafer de silício (76,2 mm de diâmetro, 525 µm de espessura) por sonication na acetona por 5 min em potência alta e enxaguar com álcool isopropílico e água deionizada. Depois coloque a bolacha num prato aquecido a 150 ° C por 15 min.
- Opcionalmente, a fim de melhorar a aderência de resistir para o wafer, adicionar promotor de adesão de 2-3 mL e girar a 3000 rpm por 30 s. calor o wafer de 120 ° C por 2 min.
- Adicionar cerca de 2-3 mL fotorresiste (ver Tabela de materiais). Girar a bolacha por 15 s a 500 rpm e, em seguida, a 3000 rpm por 30 s. Isto deve resultar em uma camada de espessura 20 µm de fotorresiste. Deixe a camada de fotorresiste relaxar em temperatura ambiente por 10 min.
- Para cozer a pré-exposição, coloque a bolacha em um prato quente a 50 ° C por 2 min, em seguida, a 85 ° C por 5 min.
- Coloque a bolacha sob a Fotomáscara com a planta dos compartimentos. De preferência, use uma máscara-alinhador. A Fotomáscara deve ter uma resolução de 64.000 dpi (ver arquivo complementar com máscaras de litografia e complementar seção 5).
- Expor a hóstia por 1 min com luz UV (-linha 5-10 mW/cm2) através da Fotomáscara.
- Para cozer a pós-exposição, coloque a bolacha a 50 ° C por 2 min e, em seguida, a 85 ° C por 5 min. Deixe a bolacha arrefecer e relaxar por 1h à temperatura ambiente.
- Coloque a bolacha em um prato com o desenvolvedor para 3 min enquanto suavemente agita o copo. Enxágue a bolacha com álcool isopropílico e seque-o com uma arma de nitrogênio. Coloque a bolacha em um prato quente a 130 ° C, durante 45 min.
- Preparação do dispositivo PDMS
- Base Mix PDMS e PDMS agente em uma proporção de 10:1 e despeje sobre a bolacha em um recipiente fechado até uma camada de cerca de 5 mm formou acima a bolacha de cura. Para obter um dispositivo PDMS de apenas 1 mm de espessura, em vez disso gire o casaco a bolacha com PDMS em 100 rpm por 2 min.
- Coloque o recipiente num exsicador e aplicar um vácuo (cerca de 85 kPa) por cerca de 30 min. Em seguida, aqueça o PDMS para cerca de 70° C durante 1-2 h no forno.
- O dispositivo PDMS separe a bolacha. Corte o PDMS em lajes para que cada parte contém um conjunto de compartimentos. No caso do PDMS será conectado a uma instalação microfluídicos, buracos (1 mm de diâmetro) como uma entrada e saída nas extremidades do canal de abastecimento.
- Limpe o PDMS com álcool isopropílico e água deionizada e seque-o com uma arma de nitrogênio. Armazene o PDMS livre de poeira.
5. expressão do Gene compartimentada
Nota: O procedimento a seguir descreve a montagem de um porta-amostras (Figura 3) para a observação da expressão do gene compartimentada em um microscópio invertido com uma incubadora de gaiola para controle de temperatura. O titular foi construído com materiais facilmente disponíveis e ferramentas (3,5 a 5 mm espessura cloreto de polivinila (PVC) plásticos, parafusos e porcas, broca) e pode ser personalizado para diferentes tipos de microscópios. As etapas descritas em 5.1 e 5.2 devem ser realizadas tal que ambas as partes do titular estão prontas ao mesmo tempo.
- Conjunto do suporte inferior
- Preparar um chip de Bephore marca de alinhamento (por exemplo, um arranhão) e cola-lo no porta chip usando fita adesiva dupla-face (Figura 3B). O chip deve ser maior do que o dispositivo PDMS que irá cobri-lo.
- Imobilizar um ou vários genes no chip (consulte as seções 2 e 3).
- Adicione algum vácuo graxa em torno do furo central do titular do fundo e, em seguida, conecte o titular do chip.
Nota: O titular do chip agora adere ao titular do fundo por meio da graxa, mantendo a possibilidade de re-posicionamento do chip no plano x-y.
- Conjunto de suporte superior
- Prepare um chip PDMS fino com compartimentos usando o procedimento de revestimento de rotação na etapa 4.2.1. Corte o PDMS tão pequena quanto possível, deixando um canal aberto para um dos lados para permitir a troca de resíduos e precursor de moléculas por difusão.
- Limpar uma lamela de vidro (24 mm x 24, n. º 1.5) e a parte traseira do chip PDMS (lado sem compartimentos) com plasma de oxigênio para 42 s (operado em 200 W e 0.8 mbar com a amostra em uma gaiola de Faraday).
- Coloque o chip PDMS no centro do slide vidro com os compartimentos do apontando para cima. Asse o vidro com o PDMS por 1h a 70 ° C.
- Adicione algum vácuo graxa em torno do grande furo do porta superior.
- Antes de iniciar o experimento, limpe a lâmina de vidro e o PDMS o chip com plasma de oxigênio para 42 s para processar o PDMS hidrofílico.
- Coloque a lâmina de vidro com o PDMS no suporte superior ( Figura 3) e pressione suavemente o vidro para a graxa (Figura 3).
- Conjunto de suporte
- Prepare-se 100 µ l de um sistema de célula livre expressão e mantê-lo no gelo.
- Cuidadosamente Retire o chip de buffer e lave uma vez com 10 µ l do sistema célula livre expressão. Em seguida, Adicionar 60 µ l do sistema de expressão livre de celular para o chip e remover a cola de silicone do dois-componente das bordas do chip (já removida na Figura 3B).
- Adicione 20 µ l do sistema de expressão para o PDMS. Após a colocação da gota para o PDMS, verificar rapidamente no microscópio estereoscópico que os compartimentos são bem molhados e sem bolhas de ar. Se existem bolhas de ar, tente lavá-los com o resto do sistema célula livre expressão.
- Para montar as duas partes do titular e para alinhar as câmaras e escovas de DNA, trabalhar sob um microscópio estereoscópico e imobilizar o suporte inferior com um braço de pegador, então os dois parafusos e wingnuts são facilmente acessíveis com ambas as mãos (Figura 3D-F ).
- Insira o suporte superior no suporte inferior e abaixá-la até que as gotículas de sistema de expressão sem célula fusível (Figura 3D). Verifique através do microscópio estereoscópico se os compartimentos e a marca de alinhamento estão em uma região semelhante no plano x-y-, caso contrário puxar para cima o suporte superior e re-posição o vidro deslizar no porta superior.
- Do fundo, estragar os wingnuts até que eles toquem o lado inferior do titular. Aperte cuidadosamente os wingnuts, enquanto alinhando os compartimentos e o chip no plano x-y através da alça na parte inferior do titular do chip (Figura 3E). Uma vez em contato, apertar os wingnuts apenas muito suavemente (Figura 3F).
Nota: Este passo requer alguma experiência e depende da instalação experimental. Sob o microscópio, padrões de interferência resultante líquido entre PDMS e vidro podem indicar que a força aplicada é muito pequena, enquanto uma menor intensidade de fluorescência (a partir de uma escova de DNA ou proteínas expressas) no centro de um dicas de compartimento em um muito alto pressão (ver também informações complementares, secção 6). - Pulverizar a esponja no recinto antievaporação com água e encaixe o suporte da caixa. Encher uma seringa de 5 mL com cola de silicone do dois-componente e usá-lo para selar a caixa (Figura 3).
- A caixa de transferência a um microscópio com temperatura controlada e imagem a escova de DNA e a reação em microscopia de fluorescência. Mesmo sem iluminação, a fluorescência da escova DNA desvanece-se em um sistema de célula livre expressão. No entanto, a escova mantém sua atividade, como pode ser mostrado pela expressão do gene repetidas da mesma escova.
Nota: Ao usar uma lâmina de vidro de Bephore em vez de um chip de silício, a posição (superior/inferior) do chip PDMS e Bephore pode ser trocada, permitindo o uso de objectivos com menores distâncias de trabalho.
6. sustentado expressão em dispositivos microfluídicos
Nota: A configuração experimental é montada a partir das partes indicadas na Figura 4A. Detalhes sobre a montagem do palco temperatura controlada constam as informações complementares (secção 7).
- Tubulação e sistema de expressão livre de célula
- Prepare o sistema de célula livre expressão em um tubo de amostra (cerca de 200 µ l). Esferas de poliestireno rotuladas com corantes fluorescentes podem ser adicionadas ao monitor mais tarde a taxa de fluxo através de um canal de abastecimento.
- Ligue o tubo a um controlador de pressão. Coloca o tubo em um reservatório de gelo grande que mantém o frio por cerca de 12 horas. Reabasteça com gelo se necessário.
Nota: Como uma alternativa para um controlador de pressão, uma bomba de seringa fornece um caudal constante de sistema célula livre expressão, mesmo se as mudanças de resistência de fluxo, por exemplo, devido a bolhas de ar, que pode ajudar com longo prazo experimentos. - Ligar o tubo contendo o sistema de célula livre expressão para PTFE tubo (diâmetro interno de 0,8 mm), que chega à fase aquecida. Uma agulha de seringa (diâmetro de 0,9 mm) em pedaços de 1-2 cm, com extremidades sem corte e inserir um pedaço para o tubo de PTFE. Mais tarde servirá como conector para o PDMS. Tente minimizar o comprimento da tubulação entre o palco e o tubo (Figura 4).
- Para esfriar o tubo de PTFE, envolvê-la em torno do maior tubo de borracha conectado a um reservatório de água gelada e uma bomba peristáltica. Fita-los juntamente com fita adesiva (Figura 4).
- Conjunto de suporte superior
- Limpe o lado liso do PDMS chip com plasma de oxigênio (42 s) e coloque-o sobre uma lâmina de microscopia com furos de montagem de entrada e saída do PDMS (Figura 4B). Os furos no vidro podem ser perfurados de antemão com um copo de cabeça de perfuração. Certifique-se de que o microcâmaras não estão enfrentando a lâmina de vidro.
- Aplica fita adesiva dupla-face para o lado liso do titular do PDMS. Enfie um pedaço de papel alumínio preto (por exemplo, de uma máscara de litografia) na região entre os dois furos do suporte para evitar a fluorescência de plano de fundo da fita adesiva.
- Enfiar a lâmina de vidro com o chip PDMS para o titular.
- Tratar o PDMS e o titular PDMS com o vidro anexado slide com plasma de oxigênio em um plasma líquido de limpeza (42 s).
- Aplique lubrificante vácuo ao redor do buraco grande no suporte superior e inserir o titular PDMS (Figura 4B). O titular PDMS agora adere ao titular do superior, mantendo a possibilidade de re-posicionamento nas direções x-y.
- Conecte o tubo de PTFE com o conector de agulha da seringa para a entrada do chip PDMS. Para facilitar o acesso para o PDMS pelo suporte superior, a placa de plástico superior pode ser removida brevemente para isto e o passo seguinte.
- Inserir um segundo pedaço de PTFE tubo (cerca de 5 cm) com um conector de agulha de seringa à saída (Figura 4).
- Posicione o titular PDMS no suporte superior para é livre para se mover em todas as direções. Lugar o titular superior vagamente para o palco aquecido como na Figura 4E sem apertar qualquer wingnuts.
- Com o microscópio, navegar para a posição dos compartimentos de PDMS e centralizá-las da câmera campo de visão. Não o palco deste ponto seguir em frente.
- Remova o suporte superior com o PDMS do palco.
- Fase aquecida e lâmina de vidro de Bephore
- Regule a temperatura da fase aquecida a 37 ° C
- Cole uma lâmina de vidro de Bephore (n º 4) com as escovas do gene para a fase de temperatura controlada, o microscópio de fluorescência invertido usando fita de adesivo dupla face, com a marca de alinhamento aproximadamente no centro do campo de visão do microscópio. Este posicionamento da marca de alinhamento garante que os compartimentos serão reduzidos mais ou menos a mesma região.
- Criar a imagem no canal correspondente da fluorescência do pincel gene e marcar a sua posição na imagem da câmera.
- Remover o tampão da escova gene, mas não a deixe ir seco. Adicionar 20 µ l do sistema célula - liberdade de expressão para o pincel de gene e usar uma pinça para remover a armação de cola de silicone.
- Montagem da instalação do microfluídicos
- Adicione a pressão para o tubo de amostra até o sistema de célula livre expressão encheu o tubo de PTFE e aparece na parte inferior do dispositivo PDMS. Além disso, pipete 10 µ l do sistema célula livre expressão para as microcâmaras sobre o PDMS. Certifique-se que os compartimentos estão livres de bolhas de ar.
- Cuidadosamente Abaixe o titular superior a lâmina de vidro e a alinhar as microcâmaras com o pincel de gene. Antes de PDMS e o alinhamento marca atingir o mesmo plano focal, use os pequenos parafusos na parte de trás do titular PDMS para alinhar precisamente a x-y-posição e orientação do dispositivo PDMS com o pincel de gene (Figura 4E).
- Mantenha a posição e pressione o PDMS a lâmina de vidro apertando os wingnuts junto os parafusos que conectam o titular superior à fase de microscópio (Figura 4E).
- Aumente a pressão no tubo contendo o sistema de célula livre expressão e monitor o fluxo dos grânulos fluorescentes através do canal de abastecimento (fluxo são recomendadas taxas entre 0,5 a 5 µ l / h) (Figura 4F). Se necessário, aumente a pressão do PDMS no vidro apertando os wingnuts.
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Representative Results
Litografia de duas etapas: a Figura 5 mostra o resultado de um processo de duas etapas litográfica sobre uma lâmina de vidro com sobreposição de padrões de cordões DIS fluorescente etiquetadas.
Expressão de uma proteína fluorescente de uma escova de gene: Figura 6 demonstra a expressão da proteína fluorescente YPet de DNA imobilizado. Em vários pontos no tempo, que avaliamos a taxa de expressão do gene parcialmente branqueamento a proteína fluorescente e observando a recuperação do sinal de fluorescência, desconsiderando a recuperação imediata, o que não resulta da expressão da proteína. Após o clareamento primeiro em duas horas de expressão, a intensidade da fluorescência recuperou rapidamente e levantou-se acima de seu valor antes do branqueamento. Depois de quatro e seis horas, a fluorescência não recuperou a sua intensidade anterior, indicando que, sem o fornecimento de mistura fresca de expressão, a reação terminada após aproximadamente 3-4 h.
Acoplamento de microfluídica: expressão gênica pode ser sustentada por longos períodos de tempo, fornecendo os compartimentos de expressão com moléculas precursoras adicionais através de microfluídica. A Figura 7 mostra esse sistema, permitindo a expressão de YPet mais de 10 h.
Observação de TIRF: Bephore também pode ser aplicado para estudar a interação de proteínas fluorescente etiquetadas com um pincel de DNA a nível da molécula. Especialmente em um ambiente barulhento, litografia ajuda a distinguir entre inespecíficas e específica de interação com o pincel ou a superfície, respectivamente. Figura 8 dá um exemplo, com fluorescente etiquetadas T7 RNA polimerase, que ligação ou aderindo-se preferencialmente para o pincel de DNA em comparação à superfície circundante.
Figura 1 : Bephore fotolitografia. R. uma carcaça com uma superfície de dióxido de silício (SiO2) é coberta com uma camada de biotinilado polietileno glicol (PEG-bt), que é biocompatível e permite a fixação de uma photocleavable DNA prendendor através interações de estreptavidina-biotina. Aqui, o PC contém sequência domínios DCEA * e uma modificação de photocleavable (estrela roxa) e é hibridizado para strand PH com domínio um *. B. iluminação ultravioleta (UV) cliva PC, liberando um fragmento de DNA (cb *) na solução. C-D. A região de single-stranded resultante sobre aids do PC (b) como um ponto de apoio para a deslocação do PH por uma fluorescente etiquetada (estrela verde) DIS costa. E. também mais longo, double-stranded DNA ("Template") pode ser anexado à superfície padronizada. Esse DNA é preparado por PCR com uma primeira demão com uma sequência DIS em sua extremidade 5', onde o primer e DIS são separados por um espaçador de glicol do triethylene manter DIS single-stranded durante PCR (Veja também informações complementares, secções 2-4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Preparação para fotolitos da amostra. R. Coloque um chip de Bephore com uma marca de alinhamento sobre uma lâmina de microscopia ou outro titular de microplaqueta (por exemplo, o titular na Figura 3B). Aplique a cola de silicone do dois-componente como uma barreira hidrofóbica ao longo das bordas do chip (passos 3.1.2-3). B. Coloque a máscara sobre um suporte de máscara. Aqui, nós removemos a íris da parada de campo e modificado seu titular para que a máscara pode ser realizada por pequenos ímãs. Para alinhamento preciso (angular) em litografia de várias etapa, certifique-se de que o alinhamento marca sobre o titular e a partida de máscara (passo 3.2.1). C. para navegar no chip e alinhar a máscara com as marcas de alinhamento do chip, deslize no filtro vermelho. Para a exposição aos raios UV, inserir o filtro UV (passos 3.2.2-5). Figura reproduzida a partir das informações de suporte do anterior trabalho27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Montagem de um titular para a observação da expressão do gene compartimentada. R. partes do titular (unidade da régua: cm). B-C. Parte superior e inferior do titular são montados separadamente, com o titular do fundo carregando um modelado chip Bephore (seção 5.1) e o suporte superior Carregando um chip PDMS com compartimentos (seção 5.2). D-F. Chip e PDMS cuidadosamente introduzidos contato apertado, enquanto simultaneamente observando e alinhando compartimentos e escovas de DNA em um microscópio estereoscópico (passos 5.3.1-6). G. antes de transferir o titular de um microscópio invertido, temperatura controlada, todo o sistema é encapsulado em uma caixa antievaporação (passos 5.3.7-8). Figura reproduzida a partir das informações de suporte do anterior trabalho27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Microfluidic titular da instalação e amostra para a expressão de gene compartimentada. R. partes do porta-amostras, o dispositivo PDMS, o estágio de microscópio com temperatura controlada e a lâmina de vidro de Bephore (unidade de régua: cm). B. uma lâmina de microscopia, carregando o PDMS com compartimentos é colada ao titular do PDMS e exposta ao plasma de oxigênio juntamente com o PDMS em um plasma líquido de limpeza. O PDMS é inserido no suporte superior (passos 6.2.2-5). C. O tubo do sistema de expressão sem célula está conectado a um controlador de pressão e colocado no gelo. A tubagem (linha vermelha tracejada no baixo-relevo) para o sistema de célula livre expressão é resfriada por borracha tubos (linha azul tracejada) através do qual água gelada é bombeada por uma bomba peristáltica (seção 6.1). M. o tubo está ligado à posição de entrada no dispositivo de PDMS. Outro pedaço de tubo é conectado à tomada (passos 6.2.6-7). E. O titular superior é colocado no palco microscópio e cuidadosamente abaixado para o slide de Bephore. O titular PDMS ainda pode ser movido em x-y-avião para alinhar os compartimentos no PDMS com o pincel de gene no chip Bephore. Os wingnuts são usados para pressionar o PDMS para o chip Bephore e corrigir o titular superior à fase de microscópio (passos 6.4.1-3). F. sistema de expressão livre de célula é bombeado através dos canais de microno PDMS e expressão de gene de DNA escovas pode ser monitorado em microscopia de epifluorescência (etapa 6.4.4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Fotolitos em duas fases. A-B. Fluorescente etiquetado oligonucleotides (verde: ATTO 532; vermelho: Alexa Fluor 647) foram consecutivamente imobilizado em uma Bephore vidro slide através de máscara projeção litografia com tempos de exposição de 45 s. C. Sobreposição de subfigures A e B, demonstrando o alinhamento preciso das exposições único. Barras de escala: 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Compartimentada expressão gênica. R. escova de DNA A um slide de vidro Bephore (tempo de exposição UV: 2 min), codificação da proteína fluorescente YPet foi alinhado com um compartimento em um chip PDMS (consulte a secção 5 e Figura 3). B. expressão gênica na câmara com DNA rendeu um sinal forte fluorescência com um gradiente de concentração de proteína formando ao longo de um canal, que ligado a câmara para a mistura de expressão fora do dispositivo PDMS. A câmara de controle sem genes imobilizados permaneceu relativamente escura. C. perfil de intensidade de fluorescência ao longo do tempo para ambas as câmaras. A cada duas horas a proteína fluorescente foi parcialmente branqueada (setas pretas) para verificar se a expressão foi ainda ativa. Após 4 h, a fluorescência não recuperou a sua intensidade anterior, indicando que a expressão tinha encerrado. Barras de escala: 300 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Expressão gênica compartimentada sustentado. R. escova de DNA A um slide de vidro Bephore (tempo de exposição UV: 2 min), codificação para YPet foi alinhado com um compartimento em um chip PDMS. Os compartimentos estão ligados a um canal de abastecimento (seta branca) através do qual sistema de célula livre expressão é bombeado (veja seção 6 e Figura 4). B. O compartimento contendo o pincel gene mostra um sinal de fluorescência de expressão YPet (em verde) pelo sistema de expressão de gene de célula livre. O compartimento vizinho sem um pincel gene permanece relativamente escuro. Componentes frescos do sistema célula livre expressão fluem através do canal de abastecimento e difundem em compartimentos, enquanto os resíduos são transportados para fora. C. perfil de intensidade de fluorescência ao longo do tempo para ambas as câmaras. As proteínas fluorescentes foram parcialmente branqueadas em diferentes pontos no tempo (setas pretas) para verificar se a expressão foi ainda ativo. Devido ao fluxo no canal de abastecimento, expressão gênica foi mantida pelo menos 10 h. (o pico no rastreamento vermelho marcado pela seta vermelha foi causado por uma bolha de ar que drenou temporariamente a solução desde os compartimentos). Barras de escala: 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Estudos de único-molécula na Bephore de vidro corrediças em microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). R. TIRFM objetivo-tipo permite que imagens de único-molécula perto interface vidro-água. Estamos imobilizados genes fluorescente etiquetados (verde, ATTO 532, tempo de exposição UV: 2 min) com um T7 promotor Litograficamente definido listras e observou o comportamento de T7 RNA polimerase (laranja, etiquetado com Alexa Fluor 647) interagindo com a superfície. B. imagem de fluorescência mostrando duas listras de genes imobilizados. C. T7 ARN-polimerase anexar especificamente e não especificamente à superfície (imagem única, tempo de exposição de 50 ms). M. Uma imagem média Obtida de todos os quadros de um vídeo de fluorescência (5.000 quadros como no subfigure C) expõe a interação específica com o pincel de DNA do RNA polimerase. Barras de escala: 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Litografia de Bephore é uma técnica robusta e versátil para a imobilização padronizada de DNA ou RNA. Ainda, o procedimento inclui várias etapas, que - se alterado - podem ser uma fonte para falha ou reduzir o desempenho do sistema.
Um passo crucial na fabricação de chips de Bephore é a PEGylation do substrato, que fornece a biocompatibilidade da superfície. Aqui, a etapa de limpeza com um procedimento RCA é importante, desde que ele também ativa a superfície para a silanização subsequente. Durante a PEGylation real, o substrato deve não secar. Além disso, o silano-PEG-biotina deve ser armazenado corretamente para preservar sua reatividade (seção 1.2) e evitar a reticulação. Para avaliar o resultado da PEGylation, substratos podem ser incubados com estreptavidina fluorescente etiquetada e comparados aos controles não-peguilado. Com êxito peguilado substratos devem ligar streptavidin consideravelmente mais do que os controles.
Além disso, em fases posteriores do processo litográfico, secagem do chip tem efeitos nocivos, resultantes , por exemplo, na remoção de DNA já ligado ou em uma maior adsorção de DNA para regiões não expostas sobre o substrato.
Como mencionado acima (seção 3.2), a resolução do processo litográfico e os tempos de exposição necessárias dependem da instalação experimental (objetivo, fonte de luz, etc.). Portanto, numa primeira fase, uma ampla gama de tempos de exposição deve ser testada.
Para experiências de expressão do gene, a instalação experimental deve ser personalizada para caber o hardware disponível (microscópio, controle de temperatura, etc.). Nós mostramos duas tais implementações, um para experimentos de curtos (4h, seção 5), onde o sistema foi encapsulado em uma caixa para reduzir a evaporação da mistura expressão e um para observação de longa (secção 6), onde um dispositivo microfluidic habilitado um contínuo suprimento de moléculas precursoras. Em ambos os casos, o alinhamento do DNA escovas no substrato e compartimentos no PDMS representaram a etapa mais complicada. Portanto, recomendamos tentar este passo várias vezes com um substrato manequim antes de usar um modelado (ver também informações complementares, secção 6). Na montagem de grandes sistemas de gene distinto escovas, tempos de incubação longa, alinhamento angular preciso de câmaras e pincéis sobre longas distâncias e a contaminação por adsorção de DNA para regiões não-padrão, dependendo da qualidade da passivação, maio apresentam limitações para o tamanho dos sistemas praticamente viáveis.
Uma alternativa a esta técnica foi demonstrada por Karzbrun et al . 25, que criou compartimentos em um chip por indutivamente acoplado a gravura de reativa-íon de plasma (processo de Bosch), seguida por deposição de vapor plasma-avançado (PECVD) de uma camada de dióxido de silício. Depois da superfície functionalization, padronização e colocação de nanolitros gotículas de DNA por um robô de pipetagem, os compartimentos foram fechados com uma lâmina de vidro coberta de PDMS. Este procedimento tem a vantagem de que o DNA pode ser imobilizado diretamente dentro dos compartimentos sem o perigo de contaminação nas proximidades de câmaras, mas requer etapas adicionais de fabricação e equipamentos de laboratório.
O protocolo aqui apresentado permite que pesquisadores trabalhando em biologia sintética sem célula transferir seus sistemas de estudo de solução com base em configurações para recipientes de reação baseada no chip. Utilizando deslocamento strand DNA como a etapa central durante o desenvolvimento da resistir permite a rotulagem das regiões expostas com sequências de DNA únicas, que fornece uma abordagem superficial para litografia multipasso biocompatível. Combinação com microfluídica permite a observação do gene processos de expressão durante longos períodos de tempo. Para além da investigação dos processos de expressão do gene sem célula sob condições de reator de fluxo aberto, a mesma metodologia poderia ser usada para imobilizar e organizar espacialmente outras biomoléculas sobre uma superfície de chip. Isto deve provar útil para uma grande variedade de estudos funcionais e biofísicos, tais como as experiências de único-molécula baseada em fluorescência demonstraram aqui.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.
Acknowledgments
Com gratidão reconhecemos o apoio financeiro para este projeto, a Volkswagen Stiftung (grant, n. º 883 de 89) e o Conselho Europeu de investigação (concessão acordo n. º 694410 - AEDNA). M.S.-S. reconhece o apoio pelo DFG através de Silvina 2062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180x240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
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