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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58634
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Physics Department, Technical University of Munich
* These authors contributed equally

Summary

Wir beschreiben ein einfaches lithographischen Verfahren für die Immobilisierung von gen-Länge DNA-Molekülen auf einer Fläche, die zur zellfreien gen Ausdruck Experimente auf Biochips durchführen können.

Abstract

Immobilisierung von Genen auf lithographically strukturierte Oberflächen ermöglicht die Untersuchung der unterteilte gen Ausdruck Prozesse in einem offenen mikrofluidischen-Bioreaktor-System. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen hin zu künstlichen zellulären Systemen erlaubt solch eine Einstellung für eine kontinuierliche Versorgung mit gen-Ausdruck-Reagenzien und gleichzeitige Entleerung von Abfallprodukten. Dies erleichtert die Umsetzung der zellfreien gen Ausdruck Prozesse über einen längeren Zeitraum der Zeit, die für die Realisierung von dynamischen gen regulatorischen rückgekoppelte Systeme wichtig. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von genetischen Biochips mit einer einfach zu bedienenden lithographische Technik basierend auf DNA-Strang Versetzung Reaktionen, die ausschließlich handelsübliche Komponenten verwendet. Wir bieten auch ein Protokoll über die Integration der unterteilte Gene ein Polydimethylsiloxan (PDMS)-basiertes mikrofluidischen System. Darüber hinaus zeigen wir, dass das System mit Totalreflexion (TIRF) Fluoreszenzmikroskopie, vereinbar ist, für die direkte Beobachtung der molekularen Wechselwirkungen zwischen DNA und Moleküle in der Mischung Ausdruck verwendet werden kann.

Introduction

Zellfreie Genexpression, die Reaktionen von großem Interesse für die verschiedensten Anwendungen in der Biochemie, Biotechnologie und synthetische Biologie sind. Zellfreie Expression von Proteinen war maßgeblich für die Zubereitung von reines Proteinproben, die die Grundlage für zahlreiche Studien in der Strukturbiologie waren. Zum Beispiel zellfreien Systemen erfolgreich die Expression des Proteins komplexe1 oder Membran Proteine2, dienten die sind schwer zu produzieren, mit zellbasierten Ausdruck. Insbesondere zellfreie Genexpression, die Reaktionen auch verwendet wurden, um die Struktur des genetischen Codes, beginnend mit der bahnbrechenden Experimente durch Nirenberg und Matthaei in 19613aufzuklären.

Vor kurzem gab es ein erneutes Interesse an zellfreien Methoden in der Biotechnologie und synthetische Biologie4,5,6. Zellfreie Systeme können mit nicht-biologischen Verbindungen verstärkt werden, und Komponenten der verschiedenen biologischen Ursprungs können leichter7kombiniert werden. Obwohl zellfreien Systemen den scheinbaren Nachteil haben, den sie nicht "wachsen und sich teilen", ist es denkbar, bereiten Sie offene zellfreie Bioreaktoren mit grundlegenden Funktionen des Stoffwechsels und lassen sie synthetisieren Metaboliten mit einfachen Kohlenstoff und Energie Eingänge8. In dem aufstrebenden Gebiet der synthetischen Biologie verspreche zellfreien Systemen, ein berechenbarer "Chassis" für die Umsetzung von synthetischen biologischen Funktionen.

Derzeit, zellfreie gen Ausdruck Reaktionen erfolgen entweder mit Zelle extrahiert (aus verschiedenen Quellen wie Bakterien, Hefe, Insekten), oder Transkription/Translation-Systeme für unterschiedliche Anwendungen (z. B. optimiert wurden prokaryotische vs. eukaryotischen Genexpression, Herstellung von Membranproteinen, etc.). Ein häufig verwendetes Protokoll, für die Vorbereitung der Bakterienzelle Extrakt (allgemein als TXTL bezeichnet) wurde vor kurzem von V. Noireaux und Kollegen9bereitgestellt. Seine biophysikalischen Eigenschaften wurden gründlich gekennzeichnet10, und das TXTL-System wurde bereits erfolgreich eingesetzt, eine Reihe von komplexen biochemischen Aufgaben durchzuführen: z. B. die Montage der funktionalen Bakteriophagen über zellfreie Ausdruck von Phagen Genom11, die Synthese der bakteriellen Protein Filamente12oder die Umsetzung von zellfreien gen Schaltungen13,14.

Beliebt in zellfreien synthetische Biologie ein anderes System ist das reine System, das aus gereinigten Komponenten15,16wieder hergestellt ist. Im Vergleich zu den TXTL-System, enthält es keine Nukleasen oder Protein-Abbau-Maschinen. Beim Abbau von linearen DNA RNA-Moleküle oder Proteine ist weniger ein Problem in der reinen System Verfall Wege sind wirklich wichtig für die Durchführung von dynamischen Funktionen. Um die Wirkung der Exonuclease Verschlechterung der linearen gen Vorlagen im TXTL System (durch RecBCD) zu verringern, hat das Ende schützen GamS Protein hinzugefügt werden. Die TXTL und das reine System sind im Handel erhältlich.

Ein Thema eng mit zellfreien Biologie betrifft die Studie über die Wirkung der Abschottung auf biochemischen Reaktionen, und weiter die Schaffung von künstlichen Zelle Strukturen oder Protozellen17,18,19 ,20. Forschung über künstliche Zellen umfasst in der Regel die Kapselung der eine biochemische Reaktion-System im Inneren vesikuläre Fächer aus Phospholipiden oder andere amphiphilen hergestellt. Während solcher Systeme helfen, um grundlegende Aspekte der Abschottung oder die Entstehung der Zellularität und selbstreplizierende Strukturen zu erkunden, sie konfrontiert die typischen Probleme von geschlossenen Systemen: in Ermangelung von einem funktionierenden Stoffwechsel und entsprechende Membran-Transport-Mechanismen, es ist schwierig, unterteilte Reaktionen laufen über einen längeren Zeitraum hinweg zu - Kraftstoff Moleküle sind aufgebraucht und Abfallprodukte sammeln.

Eine interessante Alternative zur Abschottung innerhalb dieser Zelle imitiert Fächer ist die räumliche Organisation des genetischen Materials mit photolithographische Methoden. Immobilisierung von "Gene auf einem Chip" wurde erstmals von der Bar-Ziv-Gruppe am Weizmann-Institut vor mehr als zehn Jahren21. Zu den wichtigen Fragen, die gelöst werden mussten waren die unspezifische Adsorption von DNA und die potenziellen Denaturierung der Proteine auf der Chipoberfläche. Bar-Ziv Et Al. entwickelt eine dedizierte Photolithographie Resist bezeichnet "Daisy", bestehend aus einer reaktiven terminal Silan für Immobilisierung der Resist Moleküle auf Siliziumdioxid Oberflächen eine lange Polyethylenglykol (PEG) Abstandhalter war, die versicherte Biokompatibilität und eine Photocleavable Headgroup, die in einem reaktiven Amin bei Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht umgewandelt wurde. Es hat sich gezeigt, dass Daisy verwendet werden kann, um gen-Länge DNA-Moleküle (mit einer Länge von mehreren Kilo Basenpaare (Kbp)) auf einem Chip-Oberfläche zu immobilisieren. Aus einem Polymer Physik Standpunkt vertreten die Systeme Polymer Bürsten ein festes Substrat aufgepfropft. Polyelektrolyten aufgrund der DNA ist die Konformation dieser Bürsten osmotische und andere Ionen-spezifische Effekte22,23stark betroffen.

Am wichtigsten ist, hat sich gezeigt, dass Substrat immobilisiert Gene noch funktionsfähig sind und können transkribiert und übersetzt in RNA und Protein. Gen Bürsten sind für RNA-Polymerasen von Lösung24zugänglich, und die komplexe makromolekulare Mischung der Transkription/Übersetzung ist an der Oberfläche nicht denaturiert. Einer der Vorteile der Immobilisierung von genetischen Komponenten auf einem Substrat ist, dass sie in einem offenen mikrofluidischen Reaktorsystem betrieben werden können, die kontinuierlich zugeführt wird, mit kleinen Vorläufer Moleküle und die Abfallprodukte entfernt25 sein kann , 26.

Kürzlich entwickelten wir eine Variante dieser Methode bezeichnet Bephore (für biokompatible Elektronenstrahl und Fotolack)27, die beruhte ausschließlich auf handelsübliche Komponenten und Sequenz-spezifische DNA-Strang Invasion Reaktionen genutzt die Realisierung eines einfach zu implementierende multistep Lithographie-Verfahrens für die Erstellung von Chip-basierte künstliche Zellen. Eine schematische Übersicht des Verfahrens ist in Abbildung 1dargestellt. Es basiert auf DNA-Haarnadel Moleküle mit einer Photocleavable Gruppe, die auf eine biokompatible PEG-Schicht immobilisiert sind. Photocleavage der Haarnadel stellt eine einsträngige Brückenkopf-Sequenz, durch welche, die DNA Moleküle des Interesses (mit der "verdrängt" DIS-Sequenz) angeschlossenen über Brückenkopf-vermittelten Strang Invasion sein können.

Während Bephore möglicherweise einfacher zu implementieren ist, Daisy erlaubt die Realisierung von sehr dicht und sauber "gen Bürsten", die in bestimmten Anwendungen Vorteile hat. Im Prinzip könnte aber Daisy und Bephore Lithographie leicht kombiniert werden. Eine verwandte Lithografie Methode nutzen, die DNA-Strang Verschiebung zur Strukturierung von DNA auf Gold Bürsten wurde zuvor von Huang Et Al.entwickelt, aber war nicht im Zusammenhang mit der zellfreien gen Ausdruck28,29eingesetzt.

Im folgenden Protokoll liefern wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von DNA für zellfreie Genexpression mithilfe der Bephore-Methode Bürsten. Wir beschreiben, wie die gen-Chips werden hergestellt und zeigen die Verwendung von mehrstufigen Foto-Lithografie für die räumlich strukturierten Immobilisierung von Genen auf einem Chip. Wir diskutieren auch die Fertigung der Reaktionskammern und die Anwendung der Mikrofluidik für die Erfüllung der auf dem Chip gen Ausdruck Reaktionen.

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Protocol

Hinweis: Ein Zeitplan für die Schritte in den verschiedenen Abschnitten erhält in den Zusatzinformationen (Abschnitt 1).

(1) Chip-Fertigung

Hinweis: als Substrate, Verwendung Silizium-Wafer (100 mm Durchmesser, 0,525 mm Dicke) mit einer 50 nm dicke Schicht aus Siliziumdioxid oder Glas-Dias (24 mm x 24 mm, Nr. 1.5; 22 mm x 50 mm, Nr. 4). Je nach Anwendung möglicherweise andere Größen und Stärken besser geeignet.

  1. Reinigung der Substrate über ein Cinch Verfahren reinigen (Wasser, Ammoniak-Lösung NH3(Aq) 30 % und 30 % Wasserstoffperoxid H2O2 im Verhältnis 5:1:1)
    1. Mischen Sie Wasser und Ammoniak-Lösung in einem Becher Glas und erhitzen Sie die Mischung auf 70 ° C auf einer Herdplatte unter Rühren.
    2. Fügen Sie das Wasserstoffperoxid und das Substrat. Stellen Sie für höheren Durchsatz mehrere Substrate (vor allem das kleine Glas-Objektträger) in einem Polytetrafluorethylen (PTFE) Halterung.
    3. Nach 30 min das Substrat herausnehmen Sie, spülen sie gründlich mit Wasser aus einer Waschflasche und trocknen Sie ihn mit einer Stickstoff-Pistole. Fahren Sie sofort mit der Pegylierung des Substrats.
      Achtung: Tragen Sie Haut und Augen und arbeiten unter einem Abzug. Schließen Sie die Abfallbehälter nicht dicht um Gas Release aus der Mischung zu ermöglichen.
  2. Pegylierung des Substrates
    Hinweis: Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Biotin-PEG-Silan-Lager reduziert die Reaktivität des Silans durch Kondensation von Luftfeuchtigkeit. Daher bereiten 5 mL-Röhrchen mit entsprechenden Mengen an Biotin-PEG-Silan (z.B. 10-20 mg) und füllen sie mit trockenem Argon vor dem Einfrieren sie bis zur Verwendung.
    1. Biotin-PEG-Silan in trockenen Toluol durch Vortexen (5 mg/mL) auflösen.
    2. Legen Sie das Substrat in einer Petrischale Glas (Durchmesser 120 cm, 2 cm Höhe) in einer Dampfhaube.
    3. Pipette die Lösung (≈200 µL für ein einziges Glas Deckglas, ein paar mL für einen großen Silizium-Wafer) auf das Substrat, auf die ganze Fläche, aber die Lösung fließt über den Rand des Substrates zu vermeiden.
    4. Schließen Sie die Petrischale. Verringerung des Substrats trocknen, fügen Sie eine zusätzliche Abdeckung mit einem feuchten Papiertuch.
    5. Nach 30 min, fügen Sie etwa 40 ml Isopropyl-Alkohol, dann nehmen Sie das Substrat, es noch einmal gründlich mit Isopropyl-Alkohol und trocknen Sie ihn mit einer Stickstoff-Pistole (Glas-Objektträger, denken Sie daran die pegylierten Seite). Lagern Sie das Substrat bis zur Verwendung im Dunkeln.
      Achtung: Tragen Sie Haut und Augen und arbeiten unter einem Abzug.

2. Vorbereitung von Genen für Immobilisierung

Hinweis: Primer-Sequenzen, DNA-Modifikationen und ein vorbildliches PCR-Protokoll in den Zusatzinformationen (Abschnitte 2 bis 4) gegeben sind.

  1. Verwenden Sie modifizierte Primer, um das gen des Interesses durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu verstärken. Eine Grundierung trägt ein Fluorophor zur Visualisierung in der Fluoreszenzmikroskopie und der anderen Primer trennen die DIS-Sequenz Triethylene Glycol Abstandhalter um die DIS-Sequenz einzelsträngige während der PCR zu halten.
  2. Reinigen der DNA mit einem Spin Spalte Reinigung-Kit und seine Konzentration mit einer Absorption Photometer messen. Die Konzentration sollte nicht deutlich unter 100 nM.
  3. Passen Sie die Konzentration von NaCl bis 1 M mit einem konzentrierten 5 M NaCl-Lösung. Die hohe Salzkonzentration erleichtert die DNA Pinsel Montage Prozess22.

(3) Photolithographie

Hinweis: Die Photocleavable DNA (PC) sollte nur in einer Umgebung von gelb-Licht behandelt werden. Gelbe Folie für Reinräume lässt sich das Licht der herkömmlichen weißen Licht Lampen zu filtern.

  1. Vorbereitung des Untergrunds
    1. Vorbereiten die Bephore-Mix (1 µM Streptavidin, 1,5 µM PC DNA, 7,5 µM PH DNA mit 1 X PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung)) und die Passivierung (10 µM unmarkiertem DIS DNA, 1 mg/mL BSA (bovine Serum Albumin), mit 1 X PBS-Puffer) mischen. Beide können in der Dunkelheit im Kühlschrank für mehrere Wochen gespeichert werden.
    2. Schneiden Sie das Substrat in kleinere Stücke (ein paar cm2) mit einem Glasschneider oder durch einen Silizium-Wafer entlang einer Kristalllinie durch Drücken auf eine Kante mit einem Skalpell zu brechen. Als eine einfache Ausrichtung Markierung erstellen Sie einen kurzen Kratzer vom Zentrum in Richtung einer Kante des Substrats mit dem Glasschneider. Kleine Partikel Schlag abseits den Chip mit einer Stickstoff-Pistole.
    3. Mischen Sie zwei Tropfen von zwei-Komponenten-Silikon-Kleber, z.B. mit einer Pipettenspitze rühren und tragen Sie den Kleber auf der Oberfläche des Chips, so dass die Gegend um die Spitze des Kratzers leer (Abbildung 2A). Der Klebstoff bietet eine hydrophobe Barriere, die Waschschritte erleichtert und reduziert die Menge an DNA für Inkubationen erforderlich. In einem späteren Schritt kann der Kleber leicht abgeschält werden.
    4. 10 µL inkubieren (oder so viel wie nötig, um den Chip zu decken) des Bephore-Mix bei Raumtemperatur (RT) auf dem Chip. Während der Inkubation Ort der Chip in einem Karton, z. B. eine Pipette Tip Box teilweise gefüllt mit Wasser, um die Verdunstung zu reduzieren.
    5. Nach 1 h, waschen Sie den Chip ungebunden mehrmals (5 X mit 50 µL) durch Pipettieren mit 1 X PBS zu entfernen Bephore-Mix.
    6. Nehmen Sie so viel Puffer möglichst ohne Trocknung des Chips und inkubieren 10 µL der Passivierung-Mix auf dem Chip bei RT
    7. Waschen Sie nach 2 h dem Chip mehrere Male (10 X mit 50 µL) durch Pipettieren mit 1 X PBS, ungebundenen Passivierung Agents zu entfernen.
  2. Projektionslithographie
    Hinweis: Für die Lithographie, kann eine aufrechte Mikroskop mit einem 60 x Wasser eintauchen Ziel verwendet werden. Beleuchtung Zeiten richten sich nach dem Ziel, die Lichtquelle, die Maske, das Substrat (Silizium-Chip oder Glas Folie) und die gewünschte DNA Oberfläche Dichte. Mit einem 60 X Ziel, typische Belichtungszeiten reichten von unten eine Minute für eine zweistufige Lithographie mit überlappenden Regionen (15 s für Silizium-Chips, 45 s für Glas-Objektträger) für 2-3 Minuten für eine volle Belichtung. Verwenden Sie ein Deckglas (mit Ausnahme von Quarzglas) auf das Substrat nicht, da es UV-Licht blockiert.
    1. Schneiden eine gedruckten Fotomaske (siehe ergänzende Datei mit beispielhaften Lithographie Masken und ergänzenden Abschnitt 5) auf eine geeignete Größe, einen passende Maske Halter passen, die an der Position des Feld-Stop (Abb. 2 b) eingefügt werden können. Richten Sie für präzise mehrstufigen Lithografie die Maske mit Ausrichtungsmarken am Halter.
    2. Platzieren Sie das Substrat auf einer Mikroskopie-Folie und verschieben Sie ihn auf den Mikroskoptisch. Strukturierung von Bephore Glas-Objektträger, legen Sie in schwarze Folie (z.B. freie Folie aus der gedruckten Photomasks) zwischen Mikroskopie und Bephore Folie für Lithographie zu einem dunklen Hintergrund.
    3. Legen Sie einen roten Filter in der Beleuchtung Weg, Fokus auf der Substratoberfläche und navigieren Sie zu der Region das Substrat, das ausgesetzt wird, z. B. der Region an der Spitze des Kratzers.
    4. Maske Halter, blockieren die Beleuchtung und ändern in der UV-Filter (Abbildung 2). Öffnen Sie bei geringer Lichtintensität den Verschluss zu und verwenden Sie die Kamera schnell die Maske auf das Substrat konzentrieren.
    5. Blockieren Sie den Lichtweg auf die Kamera und beleuchten Sie das Substrat auf eine hohe Lichtintensität für die gewünschte Belichtungszeit zu.
    6. Die Probe vom Mikroskop und entfernen Sie vorsichtig soviel Puffer wie möglich vom Substrat ohne trocknen.
    7. Fügen Sie 10-20 µL der DNA mit DIS-Sequenz. Legen Sie das Substrat in einem nassen Feld zu halten, vor dem Austrocknen. Inkubieren Sie die DNA auf dem Substrat für 2 h (Oligonukleotide mit einer mikromolaren Konzentration) oder mehrere Stunden/über Nacht (Kbp lange DNA bei ca. 100 nM Konzentration) bei RT
    8. Entfernen Sie die DNA aus dem Chip zu und waschen Sie es mehrere Male mit 1 X PBS. Um die Verschwendung von DNA (vor allem für längere Fragmente) zu reduzieren, die DNA aus dem Substrat genommen speichern und Wiederverwenden von es.
  3. Mehrstufige Lithographie
    Hinweis: Für die präzise Ausrichtung der zwei oder mehrere Belichtungen in einem einzigen Bereich, halten Sie die Probe auf der Bühne, eckigen Versatz zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass der Chip nicht austrocknen. Verwenden Sie für die Positionierung der verschiedenen DNA-Bürsten in verschiedenen Regionen auf einem Substrat eine motorisierte Bühne zu fahren auf dem dafür vorgesehenen Bereich oder ein Substrat mit entsprechenden Ausrichtungsmarken.
    1. Inkubieren Sie nach der ersten Exposition (Abschnitt 3.2) DNA mit DIS-Sequenz auf dem Substrat. Es ist wichtig, dass alle aus der ersten Exposition Bindungsstellen besetzt sind. Daher brüten Sie Oligonukleotide (10 µM) für ca. 3 h bei RT
    2. Um DIS beschrifteten Gene zu immobilisieren, für mehrere Stunden auf das Substrat legen oder über Nacht bei RT, dann waschen Sie die Probe und hinzufügen den Passivierung-Mix für eine weitere 2 h bei RT. gehen Sie zur nächsten Ausstellung.
    3. Für zusätzlichen Forderungen, wiederholen Sie die vorherigen Schritte (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS-Geräte

Hinweis: Vorzugsweise arbeiten Sie in einem Reinraum. Die Herstellung eines PDMS-Geräts folgt ein standard-Protokoll, wie von McDonald Et Al. beschrieben 30

  1. Herstellung von Meister-Schimmel über Photolithographie
    1. Einen Silizium-Wafer (76,2 mm Durchmesser, 525 µm Dicke) durch Ultraschallbehandlung in Aceton für 5 min bei hoher Leistung reinigen und mit Isopropyl-Alkohol und deionisiertes Wasser abspülen. Danach legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte bei 150 ° C für 15 Minuten.
    2. Optional, um die Haftung von widerstehen auf den Wafer zu verbessern, fügen Sie 2-3 mL Haftvermittler und drehen Sie sich mit 3000 u/min für 30 S. Hitze des Wafers bis 120 ° C für 2 min.
    3. Über 2 bis 3 mL Photoresist hinzuzufügen (siehe Tabelle der Materialien). Drehen Sie den Wafer für 15 s bei 500 u/min, dann bei 3000 u/min für 30 s. Dadurch sollte eine 20 µm dicke Schicht von Fotolack. Lassen Sie die Photoresist-Schicht bei Raumtemperatur für 10 Minuten entspannen.
    4. Legen Sie für die Vorbelichtung backen die Wafer auf einer heißen Platte bei 50 ° C für 2 min, dann bei 85 ° C für 5 min.
    5. Ort der Wafer unter der Fotomaske mit der Blaupause der Fächer. Verwenden Sie vorzugsweise, Mask-Aligner. Die Fotomaske sollte eine Auflösung von 64.000 dpi haben (siehe ergänzende Datei mit Lithographie Masken und ergänzenden Abschnitt 5).
    6. Aussetzen des Wafers für 1 min mit UV-Licht (-Linie 5 bis 10 mW/cm2) durch die Fotomaske.
    7. Die Wafer Platz für die Post-Exposition Backen bei 50 ° C für 2 min und dann bei 85 ° C für 5 min. Lassen Sie die Wafer abkühlen und entspannen für 1 h bei Raumtemperatur.
    8. Ort der Wafer in einer Petrischale mit Entwickler für 3 min. unter Rühren sanft den Becher. Spülen Sie die Wafer mit Isopropyl-Alkohol und trocknen Sie es mit einer Stickstoff-Pistole. Legen Sie die Wafer auf einer heißen Platte bei 130 ° C für 45 Minuten.
  2. Vorbereitung des Geräts PDMS
    1. Mix-PDMS-Basis und PDMS Härtemittel in einem Verhältnis 10:1 und gießen Sie es auf dem Wafer in einem geschlossenen Behälter bis zu einer Schicht von ca. 5 mm über den Wafer gebildet hat. Um ein PDMS-Gerät nur 1 mm Dicke zu erhalten, drehen Sie stattdessen Mantel der Wafer mit PDMS bei 100 u/min, 2 min.
    2. Stellen Sie den Behälter in den Exsikkator gestellt und wenden Sie ein Vakuum (etwa 85 kPa) für ca. 30 min. Dann erhitzen Sie die PDMS auf ca. 70° C für 1-2 h im Ofen.
    3. Die Wafer trennen Sie PDMS-Gerät. Geschnitten Sie die PDMS in Platten, so dass jedes Stück eine Reihe von Fächern enthält. Für den Fall, dass die PDMS an einem mikrofluidischen Setup angeschlossen wird, Lochen Sie (1 mm Durchmesser) als ein Einlass und Auslass an den Enden der Versorgung-Kanal.
    4. Reinigen Sie die PDMS mit Isopropyl-Alkohol und deionisiertes Wasser und trocknen Sie es mit einer Stickstoff-Pistole. Lagern Sie die PDMS staubfrei.

(5) unterteilte Genexpression

Hinweis: Das folgende Verfahren beschreibt die Montage von einem Probenhalter (Abbildung 3) für die Beobachtung der unterteilte Genexpression auf einem inversen Mikroskop mit einem Käfig Inkubator für die Temperaturregelung. Der Halter wurde gebaut, mit leicht verfügbaren Materialien und Werkzeugen (3,5-5 mm dicken Polyvinylchlorid (PVC) Kunststoffe, Schrauben und Muttern, Bohrer) und verschiedene Arten von Mikroskopen angepasst werden kann. In 5.1 und 5.2 beschriebenen Schritte sollten durchgeführt werden, so dass beide Teile des Inhabers zur gleichen Zeit bereit sind.

  1. Untere Halterung Baugruppe
    1. Bereiten Sie einen Bephore Chip mit Ausrichtung Markierung (z.B. Kratzer) und kleben Sie es auf den Chip-Halter mit doppelseitigem Klebeband (Abb. 3 b). Der Chip sollte größer als der PDMS-Gerät, die es zu decken.
    2. Ein oder mehrere Gene auf dem Chip zu immobilisieren (siehe Abschnitte 2 und 3).
    3. Fügen Sie etwas Vakuum Fett um das zentrale Loch der unteren Halterung, dann stecken Sie den Chip-Halter.
      Hinweis: Der Chip-Halter hält sich nun an den unteren Halter durch das Fett unter Beibehaltung der Möglichkeit für die Neupositionierung des Chips in der X-y-Ebene.
  2. Top Halter-Montage
    1. Bereiten Sie einen dünnen PDMS-Chip mit Fächern, die mit dem Spin-Coating-Verfahren in Schritt 4.2.1. Schneiden Sie die PDMS so klein wie möglich, ließ einen Kanal offen zur Seite, um den Austausch von Abfällen und Vorläufer Moleküle durch Diffusion zu ermöglichen.
    2. Reinigen Sie ein Glas Deckglas (24 mm x 24 mm, Nr. 1.5) und die Rückseite des PDMS-Chips (Seite ohne Abteile) mit Sauerstoffplasma für 42 s (mit 200 W und 0,8 Mbar mit der Probe in einen Faradayschen Käfig betrieben).
    3. Platzieren Sie den PDMS-Chip in der Mitte des gläsernen Objektträger mit den Fächern, die nach oben zeigt. Backen Sie das Glas mit dem PDMS für 1 h bei 70 ° C.
    4. Fügen Sie einige Vakuum Fett rund um das große Loch des oberen Halters.
    5. Vor Beginn des Experiments, sauber die Objektträger und der PDMS-chip mit Sauerstoffplasma für 42 s die PDMS hydrophilen rendern.
    6. Legen Sie den Objektträger mit dem PDMS auf den oberen Halter ( Abbildung 3) und drücken Sie vorsichtig das Glas auf das Fett (Abbildung 3).
  3. Halter-Montage
    1. Bereiten Sie 100 µL einer zellfreien Expressionssystems vor und halten sie auf dem Eis.
    2. Vorsichtig entfernen Sie den Puffer aus dem Chip zu und waschen Sie es einmal mit 10 µL der zellfreien Expressionssystems. Als nächstes fügen Sie 60 µL zellfreie Expressionssystems auf dem Chip und entfernen Sie die zwei-Komponenten-Silikon-Kleber von den Rändern des Chips (bereits in Abbildung 3 bentfernt).
    3. Fügen Sie 20 µL des Expressionssystems auf die PDMS. Nach dem Platzieren der Tropfen auf dem PDMS nachschauen im stereoskopische Mikroskop, dass die Fächer gut nass sind und ohne Luftblasen. Wenn Luftblasen vorhanden sind, versuchen Sie, sie mit dem Rest der zellfreien Expressionssystems abwaschen.
    4. Montieren Sie die beiden Stücke des Inhabers zu richten Kammern und DNA-Bürsten, arbeiten unter dem stereoskopische Mikroskop und immobilisieren den unteren Halter mit einem Greifarm, also die beiden Schrauben und Flügelmuttern erreichen Sie bequem mit beiden Händen (Abbildung 3D-F ).
    5. Die unteren Halter stecken Sie Top Halter und bis die zellfreie Expression System Tröpfchen (Abbildung 3D) verschmelzen. Durch die stereoskopische Mikroskop überprüfen, ob die Fächer und die Ausrichtung-Marke in einem ähnlichen Bereich in der X-y-Ebene sind, sonst schnappt euch die Top Halter und Re Position das Glas an der oberen Halterung schieben.
    6. Von unten vermasseln Sie die Flügelmuttern, bis sie die Unterseite des Halters berühren. Vorsichtig anziehen der Flügelmuttern und Ausrichten der Fächer und der Chip in der X-y-Ebene über den Griff am unteren Rand der Chip-Halter (Abbildung 3E). Einmal in Kontakt, anziehen der Flügelmuttern nur sehr sanft (Abbildung 3F).
      Hinweis: Dieser Schritt erfordert einige Erfahrung und hängt von der Versuchsanordnung. Unter dem Mikroskop können über Flüssigkeit zwischen PDMS und Glas entstehen Interferenzmuster angeben, dass die einwirkende Kraft zu klein, während eine geringere Fluoreszenzintensität (aus einem DNA-Pinsel oder exprimierten Proteine) in der Mitte von einem Fach-Hinweise auf eine zu hohe Druck (siehe auch Zusatzinformationen, Abschnitt 6).
    7. Besprühen Sie den Schwamm in der Anti-Verdunstung-Gehäuse mit Wasser und legen Sie den Halter in die Box. Füllen Sie eine 5 mL Spritze mit zwei-Komponenten-Silikon-Kleber und verwenden Sie, um das Feld (Abbildung 3) versiegeln.
    8. Übertragen der Box zu einem temperaturgesteuerten Mikroskop und image-die DNA-Bürste und der Reaktion in der Fluoreszenzmikroskopie. Auch ohne Beleuchtung wird die Fluoreszenz des DNA-Pinsels eine zellfreie Expressionssystems eingeblendet. Dennoch behält die Bürste ihre Tätigkeit, wie durch wiederholte Genexpression von Kamm gezeigt werden kann.
      Hinweis: Wenn Sie einen Objektträger Bephore anstelle von einem Silizium-Chip verwenden, kann die Position (oben/unten) des PDMS und Bephore Chip ausgetauscht werden für den Einsatz von Objektiven mit kleineren Arbeitsabstände erlauben.

6. nachhaltige Ausdruck in mikrofluidischen Geräten

Hinweis: Der Versuchsaufbau ist in Abbildung4a abgebildeten Teile zerlegbar. Angaben auf der Versammlung der temperaturgeführten Bühne in den Zusatzinformationen (Abschnitt 7).

  1. Zellfreie Expressionssystems und Schläuche
    1. Bereiten Sie das zellfreie Expressionssystem in ein Probenröhrchen (ca. 200 µL). Polystyrol-Kügelchen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert können später Monitor der Durchfluss durch eine Versorgung-Kanal hinzugefügt werden.
    2. Verbinden Sie das Rohr mit einem Druckregler. Legen Sie das Rohr in einem großen Eis-Reservoir, das für etwa 12 Stunden kalt hält. Füllen Sie Eis, falls erforderlich.
      Hinweis: Als Alternative zu einem Druckregler, eine Spritzenpumpe bietet einen konstanten Durchfluss von zellfreien Expressionssystems, selbst wenn ändert sich der Strom Widerstand, z. B. durch Luftblasen, die mit langfristig helfen könnte experimentiert.
    3. Schließen Sie den Schlauch mit der zellfreien Expressionssystems zu PTFE Schläuche (Innendurchmesser von 0,8 mm), die auf die beheizten Bühne erreicht. Unterteilen Sie eine Spritzennadel (0,9 mm Durchmesser) in 1-2 cm lange Stücke mit stumpfen Enden und legen Sie ein Stück in die PTFE-Schläuche. Es dient später als Anschluss an die PDMS. Versuchen Sie, die Länge des Schlauches zwischen Bühne und das Rohr (Abbildung 4) zu minimieren.
    4. Um die PTFE-Schläuche zu kühlen, wickeln Sie es um größere Gummischlauch, der ein Eis-Wasser-Reservoir und einer peristaltischen Pumpe verbunden ist. Klebt sie mit Tesafilm (Abbildung 4).
  2. Top Halter-Montage
    1. Reinigen Sie die flache Seite des PDMS Chips mit Sauerstoffplasma (42 s) und legen Sie es auf einer Mikroskopie-Folie mit Löchern passend Einlass und Auslass der PDMS (Abbildung 4 b). Die Bohrungen im Glas können vorher mit einem Glas Bohrkopf gebohrt werden. Stellen Sie sicher, dass die Mikro-Kammern der Objektträger nicht konfrontiert sind.
    2. Doppelseitiges Klebeband auf der flachen Seite des Halters PDMS anwenden Kleben Sie ein Stück schwarzer Folie (z.B. von einer Lithographie-Maske) in der Region zwischen den beiden Bohrungen des Halters Hintergrundfluoreszenz vom Klebeband zu vermeiden.
    3. Kleben Sie den Objektträger mit dem PDMS-Chip an den Halter.
    4. Behandlung der PDMS und PDMS-Halter mit dem angehängten Glas mit Sauerstoffplasma in einem Plasma Reiniger gleiten (42 s).
    5. Um das große Loch in der oberen Halterung Vakuum einfetten und PDMS Halter (Abbildung 4 b). Der PDMS-Inhaber hält sich nun an die Top Halter unter Beibehaltung der Möglichkeit für Re-Positionierung in X-y-Richtung.
    6. Verbinden Sie PTFE-Schlauch mit dem Spritze Nadel Stecker mit dem Einlass des PDMS Chips. Um Zugang zu dem PDMS durch die obere Halterung zu erleichtern, kann die obere Kunststoffplatte kurz aus diesem und den folgenden Schritt entfernt werden.
    7. Fügen Sie ein zweites Stück PTFE Schlauch (ca. 5 cm) mit einer Spritze Nadel Stecker an der Steckdose (Abbildung 4).
    8. Position des PDMS-Inhabers in der oberen Halterung so es frei in alle Richtungen bewegen. Platz der Top Halter lose auf die beheizten Bühne wie in Abbildung 4E ohne jede Flügelmuttern anziehen.
    9. Navigieren Sie mit dem Mikroskop zu der Position der PDMS-Fächer und zentrieren Sie sie in das Blickfeld der Kamera. Verschieben Sie die Phase nicht von diesem Punkt an.
    10. Entfernen Sie den oberen mit dem PDMS von der Bühne.
  3. Beheizten Objekttisch und Bephore Objektträger
    1. Stellen Sie die Temperatur der beheizten Bühne auf 37 ° C
    2. Kleben Sie einen Bephore Objektträger (Nr. 4) mit dem Gen-Pinsel auf die temperaturgeführte Bühne doppelseitiges Klebeband, mit der Ausrichtung Markierung ungefähr in der Mitte des Sichtfeldes des Mikroskops mit invertierten Fluoreszenz-Mikroskop. Diese Positionierung der Marke Ausrichtung sorgt dafür, dass die Fächer etwa auf der gleichen Region herabgesetzt werden.
    3. Nehmen Sie ein Bild in den entsprechenden Fluoreszenz-Kanal der gen-Pinsel und markieren Sie seine Position im Kamerabild.
    4. Den Puffer aus dem Gen-Pinsel zu entfernen, aber nicht austrocknen lassen. Die gen-Bürste 20 µL des Zelle - freie Meinungsäußerung Systems hinzu und benutzen Sie eine Pinzette um zu den Silikon-Kleber-Rahmen zu entfernen.
  4. Montage von mikrofluidischen setup
    1. Das Probenröhrchen fügen Sie Druck bis zellfreie Expressionssystems die PTFE-Schläuche gefüllt hat und am unteren Rand der PDMS-Gerät erscheint hinzu. Zusätzlich, pipette 10 µL der zellfreien Expressionssystems auf der Mikro-Kammern auf der PDMS. Sicherstellen Sie, dass die Fächer frei von Luftblasen ist.
    2. Sorgfältig senken Sie die Top Halter auf den Objektträger zu und richten Sie die Mikro-Kammern mit dem Gen-Pinsel. Bevor PDMS und Ausrichtung Mark erreichen die gleichen Brennebene, können Sie die kleinen Schrauben auf der Rückseite der PDMS-Inhaber gerade die X-y-Position und Ausrichtung des PDMS-Geräts mit dem Gen-Pinsel (Abb. 4E) ausrichten.
    3. Halten Sie die Position und drücken Sie die PDMS auf dem Objektträger durch Anziehen der Flügelmuttern entlang der Schrauben, die die Top Halter mit den Mikroskoptisch (Abb. 4E) verbinden.
    4. Erhöhen Sie den Druck in der Röhre mit der zellfreien Expressionssystems und Monitor die Strömung der fluoreszierenden Perlen durch die Versorgung-Kanal ("Flow", die zwischen 0,5 bis 5 µl pro Stunde empfohlen werden) (Abb. 4F). Falls erforderlich, erhöhen Sie den Druck des PDMS auf dem Glas durch das Anziehen der Flügelmuttern.

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Representative Results

Zweistufige Lithographie: Abbildung 5 zeigt das Ergebnis der lithographischen Schritten auf einem Objektträger mit überlappenden Mustern Eindringmittel beschrifteten DIS Stränge.

Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins aus einer gen-Bürste: Abbildung 6 zeigt den Ausdruck der fluoreszierenden Proteins YPet von immobilisierten DNA. An mehreren Stellen in der Zeit, dass wir die gen-Ausdruck-Rate durch Bleichen teilweise das fluoreszierende Protein und beobachten die Erholung des Fluoreszenzsignals bewertet abgesehen von die sofortige Einziehung, die nicht von Proteinexpression führen. Nach dem ersten bleichen zwei Stunden des Ausdrucks der Fluoreszenzintensität erholten sich schnell und stieg über seinen Wert vor dem Bleichen. Nach vier bis sechs Stunden erholten sich die Fluoreszenz nicht zu seiner vorherigen Intensität, darauf hinweist, dass ohne die Zufuhr von frischen Ausdruck Mischung, die Reaktion nach ca. 3-4 h beendet.

Ankopplung an Mikrofluidik: Genexpression kann durch Angabe der Ausdruck Fächer mit zusätzlichen Vorstufe Moleküle über Mikrofluidik über längere Zeit aufrecht erhalten. Abbildung 7 zeigt ein solches System ermöglicht den Ausdruck von YPet über 10 h.

TIRF Beobachtung: Bephore kann auch angewendet werden, um das Zusammenspiel von Eindringmittel markierte Proteine mit einem DNA-Pinsel auf der Einzelmolekül-Ebene zu untersuchen. Vor allem in einer lauten Umgebung hilft Lithographie, spezifische und unspezifische Interaktion mit dem Pinsel oder der Oberfläche bzw. unterscheiden. Abbildung 8 gibt ein Beispiel dafür, mit Eindringmittel beschrifteten T7-RNA-Polymerase verbindlich oder bevorzugt auf den DNA-Pinsel im Vergleich zu der umgebenden Oberfläche haften.

Figure 1
Abbildung 1 : Bephore Photolithographie. A. ein Substrat mit einer Fläche von Siliziumdioxid (SiO2) mit einer Schicht aus biotinylierte Polyethylenglykol (PEG-Bt), fällt die biokompatibel und ermöglicht die Befestigung einer Photocleavable DNA-Haarnadel über Biotin-Streptavidin Interaktionen. Hier PC enthält Sequenz Domänen Abcb * und eine Photocleavable Änderung (Lila Sterne) und ist nach dem Strand PH mit Domain hybridisierten eine *. B. Ultraviolett (UV) Beleuchtung spaltet PC, Freigabe ein DNA-Fragment (Cb *) in Lösung. C-D. Der daraus resultierende einsträngige Region über PC (b) Aids als einen Brückenkopf für die Verschiebung des pH-Wertes von Eindringmittel beschriftet (grüner Stern) DIS Strang. E. auch länger, doppelsträngige DNA ("Template") kann an die gemusterten Oberfläche befestigt werden. Diese DNA wird vorbereitet, indem PCR mit einer Grundierung, die Durchführung einer DIS-Sequenz bei der 5'-Ende, wo Grundierung und DIS durch eine Triethylene Glycol Abstandhalter getrennt sind, DIS einzelsträngige während der PCR zu halten (siehe auch Zusatzinformationen, Abschnitte 2 bis 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 2
Abbildung 2 : Probenvorbereitung für die Fotolithografie. A. legen Sie einen Bephore Chip mit einer Ausrichtung auf eine Mikroskopie-Folie oder einen anderen Chip-Halter (z.B. der Inhaber in Abb. 3 b). Zwei-Komponenten-Silikon-Kleber als hydrophobe Barriere an den Rändern des Chips (Schritte 3.1.2-3). Setzen Sie B. die Maske auf eine Maske Halter. Hier wir die Iris von der Feld-Haltestelle entfernt und seinem Inhaber geändert, so dass die Maske von kleinen Magneten gehalten werden kann. Sicherzustellen Sie für präzise (eckig) Ausrichtung in der mehrstufigen Lithographie, dass die Ausrichtung auf die Halterung und die Maske Match (Schritt 3.2.1) markiert. Schieben Sie C. auf dem Chip zu navigieren und richten Sie die Maske mit den Ausrichtungsmarken auf dem Chip, in den roten Filter. Einsetzen Sie für die UV-Exposition die UV Filter (Schritte 3.2.2-5). Abbildung von den unterstützenden Informationen der vorherigen Arbeit27reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Montage der Halterung für die Beobachtung der unterteilte Genexpression. A. Teile des Inhabers (Herrscher Einheit: cm). B-C. Obere und untere Teil des Inhabers werden separat mit der unteren Halter mit einem gemusterten Bephore Chip (Abschnitt 5.1) und die Top Halter tragen einen PDMS-Chip mit Fächern (Abschnitt 5.2) zusammengebaut. D-f Chip und PDMS sind sorgfältig in engen Kontakt gebracht, während gleichzeitig beobachten und Ausrichten von Fächern und DNA-Pinsel in einem stereoskopischen Mikroskop (Schritte 5.3.1-6). G. vor der Übertragung des Inhabers an ein umgekehrtes, temperaturgeführte Mikroskop, wird das ganze System in eine Anti-Verdunstung-Box (Schritte 5.3.7-8) gekapselt. Abbildung von den unterstützenden Informationen der vorherigen Arbeit27reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Mikrofluidischen Setup und Probe-Halter für die unterteilte Genexpression. A. Teile der Probenhalter, PDMS, temperaturgeführte Mikroskoptisch und der Bephore-Glas-Folie (Herrscher Einheit: cm). B. eine Mikroskopie-Folie mit PDMS mit Fächern an der PDMS-Halter geklebt und Sauerstoffplasma zusammen mit PDMS in einem Plasma Reiniger ausgesetzt. Die PDMS wird dann in die obere Halterung (Schritte 6.2.2-5) eingefügt. C. die zellfreie Expression System Schlauch ist mit einem Druckregler verbunden und auf Eis gelegt. Die Schläuche (rote gestrichelte Linie im Einschub) für zellfreie Expressionssystems wird gekühlt, Gummi Schlauch (blau gestrichelte Linie) durch welche Eiswasser durch eine peristaltische Pumpe (Abschnitt 6.1) gepumpt wird. D. Der Schläuche ist der Einlass-Position auf dem PDMS-Gerät verbunden. Ein weiteres Stück der Schlauch ist an die Steckdose (Schritte 6.2.6-7) verbunden. E. der Top Halter wird auf den Mikroskoptisch gelegt und langsam absenken, in Richtung der Bephore Folie. PDMS-Halter kann noch in der X-y-Ebene verschoben werden, um die Fächer in der PDMS mit dem Gen-Pinsel auf dem Chip Bephore auszurichten. Die Flügelmuttern werden verwendet, um die PDMS auf der Bephore-Chip drücken und fixieren Sie den oberen Halter auf den Mikroskoptisch (Schritte 6.4.1-3). F. zellfreie Expressionssystems ist durch die Mikro-Kanäle in der PDMS gepumpt und Genexpression von DNA-Bürsten in Epifluoreszenz Mikroskopie (Schritt 6.4.4) überwacht werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Zweistufige Photolithographie. A-b Eindringmittel beschriftet Oligonukleotide (grün: ATTO 532; rot: Alexa Fluor 647) wurden nacheinander auf ein Bephore Glas Folie per Maske Projektionslithographie mit Belichtungszeiten von 45 S. C. immobilisiert Überlagerung der Subfigures A und B, demonstrieren die präzise Ausrichtung der einzelnen Ausstellungen. Skalieren Sie Bars: 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Compartmentalized Genexpression. A. A DNA Pinsel auf einen Glasobjektträger Bephore (UV-Belichtungs-Dauer: 2 min), Codierung für das fluoreszierende Protein YPet, mit einem Fach auf einem PDMS-Chip (siehe Abschnitt 5 und Abbildung 3 ausgerichtet war). B. Genexpression in der Kammer mit DNA ergab eine starke Fluoreszenz-Signal mit einem Protein Konzentrationsgradienten bilden entlang einem Kanal, der die Kammer mit den Ausdruck Mix außerhalb des PDMS-Gerätes verbunden. Der Steuerraum ohne immobilisiert Gene blieb relativ dunkel. C. Fluoreszenz Intensität Profil im Laufe der Zeit für beide Kammern. Alle zwei Stunden wurde das fluoreszierende Protein teilweise (schwarze Pfeile) gebleicht, zu prüfen, ob der Ausdruck noch aktiv war. Nach 4 h erholten sich die Fluoreszenz nicht zu seiner vorherigen Intensität, darauf hinweist, dass Ausdruck beendet hatte. Skalieren Sie Bars: 300 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Nachhaltige unterteilte Genexpression. A. A DNA Pinsel auf einen Glasobjektträger Bephore (UV-Belichtungs-Dauer: 2 min), Kodierung für YPet mit einem Fach auf einem PDMS-Chip ausgerichtet war. Die Fächer sind mit einem Zuführkanal (weißer Pfeil) verbunden durch die zellfreie Expressionssystems gepumpt wird (siehe Abschnitt 6 und Abbildung 4). B. das Depot mit dem Gen-Pinsel zeigt ein Fluoreszenzsignal vom YPet Ausdruck (in grün) durch das zellfreie gen-Ausdruck-System. Das benachbarte Fach ohne eine gen-Pinsel bleibt relativ dunkel. Frischen Komponenten des zellfreien Expressionssystems fließen durch die Versorgung-Kanal und diffundieren in die Fächer während Abfallprodukte abtransportiert werden. C. Fluoreszenz Intensität Profil im Laufe der Zeit für beide Kammern. Die fluoreszierende Proteine wurden teilweise gebleicht zu verschiedenen Zeitpunkten rechtzeitig (schwarze Pfeile) zu prüfen, ob der Ausdruck noch aktiv war. Aufgrund der Strömung in der Versorgung-Kanal war Genexpression für mindestens 10 h gepflegt (der Gipfel der roten Spur durch den roten Pfeil gekennzeichnet war durch eine Luftblase, die vorübergehend die Lösung aus den Fächern entwässert verursacht). Skalieren Sie Bars: 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8 : Einzelmolekül-Studien zur Bephore Glas Folien in Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM). A. Ziel-Typ TIRFM ermöglicht Einzelmolekül-Bildgebung in der Nähe der Glas-Wasser-Grenzfläche. Wir immobilisiert Eindringmittel beschrifteten Gene (grün, ATTO 532, UV-Belichtungszeit: 2 min) mit einem T7 Promoter entlang lithographically Streifen definiert und beobachtet das Verhalten der T7 RNA-Polymerase (orange, beschriftet mit Alexa Fluor 647) mit der Oberfläche interagieren. B. Fluoreszenzbild zeigt zwei Streifen von immobilisierten Genen. C. T7-RNA-Polymerasen befestigen, spezifisch und unspezifisch an die Oberfläche (Einzelbild, 50 ms Belichtungszeit). D. Eine durchschnittliche Bild alle Frames eine Fluoreszenz video entnommen (5.000 Bilder wie in Subfigure C) stellt die spezifische Interaktion der RNA-Polymerase mit dem DNA-Pinsel. Skalieren Sie Bars: 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Bephore Lithographie ist eine robuste und vielseitige Technik für die gemusterten Immobilisierung von DNA oder RNA. Doch das Verfahren umfasst mehrere Schritte, die - wenn geändert - möglicherweise eine Quelle für Fehler oder Leistung des Systems reduziert.

Ein entscheidender Schritt bei der Herstellung von Bephore-Chips ist die Pegylierung des Substrates, die die Biokompatibilität der Oberfläche bietet. Hier ist die Reinigung Schritt mit einem RCA-Verfahren wichtig, da es auch die Oberfläche für die anschließende Silanisierung aktiviert. Während der eigentlichen Pegylierung muss das Substrat nicht austrocknen. Darüber hinaus muss die Silan-PEG-Biotin richtig, seine Reaktivität (Abschnitt 1.2) zu bewahren und Vernetzung zu vermeiden gespeichert werden. Zur Bewertung der Ergebnisse der Pegylierung können Substrate mit Gewebekulturen beschrifteten Streptavidin inkubiert und im Vergleich zu nicht-pegylierten Kontrollen. Erfolgreich sollten pegylierten Substraten erheblich mehr Streptavidin als Steuerelemente binden.

Auch in späteren Stadien der Lithographie hat Trocknung des Chips nachteilige Effekte, z. B. bei der Entfernung von bereits gebundene DNA oder in eine höhere Adsorption von DNA unbelichteten Regionen auf dem Substrat.

Wie bereits erwähnt (Abschnitt 3.2) die Auflösung des lithografischen Prozesses und die notwendigen Belichtungszeiten richten sich nach der Versuchsanordnung (Ziel, Lichtquelle, etc.). In einem ersten Schritt sollte daher eine Vielzahl von Belichtungszeiten getestet werden.

Für gen-Ausdruck-Experimente sollte der Versuchsaufbau auf die verfügbare Hardware (Mikroskop, Temperierung, etc.) angepasst werden. Wir zeigten zwei solche Implementierungen, kurze Experimente (4 h, Abschnitt 5), wo das System in ein Feld, um die Verdunstung des Ausdrucks-Mix zu reduzieren verkapselt war und lange Beobachtung (siehe Abschnitt 6), wo ein mikrofluidischen Gerät aktiviert eine kontinuierliche Versorgung der Vorstufe Moleküle. In beiden Fällen die Ausrichtung der DNA Bürsten auf dem Substrat und Fächer in der PDMS war der schwierigsten Schritt. Wir empfehlen daher, versucht diesen Schritt mehrmals mit einem Dummy-Substrat vor mit einem gemusterten (siehe auch Zusatzinformationen, Abschnitt 6). Bei der Montage von großen Systemen unterschiedliche gen Mai, Bürsten, langen Inkubationszeiten, exakte eckige Ausrichtung der Kammern und Bürsten über lange Distanzen und Verunreinigung durch Adsorption von DNA-gemusterten Regionen abhängig von der Qualität der Passivierung darstellen Sie Grenzen, die Größe der praktikable Systeme.

Eine Alternative zu dieser Technik zeigte sich durch Karzbrun Et al. 25, wer Fächer in einem Chip von induktiv erstellt gekoppelt Plasma reaktive Ionen Ätzen (Bosch-Verfahren), gefolgt von Plasma-enhanced Vapor Deposition (PECVD) einer Siliziumdioxid-Schicht. Nach Oberfläche Funktionalisierung, Strukturierung und Platzierung von Nanoliter DNA Tröpfchen durch ein Pipettierroboter wurden die Fächer mit einem PDMS bedeckten Objektträger geschlossen. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass die DNA kann direkt ohne die Gefahr einer Kontamination in der Nähe Kammern Innenfächer immobilisiert werden, aber es zusätzliche Fertigungsschritte und Laborgeräte erfordert.

Die hier vorgestellten Protokoll ermöglicht Forschern in zellfreien synthetische Biologie arbeiten ihrer Systeme für die Studie von lösungsorientierten Setups auf Chip-basierte Reaktionsbehälter übertragen. Mit DNA-Strang Verschiebung als der zentrale Schritt während der Entwicklung des Resists ermöglicht Kennzeichnung von exponierten Regionen mit einzigartigen DNA-Sequenzen bietet eine leichtfertige Haltung gegenüber biokompatible multistep Lithographie. Kombination mit Mikrofluidik ermöglicht die Beobachtung des Gens Ausdruck Prozesse über einen längeren Zeitraum hinweg. Neben der Untersuchung der zellfreien gen Ausdruck Prozesse unter offenen Reaktor Strömungsverhältnisse könnte die gleiche Methodik zu immobilisieren und räumlich organisieren andere Biomoleküle auf einem Chip-Oberfläche verwendet werden. Dies sollte für eine Vielzahl von funktionalen und biophysikalischen Studien nützlich, wie z. B. die Fluoreszenz basierende Einzelmolekül-Experimente hier demonstriert.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

Acknowledgments

Wir bestätigen dankend finanziellen Unterstützung für dieses Projekt von der Volkswagen-Stiftung (Grant Nr. 89 883) und des European Research Council (Grant Agreement Nr. 694410 - AEDNA). M.S.-S. Unterstützung durch die DFG durch GRK 2062 anerkennt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4 Menzel 22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5 Assistent 24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane Laysan Bio MW 5,000
Anhydrous toluene Sigma Aldrich (Merck) 244511
Streptavidin Thermo-Fisher Scientific S888
DNA Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress New England Biolabs E6800S Cell-free expression system
PDMS  Dow Corning Slygard 184
FluoSpheres Thermo-Fisher Scientific F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) Bola S 1810-10
EpoCore 20 micro resist technology GmbH Photoresist
mr-Dev 600 micro resist technology GmbH Photoresist developer
Ti-Prime MicroChemicals Adhesion promoter
Two-component silicon glue Picodent Twinsil 
UV-protection yellow foil Lithoprotect (via MicroChemicals) Y520E212
Equipment
Masks for photolithography Zitzmann GmbH 64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope Olympus BX51 Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera Photometrics Coolsnap HQ Used with Olympus BX51
Ligtht source EXFO X-Cite 120Q Used with Olympus BX51
Inverted microscope Nikon Ti2-E Fluorescence imaging of gene expression
4x objective Nikon CFI P-Apo 4x Lambda Used with Nikon Ti2-E
Camera Andor Neo5.5 Used with Nikon Ti2-E
Light source Lumencor SOLA SM II Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator Okolab bold line Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller Elveflow OB1 MK3
NanoPhotometer Implen DNA concentration measurement
Plasma cleaner Diener Femto 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

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References

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