Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تجميد سطح الوظيفية للجينات باستخدام الطباعة الحجرية التشرد حبلا متعددة الخطوات

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58634
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Physics Department, Technical University of Munich
* These authors contributed equally

Summary

يصف لنا إجراء معدني بسيط للتثبيت جزيئات الحمض النووي الجيني-طول على سطح، التي يمكن استخدامها للقيام بتجارب تعبير الجينات الخلية الحرة في بيوتشيبس.

Abstract

يسمح التثبيت جينات على السطوح ليثوجرافيكالي منظم دراسة الجينات المجزأة عمليات التعبير في نظام مفاعل حيوي موائع جزيئية مفتوحة. على النقيض من النهج الأخرى نحو النظم الخلوية مصطنعة، يسمح هذا إعداد لإمداد متواصل مع الكواشف التعبير الجيني وتجفيف متزامنة من منتجات النفايات. وهذا يسهل تنفيذ عمليات التعبير الجيني الخلية الحرة على مدى فترات طويلة من الزمن، هو أمر مهم لتحقيق نظم التغذية المرتدة التنظيمية الجينات الحيوية. هنا نقدم بروتوكول مفصل لتلفيق الوراثية بيوتشيبس استخدام بسيط باستخدام معدني أسلوب استناداً إلى ردود فعل التشرد حبلا الحمض النووي، الذي يستخدم حصرا المكونات المتوفرة تجارياً. نحن نقدم أيضا بروتوكول على إدماج الجينات المجزأ مع بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)-على أساس نظام موائع جزيئية. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أن النظام متوافق مع انعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية، التي يمكن أن تستخدم للمراقبة المباشرة للتفاعلات الجزيئية بين الحمض النووي والجزيئات الواردة في مزيج التعبير.

Introduction

الخلية الحرة التعبير الجيني ردود الفعل ذات أهمية كبيرة لمختلف التطبيقات في الكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية. وكان التعبير الخلية خالية من البروتينات مفيدة لإعداد عينات البروتين النقي، التي كانت الأساس للعديد من الدراسات في علم الأحياء الهيكلية. على سبيل المثال، نظم خالية من الخلية بنجاح واستخدمت للتعبير عن البروتين المجمعات1 أو غشاء بروتينات2، التي يصعب أن تنتج باستخدام تعبير يستند إلى الخلية. جدير بالذكر أن الخلية خالية من التعبير الجيني ردود الفعل واستخدمت أيضا توضيح بنية الشفرة الجينية، بدءاً من التجارب الرائدة واسطة Nirenberg ومأتى في عام 19613.

في الآونة الأخيرة، كان هناك اهتمام جديد بأساليب الخلية الحرة في مجال التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية4،،من56. ويمكن زيادة أنظمة الخلية خالية مع المركبات غير البيولوجية، ومكونات أصل بيولوجي متنوعة يمكن دمجها بسهولة أكبر7. على الرغم من أن أنظمة الخلية الحرة قد عيب واضح أن لم يفعلوا "تنمو وتقسيم"، تصور لإعداد مفتوحة المفاعلات الحيوية الخلية خالية مع الوظائف الأيضية الأساسية والسماح لهم بتجميع نواتج الأيض عند تزويدها بالطاقة والكربون بسيطة 8من المدخلات. في هذا المجال الناشئ من البيولوجيا التركيبية، وعد أنظمة الخلية الحرة لتكون أكثر قابلية للتنبؤ "هيكل" للتنفيذ الوظائف البيولوجية الاصطناعية.

حاليا، وردود فعل التعبير الجيني الخلية الحرة تنفذ أما باستخدام الخلية مقتطفات (من مصادر مختلفة مثل البكتيريا والخميرة والحشرات)، أو نظم الترجمة/النسخ التي تم الأمثل لتطبيقات مختلفة (مثلاً، بدائية مقابل التوكسينات التعبير الجيني، إنتاج بروتينات الغشاء، إلخ). بروتوكول شعبية للتحضير لاستخراج الخلايا البكتيرية (يسمى عادة تكستل) قدمت مؤخرا نويرو خامسا وزملاء العمل9. خصائصه الفيزيائية تتميز دقيق10، والنظام تكستل بالفعل استخدمت بنجاح لتنفيذ سلسلة من المهام المعقدة البيوكيميائية: مثلاً، جمعية bacteriophages الوظيفية عن طريق الخلية الحرة التعبير عن الجينوم بالعاثية11أو تخليق البروتين البكتيري خيوط12تنفيذ الجين الخلية الحرة الدوائر13،14.

نظام آخر شعبية في البيولوجيا التركيبية الخلية الحرة هو نظام الصرفة، التي يتم تشكيلها من مكونات المنقي15،16. مقارنة بنظام تكستل، أنه لا يحتوي على نوكليسيس أو إليه تدهور البروتين. بينما تدهور خطي الحمض الخلوي الصبغي، جزيئات الرنا أو البروتينات أقل من قضية في نظام الصرفة، ومسارات تسوس هامة فعلا لتنفيذ مهام الديناميكية. من أجل التقليل من تأثير تدهور [ااكسونوكلس] قوالب الجينات الخطي في النظام تكستل (عن طريق ريكبكد)، قد البروتين التجمع حماية نهاية المراد إضافتها. تكستل ونظام الصرفة متوفرة تجارياً.

موضوع ارتباطاً وثيقا بشواغل بيولوجيا الخلية الحرة دراسة أثر التقسيم في التفاعلات الكيميائية الحيوية، وكذلك إنشاء هياكل تشبه الخلية الاصطناعية أو بروتوسيلس17،18،19 ،20. البحث عن خلايا اصطناعية ينطوي عادة على تغليف نظام رد الفعل البيوكيميائية داخل مقصورات حويصلية مصنوعة من فوسفوليبيدات أو أمفيفيليس أخرى. بينما مثل هذه الأنظمة تساعد على استكشاف الجوانب الأساسية للتقسيم، أو ظهور سيلولاريتي وهياكل ذاتية، يواجهون مشاكل نموذجية من النظم المغلقة: في غياب الأيض بالأداء والمناسبة غشاء آليات النقل، من الصعب أن تبقى مجزأة ردود الفعل قيد التشغيل لفترات طويلة من الزمن--تستخدم جزيئات الوقود وتتراكم النفايات.

بديل لاهتمام للتجزيء داخل هذه المقصورات محاكاة الخلية هو تنظيم المواد الجينية باستخدام أساليب فوتوليثوغرفيك المكانية. التثبيت من "الجينات على رقاقة" كان رائدا من قبل فريق بار-زيف في معهد وايزمان منذ أكثر من عشر سنوات21. وكان من بين القضايا الرئيسية التي يتعين حلها الامتزاز غير محددة من الحمض النووي وتمسخ المحتملة من البروتينات على سطح الرقاقة. شريط-زيف et al. وضعت مقاومة التصويرية مخصص يسمى "زهرة الأقحوان"، الذي كان يتألف من رد الفعل سيلاني الطرفية للتثبيت جزيئات مقاومة على الأسطح ثاني أكسيد السيليكون، فاصل طويل البولي إثيلين غليكول (شماعة) التي أكدت توافق مع الحياة، وهيدجروب فوتوكليفابل، التي تم تحويلها إلى أمين رد الفعل عند التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية). فقد ثبت أنه يمكن استخدام ديزي شل طول الجينات جزيئات الحامض النووي (مع أطوال عدة كيلو قاعدة أزواج (kbp)) على سطح رقاقة. من وجهة نظر فيزياء البوليمرات، تمثيل النظم فرش البوليمرات المطعمة على ركيزة صلبة. نظراً لطبيعة بولييليكتروليتي الحمض النووي، تكيف هذه الفرش تأثرا شديدا ناضح وغيرها من الآثار الخاصة بايون،من2223.

الأهم من ذلك، فقد ثبت أن جينات معطلة الركيزة فعالة ويمكن أن يدون وترجمتها إلى الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات. فرش الجينات موجوداً لرنا بولمرس من حل24، وهو خليط الجزيئات المعقدة للترجمة/النسخ لا التشويه والتحريف في السطح. إحدى الميزات للتثبيت مكونات الوراثية على الركازة هو أن أنها يمكن أن تعمل في إطار نظام مفاعل موائع جزيئية مفتوحة التي يتم توفيرها بشكل مستمر مع جزيئات صغيرة السلائف ومن منتجات النفايات التي يمكن أن تكون إزالة25 , 26.

ونحن مؤخرا بوضع البديل من هذا الأسلوب الذي يطلق عليه بيفوري (لشعاع الإلكترون متوافق حيويا ومقاوم الضوء)27، التي تستند حصرا إلى المكونات المتاحة تجارياً والمستخدمة الخاصة بتسلسل الحمض النووي حبلا ردود الفعل للغزو أعمال الطباعة الحجرية متعددة الخطوات البسيطة لتنفيذ إجراء لإنشاء خلايا اصطناعية القائم على رقاقة. ويرد في الشكل 1نظرة تخطيطية للإجراء. ويستند على الحمض النووي دبوس الجزيئات التي تحتوي على مجموعة فوتوكليفابل، التي هي معطلة على طبقة شماعة متوافق حيويا. فوتوكليفاجي دبوس الكشف عن تسلسل تويهولد واحد-الذين تقطعت بهم السبل، من خلال الحمض النووي الذي يمكن جزيئات فائدة (التي تحتوي على تسلسل ديس "إلى تشريد") المرفقة عن طريق غزو حبلا تويهولد بوساطة.

في حين يحتمل أن تكون أبسط لتنفيذ بيفر، ديزي يسمح أعمال كثيفة جداً ونظيفة "فرش الجينات"، التي لديها مزايا في تطبيقات معينة. من حيث المبدأ، ولكن الطباعة الحجرية ديزي وبيفوري يمكن بسهولة دمج. أسلوب الطباعة الحجرية ذات الصلة استخدام فرش التشرد حبلا الحمض النووي لهيكلة الحمض النووي في الذهب وقد وضعته سابقا هوانغ et al.، ولكن لم تستخدم في سياق تعبير الجينات الخلية الحرة28،29.

في البروتوكول التالي نقدم وصفاً مفصلاً لإنتاج الحمض النووي فرش للتعبير الجيني خالية من الخلية باستخدام الأسلوب بيفوري. يصف لنا كيف رقائق المورثات ملفقة وإثبات استخدام صور متعددة خطوة-الطباعة الحجرية للتثبيت مكانياً منظم للجينات على شريحة. نناقش أيضا تلفيق رد فعل الدوائر وتطبيق ميكروفلويديكس للقيام بردود فعل التعبير الجيني على شريحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يرد جدولاً زمنياً للخطوات المذكورة في الأقسام المختلفة في المعلومات التكميلية (القسم 1).

1-رقاقة تلفيق

ملاحظة: كركائز، استخدام رقائق السليكون (بقطر 100 ملم، والسماكة مم 0.525) مع طبقة سميكة 50 نانومتر من ثاني أكسيد السيليكون أو الشرائح الزجاجية (24 ملم × 24 مم، رقم 1، 5؛ 22 مم × 50 مم، رقم 4). اعتماداً على التطبيق، أحجام وسمك أخرى قد تكون أكثر ملاءمة.

  1. التنظيف ركائز عبر RCA تنظيف الداخلي (الماء ومحلول الأمونيا NH3(aq) 30% وفوق أكسيد الهيدروجين ح2س2 30%، بنسبة 5:1:1)
    1. مزيج الماء والأمونيا الحل في كوب كوب وتسخين المخلوط على 70 درجة مئوية على لوحة الساخن مع التحريك.
    2. إضافة فوق أكسيد الهيدروجين والركيزة. لإنتاجية أعلى، وضع ركائز متعددة (لا سيما الشرائح الزجاجية الصغيرة) في حامل تترافلوروايثيلين (PTFE).
    3. بعد 30 دقيقة، أخرج الركيزة وشطفه جيدا بالماء من زجاجة المياه والصرف الصحي، والجاف لأنه يحمل بندقية نيتروجين. ينتقل فورا مع بيجيليشن الركازة.
      تنبيه: ارتداء حماية العين والجلد والعمل في غطاء دخان. لا تقم بإغلاق حاوية النفايات محكم للسماح بالإفراج عن الغاز من الخليط.
  2. بيجيليشن الركازة
    ملاحظة: تكرار تجميد والغاء الأسهم البيوتين-شماعة-Silane يقلل مفاعليه سيلاني بسبب تكثيف رطوبة الجوية. ولذلك، تعد 5 مل-أنابيب مع الكميات المناسبة من البيوتين-شماعة-Silane (مثلاً 10-20 ملغ) وملئها مع الأرجون الجافة قبل تجميدها حتى الاستخدام.
    1. حل البيوتين-شماعة-سيلاني في التولوين الجافة فورتيكسينج (5 ملغ/مل).
    2. ضع الركيزة في طبق بتري زجاجية (قطر 120 سم، الطول 2 سم) في غطاء دخان.
    3. "الماصة؛" محلول (إيتش تو زيرو زيرو ميليلتر لزلة غطاء زجاج مفرد، مل قليلة لرقاقة سيليكون كبيرة) على الركازة، تغطي السطح كله، ولكن تجنب الحل الذي يتدفق على حافة الركازة.
    4. أغلق طبق بتري. للحد من جفاف الركازة، إضافة تغطية إضافية مع منشفة ورقية رطبة.
    5. وبعد 30 دقيقة، إضافة حوالي 40 مل كحول الأيزوبروبيل، ثم إخراج الركيزة واشطف مرة أخرى بعناية مع كحول الأيزوبروبيل والجاف لأنه يحمل بندقية نيتروجين (للشرائح الزجاجية، تذكر أن الجانب سي). تخزين الركيزة في الظلام حتى الاستخدام.
      تنبيه: ارتداء حماية العين والجلد والعمل في غطاء دخان.

2-إعداد الجينات للتثبيت

ملاحظة: تسلسل التمهيدي، وترد التعديلات الحمض النووي وبروتوكولا PCR مثالية في المعلومات التكميلية (الفرعان 2-4).

  1. استخدام كبسولة تفجير معدلة لتضخيم الجينات للاهتمام بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). التمهيدي واحد يحمل فلوروفوري للتصور في الفحص المجهري الأسفار، والتمهيدي أخرى يفصلها عن تسلسل ديس فاصل غليكول تريثيليني من أجل الحفاظ تسلسل ديس الذين تقطعت بهم السبل-واحد طوال ال [بكر].
  2. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية عمود دوران وقياس تركيزه فوتوميتر امتصاص استخدام. يجب أن لا يكون التركيز أقل بكثير من 100 نانومتر.
  3. ضبط تركيز كلوريد الصوديوم إلى م 1 باستخدام حل كلوريد الصوديوم 5 م مركزة. ارتفاع تركيز الملح يسهل عملية الجمعية فرشاة الحمض الخلوي الصبغي22.

3-الطباعة التصويرية

ملاحظة: ينبغي التعامل معها فوتوكليفابل "الحمض النووي" (PC) فقط في بيئة الضوء الأصفر. يمكن استخدام رقائق الأصفر كليانرومس لتصفية ضوء مصابيح الضوء الأبيض التقليدي.

  1. إعداد الركيزة
    1. إعداد بيفوري--ميكس (1 ميكرومتر streptavidin، 1.5 ميكرومتر PC الحمض النووي، ميكرومتر 7.5 PH الحمض النووي في 1 x برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة)) وتخميل مزيج (غير مسمى "ديس الحمض النووي"، 1 ملغ/مل جيش صرب البوسنة (ألبومين المصل البقري)، في برنامج تلفزيوني 1 x 10 ميكرومتر). ويمكن تخزين كل في الظلام في الثلاجة لعدة أسابيع.
    2. قص الركيزة إلى أجزاء أصغر (بضع سم2) أما باستخدام قاطع زجاج أو عن طريق كسر رقاقة سيليكون على طول خط كريستال بالضغط على حافة مع مشرط. كعلامة محاذاة بسيط، إنشاء الصفر قصيرة من المركز نحو حافة الركيزة باستخدام قطع الزجاج. ضربة جزيئات صغيرة قبالة الرقاقة مع بندقية نيتروجين.
    3. مزيج قطرات اثنين من صمغ السيليكون المكون الثاني، إثارة مثلاً مع تلميح ماصة، وتطبيق الغراء على سطح الرقاقة، ترك المنطقة المحيطة غيض الصفر فارغة (الشكل 2A). ويوفر الغراء حاجزاً مسعور التي يسهل خطوات الغسيل ويقلل من كمية الحمض النووي اللازمة إينكوباتيونس. وفي خطوة لاحقة، الغراء يمكن أن تكون بسهولة انشقت.
    4. احتضان 10 ميليلتر (أو قدر الضرورة لتغطية الرقاقة) بيفر-مزيج في درجة حرارة الغرفة (RT) على الرقاقة. أثناء الاحتضان، جزئيا مكان الرقاقة في مربع، مثل مربع تلميح ماصة مليئة بالمياه لتقليل التبخر.
    5. بعد 1 ح، تغسل الرقاقة عدة مرات (5 س مع 50 ميليلتر) التي بيبيتينج مع برنامج تلفزيوني 1 x إزالة غير منضم بيفر-ميكس.
    6. خلع المخزن المؤقت قدر ممكن دون تجفيف شرائح واحتضان 10 ميليلتر من التخميل-المزيج على الرقاقة في الرايت
    7. بعد ح 2، تغسل الرقاقة عدة مرات (10 x مع 50 ميليلتر) التي بيبيتينج مع برنامج تلفزيوني 1 x إزالة عوامل التحييد غير منضم.
  2. الطباعة الحجرية الإسقاط
    ملاحظة: لطباعة حجرية، يمكن استخدامها مجهر تستقيم مع 60 × الهدف غمر المياه. أوقات الإضاءة تعتمد على الهدف، ومصدر الضوء، القناع، سطح الركازة (الشريحة السيليكون رقاقة أو الزجاج) والحمض النووي المطلوب الكثافة. مع هدف 60 x، تراوحت مرات التعرض نموذجية من أسفل دقيقة واحدة للطباعة حجرية خطوتين مع تداخل مناطق (15 s لرقائق السيليكون، 45 ثانية للشرائح الزجاجية) إلى 2-3 دقيقة عن تعرض كامل. لا تستخدم بكشف الغطاء (ما عدا الكوارتز فوسيد) على رأس الركيزة، نظراً لأنه يمنع ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
    1. قطع من النبائط مطبوعة (انظر الملف التكميلي مع أقنعة المثالية الطباعة الحجرية وقسم التكميلي 5) إلى حجم مناسب صالح حامل قناع مناسب، التي يمكن إدراجها في الموضع لإيقاف الحقل (الشكل 2). لدقة متعددة خطوة الطباعة الحجرية، محاذاة القناع بمحاذاة علامات على الحامل.
    2. ضع الركيزة على شريحة مجهرية ونقله إلى مرحلة المجهر. للزخرفة شرائح الزجاجية بيفوري، إدراج إحباط أسود (مثل قطع غيار إحباط من فوتوماسكس المطبوعة) بين شريحة مجهرية وبيفوري لتوفير خلفية داكنة للطباعة الحجرية.
    3. إدراج عامل تصفية حمراء في المسار الإضاءة، التركيز على سطح الركازة، وانتقل إلى المنطقة الركازة، الذي سوف يتعرض، مثل المنطقة في تلميح الصفر.
    4. إدراج صاحب القناع ومنع الإضاءة وتغيير لتصفية الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 2). ضوء كثافة منخفضة، فتح المصراع واستخدام الكاميرا للتركيز بسرعة القناع على الركازة.
    5. عرقلة مسار الضوء إلى الكاميرا وتُضِيءُ الركيزة في ضوء كثافة عالية لوقت التعرض المرجوة.
    6. أخذ العينة من المجهر بعناية إزالة المخزن المؤقت قدر ممكن من الركازة التجفيف.
    7. إضافة 10-20 ميليلتر من الحمض النووي مع تسلسل ديس. ضع الركيزة في مربع رطب لمنعها من التجفيف. احتضان الحمض النووي على الركازة ح 2 (النوكليوتيد بتركيز ميكرومولار) أو عدة ساعات/المبيت (DNA kbp طوله حوالي 100 نانومتر تركيز) في الرايت
    8. إزالة الحمض النووي من الرقائق وغسله عدة مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x. وبغية الحد من النفايات من الحمض النووي (خاصة بالنسبة للشظايا أطول) وتخزين الحمض النووي مأخوذة من الركازة وإعادة استخدامها.
  3. طباعة حجرية متعددة الخطوات
    ملاحظة: لمحاذاة دقيقة للتعرض اثنين أو أكثر في منطقة واحدة، الاحتفاظ العينة في المرحلة لتجنب اختلال الزاوي. تأكد من أن لا تجف الرقاقة. لتحديد المواقع لعدة فرش الحمض النووي في مناطق مختلفة على الركازة، استخدام مرحلة يجهز لمحرك الأقراص للمنطقة المعينة أو استخدام الركازة مع علامات المحاذاة المناسبة.
    1. بعد التعرض الأول (القسم 3.2)، احتضان الحمض النووي مع تسلسل ديس على الركازة. من المهم أن تشغل جميع مواقع الربط الناتجة عن التعرض الأولى. ولذلك، احتضان النوكليوتيد (10 ميكرون) لما يقرب من 3 ح في الرايت
    2. إلى شل الجينات المسمى ديس، وضعها على الركيزة لعدة ساعات أو بين عشية وضحاها في الرايت، ثم تغسل العينة وإضافة مزيج التخميل لآخر ح 2 في الرايت المضي قدما مع التعرض المقبل.
    3. بالنسبة للتعرض إضافية، كرر الخطوات السابقة (3.2.3-3.3.2).

4-PDMS الأجهزة

ملاحظة: يفضل أن يكون ذلك، العمل في غرفة نظيفة. تصنيع جهاز PDMS يتبع بروتوكول قياسي مثل كما وصفها ماكدونالد et al. 30

  1. تصنيع قوالب رئيسية عن طريق الطباعة التصويرية
    1. تنظيف رقاقة سيليكون (76.2 مم، 525 ميكرون سمك) التي سونيكيشن في الأسيتون لمدة 5 دقائق في السلطة العليا وشطف مع كحول الأيزوبروبيل والماء المتأين الشطب. بعد ذلك ضع الرقاقة على لوحة الساخن عند 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. بشكل اختياري، بغية تحسين التصاق مقاومة ليفر، إضافة 2-3 مل التصاق المروج وتدور 3000 لفة في الدقيقة للحرارة 30 س. يفر إلى 120 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    3. إضافة حول الواقي الضوئي 2-3 مل (انظر الجدول للمواد). تدور يفر 15 s 500 لفة في الدقيقة، ثم 3000 لفة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. وينبغي أن ينتج هذا عن 20 ميكرون طبقة سميكة من مقاوم الضوء. واسمحوا الطبقة مقاوم الضوء الاسترخاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    4. لخبز قبل التعرض، المكان يفر على لوحة الساخن عند 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. مكان يفر تحت النبائط مع خطة للمقصورات. ويفضل استخدام قناع-راصفة. ينبغي أن تكون النبائط بدقة من 64,000 dpi (انظر الملف التكميلي مع أقنعة الطباعة الحجرية والتكميلية القسم 5).
    6. تعريض رقاقة لمدة 1 دقيقة مع الأشعة فوق البنفسجية-الضوء (-السطر 5-10 ميغاواط/سم2) عن طريق النبائط.
    7. لخبز بعد التعرض، المكان يفر عند 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ومن ثم في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. واسمحوا يفر تهدئة والاسترخاء ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    8. مكان يفر في طبق مع المطور لمدة 3 دقيقة بينما التحريض الكأس برفق. شطف يفر مع كحول الأيزوبروبيل والجاف لأنه يحمل بندقية نيتروجين. مكان يفر على صفيحة ساخنة في 130 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  2. إعداد الجهاز PDMS
    1. قاعدة PDMS ميكس و PDMS علاج عامل بنسبة 10:1 وصب على الرقاقة في حاوية مغلقة حتى طبقة من حوالي 5 ملم قد شكلت أعلاه يفر. للحصول على جهاز PDMS سمك 1 مم فقط، بدلاً من ذلك تدور معطفا يفر مع PDMS 100 لفة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
    2. وضع الحاوية في مجفف وتطبيق فراغ (حوالي 85 كيلو باسكال) لمدة حوالي 30 دقيقة. ثم، الحرارة PDMS إلى حوالي 70 درجة مئوية ح 1-2 في فرن.
    3. افصل الجهاز PDMS من يفر. قطع في PDMS إلى ألواح حيث يحتوي كل قطعة مجموعة واحدة من الأجزاء الأخرى. في حالة PDMS سوف تكون متصلاً إعداد موائع جزيئية، لكمه ثقوب (1 مم) كمدخل ومنفذ في نهايات قناة العرض.
    4. تنظيف PDMS مع كحول الأيزوبروبيل والماء المتأين الشطب والجاف لأنه يحمل بندقية نيتروجين. تخزين في PDMS الغبار الحرة.

5-التعبير الجيني مجزأة

ملاحظة: يصف الإجراء التالي الجمعية العامة صاحب العينة (الشكل 3) للمراقبة للتعبير الجيني مجزأة على مجهر مقلوب مع حاضنة قفص للتحكم في درجة الحرارة. الحامل بنيت باستخدام أدوات (3.5-5 مم سميكة من كلوريد البوليفينيل (PVC) البلاستيك ومسامير والمكسرات، الحفر) والمواد متوفرة بسهولة ويمكن تخصيصها لتناسب مختلف أنواع المجاهر. ينبغي إجراء الخطوات الموضحة في 5.1 و 5.2 أن جزأي حائز على استعداد في الوقت نفسه.

  1. أسفل حامل الجمعية
    1. إعداد شريحة بيفر بمحاذاة العلامة (مثل الصفر) والصقه على صاحب الرقائق باستخدام شريط لاصق الوجهين (الشكل 3B). ينبغي أن تكون شرائح أكبر من الجهاز PDMS والذي سيغطي ذلك.
    2. شل واحد أو متعددة الجينات على الرقاقة (انظر المادتين 2 و 3).
    3. إضافة بعض الشحوم فراغ حول الثقب المركزي صاحب القاع، ثم سد في حامل الشريحة.
      ملاحظة: صاحب رقاقة الآن تلتزم صاحب السفلي عن طريق الشحوم، مع الإبقاء على إمكانية لإعادة تحديد المواقع رقاقة في x-y-الطائرة.
  2. الجمعية صاحب أعلى
    1. إعداد شرائح رقيقة على PDMS مع الأجزاء الأخرى باستخدام الإجراء طلاء تدور في خطوة 4.2.1. قطع PDMS صغيرة بقدر الإمكان، تاركاً قناة مفتوحة إلى جانب واحد للسماح لتبادل جزيئات النفايات والسلائف قبل نشرها.
    2. تنظيف زلة غطاء زجاج (24 ملم × 24 مم، رقم 1.5) والمؤخرة من رقاقة PDMS (الجانب دون الأجزاء الأخرى) مع الأكسجين في البلازما ل 42 s (تعمل في 200 W و 0.8 [مبر] مع العينة في قفص فاراداي).
    3. ضع رقاقة PDMS في وسط الشريحة الزجاجية مع الأجزاء الأخرى إلى الأعلى. خبز الزجاج مع PDMS ح 1 عند 70 درجة مئوية.
    4. إضافة بعض الشحوم فراغ حول حفرة كبيرة لصاحب أعلى.
    5. قبل البدء التجربة، تنظيف الشريحة الزجاجية و PDMS رقاقة مع الأكسجين في البلازما ل 42 ثانية لجعل PDMS ماء.
    6. ضع الشريحة الزجاجية مع PDMS على صاحب أعلى ( الشكل 3)، واضغط برفق على الزجاج على الشحوم (الشكل 3).
  3. الجمعية حامل
    1. إعداد 100 ميليلتر من نظام الخلية الحرة التعبير وإبقائه على الجليد.
    2. بعناية إزالة المخزن المؤقت من الرقائق وغسله مرة واحدة مع 10 ميليلتر من التعبير خاليا من خلية النظام. بعد ذلك، إضافة 60 ميليلتر من التعبير خاليا من خلية النظام على الرقاقة وإزالة الغراء سيليكون مكون اثنين من حواف شرائح (بالفعل بإزالة في الشكل 3).
    3. إضافة 20 ميليلتر من نظام التعبير على PDMS. بعد وضع التحقق الحبرية إلى PDMS، بسرعة في مجهر مجسم أن المقصورات أيضا الرطب ودون فقاعات الهواء. إذا كان هناك فقاعات الهواء، محاولة غسلها مع بقية منظومة التعبير خالية من الخلية.
    4. لتجميع الاثنين قطع حامل والتوفيق بين الدوائر وفرش الحمض النووي، والعمل تحت مجهر مجسمة وشل صاحب القاع بذراع القابض، حتى مسامير اثنين و wingnuts بسهولة بكلتا يديه (3D الرقم-F ).
    5. إدراج صاحب أعلى صاحب القاع وخفضه حتى تلتحم قطرات نظام التعبير خالية من الخلية (الشكل 3D). تحقق من خلال مجهر مجسم سواء من المقصورات وعلامة المحاذاة في منطقة مماثلة في x-y-الطائرة، وإلا سحب حامل أعلى وموقف إعادة الزجاج الشريحة على حامل أعلى.
    6. من الأسفل، المسمار wingnuts حتى تلامس الجانب السفلي من الحامل. عناية تشديد wingnuts، بينما المقصورات والرقائق في x-y-الطائرة عن طريق المقبض في الجزء السفلي من صاحب رقاقة (3E الشكل). مرة واحدة في الاتصال، وتشديد wingnuts فقط بلطف جداً (3F الشكل).
      ملاحظة: هذه الخطوة تتطلب بعض الخبرة ويعتمد على الإعداد التجريبية. تحت المجهر، يمكن أن تشير إلى أنماط التدخل الناشئة من السائل بين PDMS والزجاج أن تطبق القوة صغير جداً، بينما خفض كثافة فلورية (من فرشاة الحمض النووي أو البروتينات المعرب عنها) في وسط حجرة يلمح عالية جداً الضغط (انظر أيضا معلومات تكميلية، القسم 6).
    7. رش الأسفنج في الضميمة التبخر المضادة المياه وإدراج الحامل في المربع. ملء حقنه 5 مل مع الغراء اثنين-عنصر السيليكون واستخدامه لختم المربع (الشكل 3).
    8. نقل المربع إلى مجهر التحكم في درجة الحرارة وصورة الفرشاة الحمض النووي، ورد فعل في الفحص المجهري الأسفار. حتى بدون إضاءة، يتلاشى fluorescence الفرشاة الحمض النووي في نظام تعبير خالية من الخلية. ومع ذلك، يحتفظ الفرشاة نشاطها، كما يمكن أن يتضح من التعبير الجيني المتكررة من نفس الفرشاة.
      ملاحظة: عند استخدام شريحة زجاج بيفوري بدلاً من شريحة سيليكون، الموقف (أعلى/أسفل) رقاقة PDMS وبيفوري يمكن تبادلها، يسمح باستخدام الأهداف مع أصغر عامل المسافات.

6-المطرد التعبير في أجهزة موائع جزيئية

ملاحظة: يتم تجميع الإعداد التجريبية من أجزاء هو مبين في الشكل 4A. وترد تفاصيل في الجمعية العامة لمرحلة التحكم في درجة الحرارة في المعلومات التكميلية (القسم 7).

  1. نظام التعبير خالية من الخلية وأنابيب
    1. إعداد نظام التعبير خالية من الخلية في أنبوب عينة (حوالي 200 ميليلتر). يمكن إضافة الخرز البوليسترين المسمى بالأصباغ الفلورية إلى رصد لاحقة معدل التدفق من خلال قناة عرض.
    2. قم بتوصيل الأنبوب تحكم ضغط. ضع الأنبوبة في خزان جليد كبيرة التي تحافظ على البارد لحوالي 12 ساعة. إعادة ملء الجليد إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: كبديل لوحدة تحكم ضغط، يوفر مضخة الحقن بمعدل تدفق ثابت للتعبير خالية من خلية النظام حتى لو تجارب تدفق التغييرات المقاومة، مثلاً بسبب فقاعات الهواء، والتي قد تساعد في الأجل الطويل.
    3. ربط أنبوب يحتوي على نظام التعبير خالية من الخلية إلى PTFE أنابيب (القطر الداخلي من 0.8 ملم)، الذي يصل إلى مرحلة ساخنة. كسر إبرة محقن (قطرها 0.9 مم) إلى قطع 1-2 سم مع نهايات حادة وإدراج قطعة واحدة في الأنبوب PTFE. سيكون لاحقاً بمثابة موصل PDMS. في محاولة للتقليل من طول الأنابيب بين المرحلة والانبوب (الشكل 4).
    4. لتبريد الأنابيب PTFE، التفاف حولها أكبر أنابيب المطاط متصل خزان الماء المثلج ومضخة تمعجية. الشريط لهم جنبا إلى جنب مع اﻻسكتلندي (الشكل 4).
  2. الجمعية صاحب أعلى
    1. تنظيف الجانب المسطح رقاقة PDMS مع الأكسجين البلازما (42 ق) ووضعه على شريحة مجهرية ذات ثقوب تركيب مدخل ومخرج من PDMS (الشكل 4 باء). يمكن حفر الثقوب في الزجاج مسبقاً مع كوب الحفر الرأس. تأكد من أن الدوائر الصغيرة-لا تواجه الشريحة الزجاجية.
    2. تطبيق شريط لاصق الوجهين إلى الجانب المسطح من صاحب PDMS. عصا قطعة من رقائق سوداء (مثلاً من قناع الطباعة حجرية) في المنطقة الواقعة بين اثنين من الثقوب حامل لتجنب الأسفار الخلفية من شريط لاصق.
    3. عصا الشريحة الزجاجية مع رقاقة PDMS للحامل.
    4. علاج PDMS وحامل PDMS مع الزجاج المرفقة الشريحة مع البلازما الأكسجين في بلازما أنظف (42 ق).
    5. تطبيق فراغ الشحوم حول حفرة كبيرة في صاحب أعلى وإدراج حامل PDMS (الشكل 4 باء). الآن يلتزم صاحب PDMS صاحب أعلى، مع الإبقاء على إمكانية لإعادة تحديد موضعها في الاتجاهين س-ص.
    6. توصيل أنابيب PTFE مع موصل إبرة المحقن إلى مدخل للرقاقة PDMS. لتسهيل الوصول إلى PDMS عن طريق صاحب أعلى، يمكن إزالة لوحة بلاستيكية العلوي بإيجاز لهذا، وفي الخطوة التالية.
    7. إدراج قطعة ثانية من PTFE أنابيب (حوالي 5 سم) مع موصل إبرة حقنه عند المنفذ (الشكل 4).
    8. موقف صاحب PDMS في صاحب أعلى ولذلك فحر في التحرك في جميع الاتجاهات. مثل مكان صاحب أعلى فضفاضة على خشبة المسرح ساخنة في 4E الشكل دون تشديد أي wingnuts.
    9. مع المجهر، انتقل إلى موقف المقصورات PDMS ومركز لهم في مجال الرؤية للكاميرا. لا تقم بتحريك المرحلة من هذه النقطة.
    10. إزالة صاحب أعلى مع PDMS من المسرح.
  3. مرحلة ساخنة والشرائح الزجاجية بيفر
    1. تعيين درجة الحرارة لمرحلة ساخنة إلى 37 درجة مئوية
    2. الصق شريحة زجاجية بيفر (رقم 4) بريشة الجينات إلى مرحلة التحكم في درجة الحرارة من المجهر المقلوب الأسفار باستخدام شريط لاصق الوجهين مزدوجة، مع علامة المحاذاة تقريبا في مركز مجال الرؤية المجهر. ويضمن هذا الموضع علامة المحاذاة أن المقصورات سينزل تقريبا لنفس المنطقة.
    3. التقاط صورة في قناة fluorescence المقابلة للفرشاة الجينات ومارك موقفها في صورة الكاميرا.
    4. إزالة المخزن المؤقت من الفرشاة الجينات، ولكن لا تدع ذلك يذهب الجافة. إضافة 20 ميليلتر للنظام الخليوي-حرية التعبير للفرشاة الجينات واستخدام الملقط لإزالة الإطار غراء السيليكون.
  4. الجمعية للإعداد موائع جزيئية
    1. إضافة ضغط إلى أنبوب عينة حتى التعبير خالية من خلية النظام قد سدت أنابيب PTFE، ويظهر في الجزء السفلي من الجهاز PDMS. بالإضافة إلى ذلك، "الماصة؛" 10 ميليلتر من نظام التعبير خالية من الخلية على الصغير-الدوائر على PDMS. تأكد من المقصورات أحرار من فقاعات الهواء.
    2. بعناية أقل صاحب أعلى على شريحة زجاجية ومحاذاة الصغرى-الدوائر مع الفرشاة الجينات. قبل مارك PDMS والمحاذاة من الوصول إلى نفس المستوى البؤري، استخدام مسامير صغيرة في الجزء الخلفي من صاحب PDMS لمحاذاة x-y-الموقف والتوجه للجهاز PDMS مع الفرشاة الجينات (4E الشكل) بشكل دقيق.
    3. تعقد الموقف واضغط PDMS على شريحة الزجاج بتشديد wingnuts على طول المسامير التي تربط صاحب أعلى إلى مرحلة مجهر (4E الشكل).
    4. زيادة الضغط في الأنبوب الذي يحتوي على التعبير خالية من خلية النظام ومراقبة تدفق الخرز الفلورسنت من خلال قناة الإمداد (تدفق يوصي بمعدلات تتراوح بين 0.5 إلى 5 ميليلتر للساعة الواحدة) (الشكل 4F). إذا لزم الأمر، زيادة ضغط PDMS على الزجاج بتشديد wingnuts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الطباعة الحجرية خطوتين: يبين الشكل 5 نتيجة لعملية من خطوتين معدني على شريحة زجاجية مع تداخل أنماط من خيوط ديس المسمى فلوريسسينتلي.

التعبير بروتين فلوري من فرشاة جينات: الشكل 6 يوضح التعبير عن البروتين الفلورسنت يبيت من الحمض النووي المعطل تداولها. في نقاط عدة في الوقت قمنا بتقييم معدل التعبير الجيني جزئيا تبيض البروتين الفلورسنت ومراقبة استرداد إشارة الأسفار، متجاهلة الإنعاش الفوري، التي لم تنجم عن التعبير البروتين. بعد تبيض الأولى في ساعتين تعبير، كثافة fluorescence تعافي بسرعة وارتفع فوق القيمة الخاصة به قبل تبيض. وبعد أربع وست ساعات، لم يسترد الأسفار إلى شدته السابقة، مشيراً إلى أن رد فعل أنهى دون توفير مزيج التعبير الطازجة، بعد ما يقرب من 3-4 ح.

اقتران إلى ميكروفلويديكس: التعبير الجيني يمكن أن تستمر على مدى فترات زمنية أطول بتزويد مقصورات التعبير مع جزيئات السلائف إضافية عن طريق ميكروفلويديكس. يبين الشكل 7 هذا نظام، مما يتيح التعبير عن يبيت أكثر من 10 ح.

TIRF المراقبة: بيفر يمكن أن تطبق أيضا على دراسة التفاعل بين البروتينات المسماة فلوريسسينتلي مع فرشاة الحمض النووي على مستوى جزيء واحد. لا سيما في بيئة صاخبة، والطباعة الحجرية يساعد على التمييز بين التفاعل محدد وغير محدد بالفرشاة أو السطح، على التوالي. الرقم 8 يعطي هذا مثال، مع المسمى فلوريسسينتلي T7 الحمض النووي الريبي بوليميراز ملزمة أو التمسك بشكل تفضيلي الفرشاة الحمض النووي مقارنة بالسطح المحيطة بها.

Figure 1
الشكل 1 : بيفوري التصويرية. ألف الركازة مع سطح من ثاني أكسيد السيليكون (SiO2) مغطاة بطبقة من البولي إثيلين بيوتينيلاتيد غليكول (شماعة-بريتيش تيليكوم)، الذي هو متوافق حيويا ويسمح لإلحاق فوتوكليفابل الحمض النووي دبوس عبر البيوتين-streptavidin التفاعلات. هنا، جهاز كمبيوتر يحتوي على تسلسل المجالات abcb * وتعديل فوتوكليفابل (نجمة الأرجواني) وهو تهجين حبلا PH مع المجال *. ب إنارة "الأشعة فوق البنفسجية" (الأشعة فوق البنفسجية) كليفس PC، الإفراج عن جزء من الحمض النووي (cb *) في الحل. ج-د منطقة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل الناتجة عن الإيدز PC (ب) تويهولد لتشريد الأس الهيدروجيني بمسمى فلوريسسينتلي (نجمة خضراء) حبلا ديس. هاء أيضا أطول، وتقطعت مزدوج الحمض الخلوي الصبغي ("قالب") يمكن إرفاق إلى السطح منقوشة. مثل الحمض النووي هو أعده PCR مع كتاب يحمل تسلسل ديس في 5 ' نهايته، حيث التمهيدي وديس مفصولة بفاصل تريثيليني غليكول إبقاء ديس واحد-الذين تقطعت بهم السبل أثناء بكر (انظر أيضا معلومات تكميلية، والفرعان 2-4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 2
الشكل 2 : نموذج التحضير للطباعة التصويرية. ألف وضع رقاقة بيفوري مع علامة محاذاة على شريحة مجهرية أو حامل شريحة أخرى (مثل حامل في الشكل 3). تطبيق الغراء سيليكون مكون اثنين كحاجز مسعور على طول حواف شرائح (الخطوات 3.1.2-3). ب- مكان القناع على حامل قناع. هنا، يمكننا إزالة قزحية العين لإيقاف الحقل وتعديل لحاملها حتى يمكن عقد القناع بمغناطيس صغير. لمحاذاة دقيقة (الزاوي) في طباعة حجرية متعددة الخطوات، ضمان أن محاذاة علامات على الحامل ومطابقة قناع (الخطوة 3.2.1). جيم للتنقل على الرقاقة ومحاذاة القناع مع علامات محاذاة على الرقاقة، الشريحة في تصفية الحمراء. للتعرض للأشعة فوق البنفسجية، إدراج تصفية الأشعة فوق البنفسجية (الخطوات 3.2.2-5). الشكل المستنسخ من "المعلومات الداعمة" ل العمل السابق27. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : جمعية حامل للمراقبة للتعبير الجيني مجزأة. ألف أجزاء حامل (وحدة المسطرة: سم). ب-C. يتم تجميع الجزء العلوي والسفلي لصاحب كل على حدة، مع صاحب السفلي تحمل شريحة بيفر منقوشة (الفرع 5، 1) وصاحب أعلى تحمل رقاقة PDMS مع الأجزاء الأخرى (الفرع 5-2). د-f. رقاقة و PDMS بعناية تجلب إلى اتصال ضيقة، بينما في نفس الوقت مراقبة وتكييف المقصورات وفرش الحمض النووي في مجهر مجسم (الخطوات 5.3.1-6). زاي قبل نقل صاحب إلى مجهر المقلوب، والتحكم في درجة الحرارة، يتم تغليف النظام بأكمله في مربع المضادة تبخر (الخطوات 5.3.7-8). الشكل المستنسخ من "المعلومات الداعمة" ل العمل السابق27. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : حامل موائع جزيئية الإعداد وعينه للتعبير الجيني مجزأة. ألف أجزاء من صاحب العينة، الجهاز PDMS ومرحلة مجهر التحكم في درجة الحرارة والشريحة الزجاجية بيفوري (وحدة المسطرة: سم). باء- شريحة مجهرية تحمل PDMS مع الأجزاء الأخرى لصقها على حامل PDMS وتتعرض للأكسجين في البلازما جنبا إلى جنب مع PDMS في بلازما أنظف. PDMS ثم إدراج صاحب أعلى (الخطوات 6.2.2-5). (ج) التعبير خالية من خلية النظام أنبوب متصل بوحدة تحكم بضغط وعلى الجليد. يتم تبريد الأنابيب (خط متقطع أحمر في اقحم) لنظام التعبير الخلية خالية من المطاط الأنابيب (خط متقطع الأزرق) من خلال ضخ الماء المثلج الذي بمضخة تمعجية (القسم 6.1). د الأنبوب متصل بموقع مدخل على الجهاز PDMS. قطعة أخرى من أنابيب متصل بالمنفذ (الخطوات 6.2.6-7). ه- صاحب أعلى على مرحلة مجهر وخفضت بعناية نحو الشريحة بيفوري. يمكن نقل صاحب PDMS لا يزال في x-y-الطائرة محاذاة المقصورات في PDMS مع الفرشاة الجينات على رقاقة بيفوري. Wingnuts تستخدم للصحافة PDMS على رقاقة بيفر وإصلاح صاحب أعلى إلى مرحلة مجهر (الخطوات 6.4.1-3). واو خالية من خلية النظام التعبير يتم ضخها من خلال القنوات-الصغرى في PDMS والتعبير الجيني من فرش الحمض النووي يمكن رصدها في ابيفلوريسسينسي المجهري (الخطوة 6.4.4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : التصويرية خطوتين. ألف-باء فلوريسسينتلي المسمى النوكليوتيد (الأخضر: 532 أتو؛ والأحمر: أليكسا فلور 647) بشكل متتابع المعطل تداولها في بيفوري زجاج شريحة عن طريق قناع إسقاط الطباعة حجرية مع التعرض لأوقات س. 45 جيم تراكب سوبفيجوريس A و B، مما يدل على محاذاة دقيقة للتعرض واحد. تغيير حجم أشرطة: 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : تجزئة التعبير الجيني. ألف الفرشاة "بالحمض النووي" على شريحة زجاج بيفوري (وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية: 2 دقيقة)، والترميز للبروتين الفلورسنت يبيت يتماشى مع حجرة على رقاقة PDMS (انظر الفرع 5 و الشكل 3). ب التعبير الجيني في الدائرة مع الحمض النووي أسفرت عن إشارة قوية الأسفار بتدرج تركيز بروتين تشكيل على طول قناة، التي ترتبط الدائرة إلى مزيج التعبير خارج الجهاز PDMS. وظلت دائرة المراقبة دون الجينات المعطل تداولها مظلمة نسبيا. جيم Fluorescence كثافة الشخصية على مر الزمن لكلا المجلسين. كل ساعتين بروتين فلوري كان جزئيا المبيضة (الأسهم السوداء) للتحقق من ما إذا كان التعبير لا تزال نشطة. بعد ح 4، لم يسترد الأسفار إلى شدته السابقة، تشير إلى أن التعبير قد انتهت. تغيير حجم أشرطة: 300 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : التعبير الجيني مجزأة مستمرة. ألف الفرشاة "بالحمض النووي" على شريحة زجاج بيفوري (وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية: 2 دقيقة)، الترميز يبيت يتماشى مع حجرة على رقاقة PDMS. المقصورات متصلة بقناة عرض (السهم الأبيض) من خلاله يتم ضخ التعبير خالية من خلية النظام (انظر القسم 6 و الشكل 4). باء المقصورة التي تحتوي على فرشاة الجينات يظهر إشارة الأسفار من التعبير يبيت (باللون الأخضر) حسب نظام التعبير الجيني الخلية الحرة. وما زال المقصورة المجاورة دون فرشاة جينات مظلمة نسبيا. مكونات الطازجة نظام الخلية الحرة التعبير تتدفق من خلال قناة الإمداد ومنتشر في المقصورات، بينما يتم نقل النفايات بعيداً. جيم Fluorescence كثافة الشخصية على مر الزمن لكلا المجلسين. كانت المبيضة البروتينات الفلورية جزئيا في نقاط مختلفة في الوقت المناسب (الأسهم السوداء) للتحقق من ما إذا كان التعبير لا تزال نشطة. بسبب تدفق في قناة الإمداد، الحفاظ على التعبير الجيني لمالا يقل عن 10 حاء (الذروة في تتبع الأحمر تميزت السهم الأحمر سببه فقاعة هواء التي استنزفت الحل من المقصورات مؤقتاً). تغيير حجم أشرطة: 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8 : دراسات جزيء واحد في بيفوري الزجاج الشرائح في التفكير الداخلية مجموع الأسفار مجهرية (تيرفم). ألف تيرفم الهدف من نوع يمكن تصوير جزيء واحد قريب من الواجهة الزجاجية-المياه. نحن المعطل تداولها الجينات المسمى فلوريسسينتلي (الأخضر، أتو 532، وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية: 2 دقيقة) مع T7 مروج على طول ليثوجرافيكالي تعريف المشارب ولاحظ سلوك T7 رنا بوليميراز (البرتقال، المسمى مع أليكسا فلور 647) تتفاعل مع السطح. ب الفلورية صورة عرض شرائط اثنين من الجينات المعطل تداولها. جيم T7 رنا بولمرس نعلق على وجه التحديد وعدم التحديد إلى السطح (صورة مفردة، وقت التعرض 50 مللي ثانية). د يعرض صورة متوسط التي تم الحصول عليها من كل الإطارات من الأسفار الفيديو (إطارات 5,000 مثل في سوبفيجوري ج) تفاعل بوليميريز الحمض النووي الريبي محددة مع الفرشاة الحمض النووي. تغيير حجم أشرطة: 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطباعة الحجرية بيفر تقنية قوية وتنوعاً لتجميد منقوشة من الحمض النووي الريبي أو. حتى الآن، الإجراء الذي يتضمن العديد من الخطوات، التي-إذا تغيرت--يمكن أن تكون مصدرا للفشل أو تخفيض أداء النظام.

هو خطوة حاسمة في تصنيع رقائق بيفوري بيجيلاتيون الركازة، الذي يوفر في توافق مع الحياة السطح. هنا، خطوة التنظيف مع إجراء تقييم النتائج والكفاءات الهامة، حيث أنه ينشط أيضا على السطح سيلانيزيشن اللاحقة. يجب أن تجف الركيزة لا، في أثناء بيجيلاتيون الفعلي، في أن. وعلاوة على ذلك، يجب أن يتم تخزين سيلاني-شماعة-البيوتين بشكل صحيح للاحتفاظ مفاعليه (القسم 1-2) وتجنب كروسلينكينج. لتقييم نتائج بيجيليشن، يمكن المحتضنة مع ستريبتافيدين فلوريسسينتلي المسمى ركائز ومقارنة بعناصر غير سي. بنجاح يجب ربط ركائز سي ستريبتافيدين أكثر بكثير من عناصر التحكم.

أيضا، في المراحل اللاحقة من عملية معدني، تجفيف شرائح قد آثار ضارة، الناتج مثلاً في إزالة الحمض النووي منضم مسبقاً أو امتزاز أعلى من الحمض النووي إلى مناطق لم يتعرضوا على الركازة.

كما ذكر أعلاه (القسم 3.2)، القرار عملية معدني وأوقات التعرض اللازمة تعتمد على الإعداد التجريبية (والهدف، ومصدر الضوء، إلخ). ولذلك، في خطوة أولى، ينبغي اختبار مجموعة واسعة من أوقات التعرض.

لإجراء التجارب على التعبير الجيني، ينبغي تخصيص الإعداد التجريبية لتناسب الأجهزة المتوفرة (مجهر، والتحكم في درجة الحرارة، إلخ). أظهرنا أن اثنين من هذه التطبيقات، وواحد لتجارب قصيرة (ح 4، القسم 5)، حيث تم تغليف النظام في مربع للحد من تبخر مزيج التعبير، وواحد للمراقبة طويلة (المادة 6)، حيث تم تمكين جهاز موائع جزيئية مستمرة إمدادات جزيئات السلائف. وفي كلتا الحالتين، فرش المحاذاة للحمض النووي في الركيزة والمقصورات في PDMS يمثل الخطوة الأصعب. ولذلك نوصي بمحاولة هذه الخطوة عدة مرات مع الركازة دمية قبل استخدام أحد منقوشة (انظر أيضا معلومات تكميلية، القسم 6). في الجمعية العامة لأنظمة كبيرة من الجينات المتميزة الفرش، وأوقات الاحتضان طويلة، محاذاة دقيقة الزاوي للدوائر وفرش عبر مسافات طويلة، والتلوث الامتزاز من الحمض النووي للمناطق غير منقوشة اعتماداً على نوعية تخميل، قد وتشكل القيود المفروضة على الحجم أنظمة قابلة للتطبيق عمليا.

وقد تجلى بديل إلى هذا الأسلوب كارزبرون et al. 25، الذي قام بإنشاء أقسام في رقاقة بالحث يقترن البلازما التفاعلي أيون النقش (بوش عملية)، يليه ترسب بخار المزودة بالبلازما (بيكفد) من طبقة ثاني أكسيد السيليكون. بعد الروغان السطحية والزخرفة وإيداع قطرات الحامض النووي نانولتر بروبوت بيبيتينج، أغلقت المقصورات مع شريحة زجاجية مغطاة PDMS. ويمتاز هذا الإجراء أن الحمض النووي يمكن أن تكون معطلة مباشرة داخل المقصورات دون الخطر تلويث القريبة الدوائر، لكنه يتطلب خطوات تصنيع إضافية ومعدات المختبرات.

البروتوكول المعروضة هنا يتيح للباحثين العاملين في البيولوجيا التركيبية الخلية الحرة لنقل نظمها الخاصة بالدراسة من الأجهزة المستندة إلى حل لرد الفعل القائم على رقاقة الحاويات. يتيح استخدام الحمض النووي حبلا التشرد كخطوة المركزي أثناء تطوير مقاومة وضع العلامات في المناطق المكشوفة مع تسلسل الحمض النووي فريدة من نوعها، التي توفر نهجاً سهلة الطباعة الحجرية متعددة الخطوات متوافق حيويا. يسمح تركيبة مع ميكروفلويديكس مراقبة الجينات عمليات التعبير على مدى فترات طويلة من الزمن. وبصرف النظر عن تحقيق عمليات التعبير خالية من الخلية الجينات تحت ظروف التدفق فتح مفاعل، يمكن استخدام نفس المنهجية شل وتنظيم الجزيئات الحيوية الأخرى على سطح رقاقة مكانياً. هذا ينبغي أن تكون مفيدة لمجموعة متنوعة واسعة من الدراسات الفنية والفيزيائية، مثل كما أثبتت التجارب المستندة إلى الأسفار جزيء واحد هنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونعترف مع الامتنان الدعم المالي لهذا المشروع "ستيفتونغ فولكس واجن" (منحة رقم 89 883) و "مجلس البحوث الأوروبي" (اتفاق منحة رقم 694410-عدنا). س. م. س. وتسلم الدعم المقدم من DFG من خلال GRK 2062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4 Menzel 22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5 Assistent 24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane Laysan Bio MW 5,000
Anhydrous toluene Sigma Aldrich (Merck) 244511
Streptavidin Thermo-Fisher Scientific S888
DNA Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress New England Biolabs E6800S Cell-free expression system
PDMS  Dow Corning Slygard 184
FluoSpheres Thermo-Fisher Scientific F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) Bola S 1810-10
EpoCore 20 micro resist technology GmbH Photoresist
mr-Dev 600 micro resist technology GmbH Photoresist developer
Ti-Prime MicroChemicals Adhesion promoter
Two-component silicon glue Picodent Twinsil 
UV-protection yellow foil Lithoprotect (via MicroChemicals) Y520E212
Equipment
Masks for photolithography Zitzmann GmbH 64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope Olympus BX51 Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera Photometrics Coolsnap HQ Used with Olympus BX51
Ligtht source EXFO X-Cite 120Q Used with Olympus BX51
Inverted microscope Nikon Ti2-E Fluorescence imaging of gene expression
4x objective Nikon CFI P-Apo 4x Lambda Used with Nikon Ti2-E
Camera Andor Neo5.5 Used with Nikon Ti2-E
Light source Lumencor SOLA SM II Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator Okolab bold line Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller Elveflow OB1 MK3
NanoPhotometer Implen DNA concentration measurement
Plasma cleaner Diener Femto 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
  3. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
  4. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
  5. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
  6. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  7. Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
  8. Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
  9. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  10. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
  11. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  12. Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
  13. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
  14. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
  15. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  16. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
  17. Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
  18. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  19. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
  20. van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
  21. Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
  22. Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
  23. Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
  24. Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
  25. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
  26. Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
  27. Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
  28. Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
  29. Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
  30. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).

Tags

الهندسة الحيوية، المسألة 140، الخلية الحرة، والتعبير الجيني، والبيولوجيا التركيبية، biochips، الطباعة الحجرية، ميكروفلويديكس، التشرد حبلا الحمض النووي
تجميد سطح الوظيفية للجينات باستخدام الطباعة الحجرية التشرد حبلا متعددة الخطوات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pardatscher, G., Schwarz-Schilling,… More

Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Sagredo, S., Simmel, F. C. Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography. J. Vis. Exp. (140), e58634, doi:10.3791/58634 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter