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Bioengineering

कार्यात्मक सतह-Multistep कतरा विस्थापन लिथोग्राफी का उपयोग कर जीन के स्थिरीकरण

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58634
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Physics Department, Technical University of Munich
* These authors contributed equally

Summary

हम एक सतह पर जीन लंबाई डीएनए अणुओं के स्थिरीकरण के लिए एक सरल lithographic प्रक्रिया का वर्णन है, जो सेल से मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों पर प्रदर्शन किया जा सकता है ।

Abstract

lithographically संरचित सतहों पर जीन के स्थिरीकरण एक खुले microfluidic में compartmentalized जीन अभिव्यक्ति प्रक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देता है । कृत्रिम सेलुलर सिस्टम की दिशा में अंय दृष्टिकोण के विपरीत, इस तरह के एक सेटअप जीन अभिव्यक्ति रिएजेंट और अपशिष्ट उत्पादों के एक साथ draining के साथ एक सतत आपूर्ति के लिए अनुमति देता है । यह समय की विस्तारित अवधि, जो गतिशील जीन विनियामक प्रतिक्रिया प्रणाली की प्राप्ति के लिए महत्वपूर्ण है पर सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रक्रियाओं के कार्यांवयन की सुविधा । यहां हम आनुवंशिक के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए एक सरल उपयोग lithographic तकनीक का उपयोग करने के लिए डीएनए किनारा विस्थापन प्रतिक्रियाओं, जो विशेष रूप से व्यावसायिक उपलब्ध घटकों का उपयोग करता है के आधार पर चिप । हम भी एक polydimethylsiloxane (PDMS) आधारित microfluidic प्रणाली के साथ compartmentalized जीन के एकीकरण पर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इसके अलावा, हम बताते है कि प्रणाली कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी है, जो डीएनए और अभिव्यक्ति मिश्रण में निहित अणुओं के बीच आणविक बातचीत के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ संगत है ।

Introduction

सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं जैव रसायन, बायोटेक्नोलॉजी, और सिंथेटिक जीव विज्ञान में विभिंन अनुप्रयोगों के लिए बहुत रुचि के हैं । प्रोटीन की कोशिका मुक्त अभिव्यक्ति शुद्ध प्रोटीन के नमूनों की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी, जो संरचनात्मक जीवविज्ञान में कई अध्ययनों के लिए आधार थे । उदाहरण के लिए, सेल मुक्त प्रणालियों सफलतापूर्वक प्रोटीन परिसरों1 या झिल्ली प्रोटीन2, जो सेल आधारित अभिव्यक्ति का उपयोग कर उत्पादन करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया गया । विशेष रूप से, सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं को भी आनुवंशिक कोड की संरचना स्पष्ट, Nirenberg और Matthaei द्वारा groundbreaking प्रयोगों के साथ शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया गया १९६१3।

हाल ही में, वहां जैव प्रौद्योगिकी और सिंथेटिक जीवविज्ञान4,5,6में सेल मुक्त तरीकों में एक नए सिरे से ब्याज दिया गया है । सेल मुक्त प्रणालियों गैर जैविक यौगिकों के साथ संवर्धित किया जा सकता है, और विविध जैविक मूल के घटकों और अधिक आसानी से जोड़ा जा सकता है7। हालांकि सेल मुक्त प्रणालियों स्पष्ट नुकसान है कि वे "नहीं बढ़ने और विभाजन" है, यह बुनियादी चयापचय कार्यों के साथ खुले सेल मुक्त reचयापचयोंs तैयार करने के लिए कल्पना है और उंहें जब सरल कार्बन और ऊर्जा के साथ प्रदान की संश्लेषित करते है आदानों8. सिंथेटिक जीव विज्ञान के उभरते क्षेत्र के भीतर, सेल मुक्त प्रणालियों सिंथेटिक जैविक कार्यों के कार्यांवयन के लिए एक और अधिक पूर्वानुमान "चेसिस" होने का वादा ।

वर्तमान में, सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं बाहर किया जाता है या तो (जैसे बैक्टीरिया, खमीर, कीड़ों के रूप में विभिंन स्रोतों से) सेल निष्कर्षों का उपयोग कर, या प्रतिलेखन/अनुवाद प्रणाली है जो विभिंन अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित थे (जैसे, prokaryotic बनाम eukaryotic जीन अभिव्यक्ति, झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन, आदि) । बैक्टीरियल कोशिका निकालने की तैयारी के लिए एक लोकप्रिय प्रोटोकॉल (आमतौर पर अवधि TXTL) वी Noireaux और सहकर्मियों9द्वारा हाल ही में प्रदान किया गया था । इसके जैव भौतिक गुणों को अच्छी तरह से किया गया है10विशेषता है, और TXTL प्रणाली पहले से ही उपयोग किया गया है सफलतापूर्वक जटिल रासायनिक कार्यों की एक श्रृंखला करने के लिए: जैसे, कार्यात्मक bacteriophages के विधानसभा के माध्यम से फेज जीनोम के सेल मुक्त अभिव्यक्ति11, बैक्टीरियल प्रोटीन के संश्लेषण12, या सेल मुक्त जीन सर्किट के कार्यांवयन13,14।

एक अंय प्रणाली सेल में लोकप्रिय मुक्त सिंथेटिक जीवविज्ञान शुद्ध प्रणाली है, जो15,16शुद्ध घटकों से पुनर्गठन किया जाता है । TXTL प्रणाली की तुलना में, यह nucleases या प्रोटीन क्षरण मशीनरी शामिल नहीं है । जबकि रैखिक डीएनए के क्षरण, आरएनए अणु या प्रोटीन शुद्ध प्रणाली में एक मुद्दे के कम है, क्षय मार्ग गतिशील कार्यों के कार्यांवयन के लिए वास्तव में महत्वपूर्ण हैं । आदेश में TXTL प्रणाली (RecBCD के माध्यम से) में रैखिक जीन टेम्पलेट्स के exonuclease क्षरण के प्रभाव को कम करने के लिए, अंत GamS प्रोटीन की रक्षा करने के लिए जोड़ा जाना है । TXTL और शुद्ध प्रणाली दोनों ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।

एक विषय बारीकी से सेल से संबंधित मुक्त जीवविज्ञान जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं पर compartmentalization के प्रभाव के अध्ययन की चिंताओं, और आगे कृत्रिम कोशिका की तरह संरचनाओं के निर्माण या protocells17,18,19 ,20. कृत्रिम कोशिकाओं पर अनुसंधान आमतौर पर फॉस्फोलिपिड या अंय amphiphiles से बने vesicular डिब्बों के अंदर एक जैव रासायनिक प्रतिक्रिया प्रणाली के encapsulation शामिल है । जबकि ऐसे सिस्टम compartmentalization, या सेलुलर और आत्म-नकल संरचनाओं के उद्भव के बुनियादी पहलुओं का पता लगाने में मदद, वे बंद प्रणालियों के विशिष्ट समस्याओं का सामना: एक कार्य चयापचय और उपयुक्त के अभाव में झिल्ली परिवहन तंत्र, यह compartmentalized प्रतिक्रियाओं समय की विस्तारित अवधि के लिए चल रहा रखने के लिए मुश्किल है-ईंधन अणुओं का उपयोग किया जाता है और अपशिष्ट उत्पादों जमा ।

इस तरह के सेल नकल उतार डिब्बों के अंदर compartmentalization के लिए एक दिलचस्प विकल्प आनुवंशिक सामग्री के स्थानिक संगठन photolithographic तरीकों का उपयोग कर रहा है । एक चिप पर "जीन के स्थिरीकरण" Weizmann संस्थान में बार-Ziv समूह द्वारा अग्रणी था और अधिक से अधिक दस साल पहले21। जिन प्रमुख मुद्दों को सुलझाया जाना था उनमें डीएनए की गैर-विशिष्ट सोखना और चिप सतह पर प्रोटीन की संभावित विकार थीं. बार-Ziv एट अल. विकसित एक समर्पित photolithography विरोध "डेज़ी", जो सिलिकॉन डाइऑक्साइड सतहों पर प्रतिरोध अणुओं के स्थिरीकरण के लिए एक प्रतिक्रियाशील टर्मिनल silane से बना था, एक लंबी पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) स्पेसर कि आश्वासन दिया , और एक photocleavable headgroup, जो पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के साथ विकिरण पर प्रतिक्रियाशील अमीन में परिवर्तित किया गया था । यह दिखाया गया है कि डेज़ी जीन लंबाई डीएनए अणुओं (कई किलो आधार-जोड़े (kbp) की लंबाई के साथ) एक चिप सतह पर स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । देखने का एक बहुलक भौतिकी बिंदु से, सिस्टम बहुलक एक ठोस सब्सट्रेट पर भ्रष्टाचारी ब्रश का प्रतिनिधित्व किया । डीएनए के polyelectrolyte प्रकृति के कारण, इन ब्रश के अनुरूप आसमाटिक और अंय आयन विशेष प्रभाव22,23से दृढ़ता से प्रभावित है ।

सबसे महत्वपूर्ण बात, यह है कि सब्सट्रेट-मैटीरियल जीन अभी भी कार्यात्मक है और लिखित और आरएनए और प्रोटीन में अनुवाद किया जा सकता है दिखाया गया है । जीन ब्रश समाधान24से आरएनए polymerases के लिए सुलभ हैं, और प्रतिलिपि/अनुवाद के जटिल macromolecular मिश्रण सतह पर विकृत नहीं है । एक सब्सट्रेट पर आनुवंशिक घटकों के स्थिरीकरण के लाभों में से एक यह है कि वे एक खुले microfluidic रिएक्टर प्रणाली है कि लगातार छोटे अग्रदूत अणुओं और जो अपशिष्ट उत्पादों से25 हटाया जा सकता है के साथ आपूर्ति की जाती है में संचालित किया जा सकता है , 26.

हम हाल ही में इस विधि का एक संस्करण विकसित Bephore (के लिए संगत इलेक्ट्रॉन-बीम और photoresist)27, जो विशेष रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों और उपयोग अनुक्रम विशेष डीएनए किनारा आक्रमण प्रतिक्रियाओं पर आधारित था के लिए चिप आधारित कृत्रिम कोशिकाओं के निर्माण के लिए एक सरल-को-लागू multistep लिथोग्राफी प्रक्रिया की प्राप्ति । प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध ओवरव्यू चित्र 1में दिखाया गया है । यह डीएनए hairpin अणुओं पर आधारित होता है जिसमें एक photocleavable समूह होता है, जो एक सुसंगत खूंटी परत पर मैटीरियल होता है । hairpin के Photocleavage एक एकल-कतरा toehold अनुक्रम को उजागर करता है, जिसके माध्यम से ब्याज की डीएनए अणु ("" जिले अनुक्रम की जगह ") toehold मध्यस्थता किनारा आक्रमण के माध्यम से संलग्न किया जा सकता है युक्त ।

जबकि Bephore संभावित लागू करने के लिए आसान है, डेज़ी बहुत घने और साफ "जीन ब्रश" है, जो कुछ अनुप्रयोगों में लाभ है की प्राप्ति की अनुमति देता है । सिद्धांत रूप में, तथापि, डेज़ी और Bephore लिथोग्राफी आसानी से संयुक्त किया जा सकता है । सोने पर डीएनए ब्रश संरचना के लिए डीएनए किनारा विस्थापन का उपयोग एक संबंधित लिथोग्राफी विधि पहले हुआंग एट अलद्वारा विकसित किया गया था, लेकिन सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति28,29के संदर्भ में उपयोग नहीं किया गया था ।

निंनलिखित प्रोटोकॉल में हम Bephore विधि का उपयोग सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति के लिए डीएनए ब्रश के उत्पादन का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं । हम वर्णन कैसे जीन चिप्स गढ़े है और बहु के उपयोग के लिए कदम फोटो-एक चिप पर जीन के स्थानिक संरचित स्थिरीकरण के लिए लिथोग्राफी का प्रदर्शन । हम भी प्रतिक्रिया मंडलों के निर्माण और पर चिप जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं के प्रदर्शन के लिए microfluidics के आवेदन पर चर्चा की ।

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Protocol

नोट: विभिन्न अनुभागों में चरणों के लिए एक समय अनुसूची अनुपूरक जानकारी (खंड 1) में दी गई है.

1. चिप निर्माण

नोट: के रूप में सब्सट्रेट, सिलिकॉन डाइऑक्साइड या ग्लास स्लाइड की एक ५० एनएम मोटी परत के साथ सिलिकॉन वेफर्स (१०० mm व्यास, ०.५२५ mm मोटाई) का उपयोग करें (24 मिमी x 24 मिमी, no. १.५; 22 मिमी x ५० मिमी, no .4) । आवेदन के आधार पर, अन्य आकारों और मोटाई अधिक उपयुक्त हो सकता है.

  1. एक आरसीए स्वच्छ प्रक्रिया के माध्यम से सब्सट्रेट सफाई (पानी, अमोनिया समाधान एनएच3(वायु) 30% और हाइड्रोजन पेरोक्साइड एच2हे2 30%, एक अनुपात 5:1:1 पर)
    1. एक चोंच वाले गिलास में पानी और अमोनिया का घोल मिलाएं और चमचे से गर्म करते हुए एक गरम प्लेट पर ७० डिग्री के मिश्रण को गरम करें ।
    2. हाइड्रोजन पेरोक्साइड और सब्सट्रेट जोड़ें । उच्च प्रवाह के लिए, एक polytetrafluoroethylene (PTFE) धारक में कई सब्सट्रेट (विशेष रूप से छोटे शीशे स्लाइड) रखें ।
    3. 30 मिनट के बाद, बाहर सब्सट्रेट ले, एक धोने की बोतल से पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला, और यह एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ सूखी । तुरंत सब्सट्रेट के PEGylation के साथ आगे बढ़ें ।
      चेतावनी: त्वचा और आंख संरक्षण पहनते है और एक धुएं डाकू में काम करते हैं । बंद करो अपशिष्ट कंटेनर कसकर आदेश में मिश्रण से गैस रिलीज के लिए अनुमति देने के लिए ।
  2. सब्सट्रेट के PEGylation
    नोट: दोहराया ठंड और बायोटिन की गल-खूंटी-Silane स्टॉक हवा नमी के संघनित्र के कारण Silane की प्रतिक्रिया कम कर देता है । इसलिए, उपयुक्त मात्रा में बायोटिन-पेग-Silane (उदा. 10-20 मिलीग्राम) के साथ 5 मिलीलीटर-ट्यूब तैयार करें और उन्हें उपयोग तक जमने से पहले ड्राई आर्गन के साथ भरें ।
    1. घुल बायोटिन-खूंटी-Silane सूखी टोल्यूनि में भंवर द्वारा (5 मिलीग्राम/
    2. एक धुएं हूड में एक गिलास पेट्री डिश (१२० सेमी व्यास, 2 सेमी ऊंचाई) में सब्सट्रेट प्लेस ।
    3. पिपेट समाधान (≈ २०० µ एल के लिए एक एकल गिलास कवर स्लिप, एक बड़े सिलिकॉन वेफर के लिए कुछ मिलीलीटर) सब्सट्रेट पर, पूरी सतह को कवर, लेकिन समाधान सब्सट्रेट के किनारे पर बहने से बचने.
    4. पेट्री डिश बंद करा. सब्सट्रेट के सुखाने को कम करने के लिए, एक गीले कागज तौलिया के साथ एक अतिरिक्त कवर जोड़ें ।
    5. 30 मिनट के बाद, isopropyl शराब के लगभग ४० मिलीलीटर जोड़ें, तो बाहर सब्सट्रेट ले, यह isopropyl शराब के साथ अच्छी तरह से कुल्ला और यह एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ सूखी (ग्लास स्लाइड के लिए, PEGylated पक्ष याद) । अंधेरे में सब्सट्रेट स्टोर का उपयोग करें जब तक ।
      चेतावनी: त्वचा और आंख संरक्षण पहनते है और एक धुएं डाकू में काम करते हैं ।

2. स्थिरीकरण के लिए जीन की तैयारी

नोट: प्राइमरी जुगाड़, डीएनए संशोधन और एक अनुकरणीय पीसीआर प्रोटोकॉल अनुपूरक जानकारी (सेक्शन 2-4) में दी गई है ।

  1. उपयोग संशोधित प्राइमरों पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा ब्याज की जीन बढ़ाना । एक प्राइमर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में दृश्य के लिए एक fluorophore वहन करती है, और अन्य प्राइमर जिले अनुक्रम से एक triethylene ग्लाइकोल स्पेसर से अलग है ताकि जिले अनुक्रम रखने के लिए एक पीसीआर भर में फंसे ।
  2. एक स्पिन कॉलम शोधन किट का उपयोग कर डीएनए शुद्ध और एक अवशोषण फोटोमीटर का उपयोग कर अपनी एकाग्रता उपाय । एकाग्रता १०० एनएम से बहुत कम नहीं होना चाहिए ।
  3. एक केंद्रित 5 मीटर NaCl समाधान का उपयोग कर 1 m करने के लिए NaCl की एकाग्रता समायोजित करें । उच्च नमक एकाग्रता डीएनए ब्रश विधानसभा प्रक्रिया22की सुविधा ।

3. Photolithography

नोट: photocleavable डीएनए (पीसी) केवल एक पीले प्रकाश वातावरण में संभाला जाना चाहिए । cleanrooms के लिए पीला पन्ना पारंपरिक सफेद प्रकाश लैंप के प्रकाश फिल्टर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. सब्सट्रेट की तैयारी
    1. तैयार Bephore-मिश्रण (1 µ m streptavidin, १.५ µ एम पीसी डीएनए, ७.५ µ एम का पीएच डीएनए 1x पंजाब में (फास्फेट-बफर खारा)) और passivation मिश्रण (10 µ मीटर unlabel्ड जिले डीएनए, 1 मिलीग्राम/एमएल BSA (गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन), 1x पंजाब में) । दोनों को अंधेरे में कई हफ्तों तक फ्रिज में जमा किया जा सकता है ।
    2. छोटे टुकड़ों में सब्सट्रेट कट (कुछ सेमी2) या तो एक गिलास कटर का उपयोग करके या एक स्केलपेल के साथ एक किनारे पर दबाकर एक क्रिस्टल लाइन के साथ एक सिलिकॉन वेफर तोड़ने के द्वारा । एक सरल संरेखण चिह्न के रूप में, कांच कटर का उपयोग सब्सट्रेट के एक किनारे की ओर केंद्र से एक छोटी खरोंच बनाने. एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ चिप से छोटे कणों झटका ।
    3. दो घटक सिलिकॉन गोंद की दो बूंदें मिश्रण, यह एक पिपेट टिप के साथ उदाहरण के चमचे, और चिप की सतह के लिए गोंद लागू, खरोंच के टिप के आसपास के क्षेत्र को छोड़कर खाली (चित्रा 2a) । गोंद एक hydrophobic बाधा है कि धोने कदम की सुविधा प्रदान करता है और डीएनए की राशि के लिए आवश्यक कम कर देता है । बाद में एक कदम में, गोंद आसानी से खुली हो सकता है ।
    4. 10 µ एल मशीन (या के रूप में ज्यादा के रूप में चिप को कवर करने के लिए आवश्यक) Bephore के कमरे के तापमान पर मिश्रण (आरटी) चिप पर । मशीन के दौरान, एक बॉक्स में चिप जगह, एक पिपेट टिप आंशिक रूप से पानी से भरा वाष्पीकरण को कम करने के लिए बॉक्स उदा ।
    5. 1 घंटे के बाद, चिप कई बार धो (५० µ एल के साथ 5x) 1x पंजाबियों के साथ pipetting द्वारा असीम Bephore-मिश्रण को दूर ।
    6. बंद के रूप में ज्यादा संभव के रूप में बफर के रूप में चिप और passivation के 10 µ एल मशीन सुखाने-आरटी में चिप पर मिश्रण के बिना ले लो ।
    7. 2 घंटे के बाद, चिप कई बार धो (५० µ एल के साथ 10x) 1x पंजाब के साथ pipetting द्वारा असीम passivation एजेंटों को हटा दें ।
  2. आवाजाचा लिथोग्राफी
    नोट: लिथोग्राफी के लिए, एक 60x जल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक ईमानदार खुर्दबीन इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रदीप्ति टाइंस उद्देश्य पर निर्भर, प्रकाश स्रोत, मुखौटा, सब्सट्रेट (सिलिकॉन चिप या ग्लास स्लाइड) और वांछित डीएनए सतह घनत्व । एक 60x उद्देश्य के साथ, ठेठ जोखिम बार अतिव्यापी क्षेत्रों के साथ एक दो कदम लिथोग्राफी के लिए एक मिनट से नीचे तक की दूरी (15 सिलिकॉन चिप्स के लिए एस, ग्लास स्लाइड के लिए ४५ एस) के लिए एक पूर्ण जोखिम के लिए 2-3 मिनट । एक कवर पर्ची का उपयोग न करें (जुड़े क्वार्ट्ज को छोड़कर) सब्सट्रेट के शीर्ष पर, क्योंकि यह यूवी प्रकाश ब्लॉक.
    1. एक उपयुक्त मुखौटा धारक फिट करने के लिए एक उपयुक्त आकार के लिए एक मुद्रित photomask (पूरक लिथोग्राफी मास्क और अनुपूरक धारा 5) के साथ अनुपूरक फ़ाइल देखें, जो क्षेत्र स्टॉप (चित्रा 2 बी) की स्थिति में डाला जा सकता है । सटीक बहु-चरण लिथोग्राफी के लिए, होल्डर पर संरेखण चिह्नों के साथ मास्क संरेखित करें ।
    2. एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर सब्सट्रेट प्लेस और माइक्रोस्कोप मंच के लिए यह कदम । Bephore ग्लास स्लाइड के नमूनों के लिए, लिथोग्राफी के लिए एक अंधेरे पृष्ठभूमि प्रदान करने के लिए माइक्रोस्कोपी स्लाइड और Bephore स्लाइड के बीच काले पन्नी (मुद्रित photomasks से उदा स्पेयर पंनी) डालें.
    3. रोशनी पथ में एक लाल फिल्टर डालें, सब्सट्रेट सतह पर ध्यान केंद्रित करने और सब्सट्रेट के क्षेत्र के लिए नेविगेट, जो उजागर किया जाएगा, जैसे खरोंच की नोक पर क्षेत्र .
    4. मुखौटा धारक डालें, रोशनी ब्लॉक और यूवी फिल्टर करने के लिए बदल (चित्रा 2c) । कम प्रकाश की तीव्रता पर, शटर खुला और जल्दी से सब्सट्रेट पर मुखौटा ध्यान केंद्रित करने के लिए कैमरे का उपयोग करें ।
    5. कैमरे के लिए प्रकाश पथ ब्लॉक और वांछित जोखिम समय के लिए एक उच्च प्रकाश तीव्रता पर सब्सट्रेट रोशन ।
    6. माइक्रोस्कोप से नमूना ले लो और ध्यान से यह सुखाने के बिना सब्सट्रेट से संभव के रूप में ज्यादा बफर निकालें.
    7. जिले-अनुक्रम के साथ डीएनए के 10-20 µ एल जोड़ें । यह सुखाने से रखने के लिए एक गीला बॉक्स में सब्सट्रेट प्लेस । 2 एच के लिए सब्सट्रेट पर डीएनए (एक micromolar एकाग्रता में oligonucleotides) या कई घंटे/रात भर (kbp लगभग १०० एनएम एकाग्रता पर लंबे डीएनए) RT पर ।
    8. चिप से डीएनए निकालें और 1x पंजाबियों के साथ कई बार इसे धो लें । आदेश में डीएनए की बर्बादी को कम करने के लिए (विशेष रूप से अब टुकड़े के लिए), की दुकान सब्सट्रेट से लिया डीएनए और इसे पुनः प्रयोग ।
  3. बहु कदम लिथोग्राफी
    नोट: एक ही क्षेत्र में दो या अधिक जोखिम के सटीक संरेखण के लिए, चरण पर नमूना रखने के लिए कोणीय गलत संरेखण से बचने के लिए । सुनिश्चित करें कि चिप सूख नहीं है । एक सब्सट्रेट पर विभिन्न क्षेत्रों में कई डीएनए ब्रश की स्थिति के लिए, नामित क्षेत्र के लिए ड्राइव या उचित संरेखण के निशान के साथ एक सब्सट्रेट का उपयोग करने के लिए एक मोटर स्तर का उपयोग करें ।
    1. पहले प्रदर्शन के बाद (धारा ३.२), सब्सट्रेट पर जिले के अनुक्रम के साथ डीएनए मशीन । यह महत्वपूर्ण है कि सभी बाध्यकारी पहली जोखिम से उत्पंन साइटों पर कब्जा कर रहे हैं । इसलिए, मशीन oligonucleotides (10 µ एम) लगभग आरटी पर 3 एच के लिए ।
    2. जिले को स्थिर करने के लिए, जीन लेबल, उंहें कई घंटे या आरटी पर रात भर के लिए सब्सट्रेट पर जगह है, तो नमूना धोने और आरटी में एक और 2 एच के लिए passivation मिश्रण जोड़ें । अगले जोखिम के साथ आगे बढ़ें ।
    3. अतिरिक्त जोखिम के लिए, पिछले चरणों को दोहराएँ (3.2.3-3.3.2).

4. PDMS उपकरण

ध्यान दें: अधिमानतः, एक साफ कमरे में काम करते हैं । एक PDMS डिवाइस के निर्माण ऐसे मैकडॉनल्ड्स एट अल द्वारा वर्णित के रूप में एक मानक प्रोटोकॉल का पालन करता है । 30

  1. photolithography के माध्यम से मास्टर मोल्ड का निर्माण
    1. उच्च शक्ति पर 5 मिनट के लिए एसीटोन में sonication द्वारा एक सिलिकॉन वेफर (७६.२ mm व्यास, ५२५ µm मोटाई) साफ और isopropyl शराब और de-के साथ कुल्ला पानी । बाद में 15 मिनट के लिए १५० डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर जगह है ।
    2. वैकल्पिक रूप से, आदेश में वेफर के लिए विरोध के आसंजन में सुधार करने के लिए, जोड़ें 2-3 मिलीलीटर आसंजन प्रमोटर और स्पिन के लिए ३००० rpm पर 30 एस गर्मी के लिए वेफर १२० ° c 2 मिनट के लिए ।
    3. के बारे में जोड़ें 2-3 मिलीलीटर photoresist ( सामग्री की तालिकादेखें) । ५०० rpm पर 15 एस के लिए वेफर स्पिन, तो ३००० rpm पर 30 एस के लिए । यह photoresist की एक 20 µm मोटी परत में परिणाम चाहिए । photoresist परत 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आराम करते हैं ।
    4. पूर्व के लिए जोखिम सेंकना, 2 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर जगह है, तो ८५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ।
    5. photomask के तहत वेफर्स को डिब्बों के ब्लूप्रिंट के साथ लगाएं । अधिमानतः, एक मुखौटा-संरेखण का उपयोग करें । photomask ६४,००० dpi का एक समाधान होना चाहिए (अनुपूरक लिथोग्राफी मास्क और अनुपूरक खंड के साथ फ़ाइल देखें 5) ।
    6. यूवी प्रकाश के साथ 1 मिनट के लिए वेफर बेनकाब (मैं लाइन 5-10 मेगावाट/photomask के माध्यम से सेमी2) ।
    7. के बाद जोखिम सेंकना, 2 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर वेफर जगह और फिर 5 मिनट के लिए ८५ डिग्री सेल्सियस पर । चलो वेफर शांत हो जाओ और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए आराम करो ।
    8. 3 मिनट के लिए डेवलपर के साथ एक डिश में वेफर प्लेस जबकि धीरे चोंच आंदोलन । isopropyl शराब के साथ वेफर कुल्ला और यह एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ सूखी । ४५ मिनट के लिए १३० डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर प्लेस ।
  2. PDMS डिवाइस की तैयारी
    1. मिश्रण PDMS आधार और एक 10:1 अनुपात में PDMS इलाज एजेंट और यह एक बंद कंटेनर में वेफर पर डालना जब तक के बारे में 5 मिमी की एक परत वेफर ऊपर का गठन किया है । केवल 1 मिमी मोटाई के एक PDMS डिवाइस प्राप्त करने के लिए, बजाय कोट स्पिन PDMS के साथ १०० rpm पर 2 मिनट के लिए वेफर ।
    2. एक desiccator में कंटेनर प्लेस और के बारे में 30 मिनट के लिए एक निर्वात (के बारे में ८५ केपीए) लागू होते हैं । फिर, PDMS के बारे में 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 1-2 एक ओवन में एच गर्मी ।
    3. PDMS डिवाइस को वेफर से अलग कर दीजिये । PDMS को स्लैब में काटें ताकि प्रत्येक पीस में डिब्बों का एक सेट हो । मामले में PDMS एक microfluidic सेटअप करने के लिए जोड़ा जाएगा, एक प्रवेश और आपूर्ति चैनल के सिरों पर आउटलेट के रूप में पंच छेद (1 मिमी व्यास).
    4. isopropyl शराब और de-PDMS पानी के साथ साफ और यह एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ सूखी । PDMS धूल से मुक्त स्टोर ।

5. Compartmentalized जीन अभिव्यक्ति

नोट: निम्न कार्यविधि तापमान नियंत्रण के लिए एक पिंजरा मशीन के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप पर compartmentalized जीन अभिव्यक्ति के अवलोकन के लिए एक नमूना धारक (चित्रा 3) के विधानसभा का वर्णन. धारक आसानी से उपलब्ध सामग्री और उपकरणों का उपयोग कर बनाया गया था (3.5-5 मिमी मोटी polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) प्लास्टिक, शिकंजा और नट, ड्रिल) और सूक्ष्मदर्शी के विभिन्न प्रकार के फिट करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । ५.१ और ५.२ में बताए गए चरणों को इस तरह किया जाना चाहिए कि धारक के दोनों भाग एक ही समय में तैयार हों.

  1. नीचे धारक विधानसभा
    1. संरेखण चिह्न (जैसे एक खरोंच) के साथ एक Bephore चिप तैयार करें और यह चिप धारक पर गोंद डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप (चित्र बी) का उपयोग कर । चिप को PDMS डिवाइस से बड़ा होना चाहिए जो इसे कवर करेगा ।
    2. एक या चिप पर एकाधिक जीन स्थिर (2 वर्गों और 3 देखें) ।
    3. नीचे धारक के केंद्रीय छेद के आसपास कुछ वैक्यूम तेल जोड़ें, तो चिप धारक में प्लग ।
      नोट: चिप धारक अब तेल के माध्यम से नीचे धारक का पालन करता है, जबकि पुनः के लिए संभावना को बनाए रखने के एक्स में चिप की स्थिति-y-विमान ।
  2. शीर्ष धारक विधानसभा
    1. चरण 4.2.1 में स्पिन कोटिंग प्रक्रिया का उपयोग कर डिब्बों के साथ एक पतली PDMS चिप तैयार करें । PDMS कटौती संभव के रूप में छोटे, एक पक्ष के लिए खुला एक चैनल छोड़ने के लिए अपशिष्ट और प्रसार द्वारा अग्रदूत अणुओं के आदान प्रदान के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. साफ एक गिलास कवर स्लिप (24 मिमी x 24 मिमी, no. १.५) और PDMS चिप की पीठ (डिब्बों के बिना पक्ष) ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ ४२ के लिए एस (एक फैराडे पिंजरे में नमूना के साथ २०० डब्ल्यू और ०.८ mbar पर संचालित).
    3. ऊपर की ओर इशारा करते डिब्बों के साथ कांच स्लाइड के केंद्र में PDMS चिप रखें । ७० डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए PDMS के साथ गिलास सेंकना ।
    4. शीर्ष धारक के बड़े छेद के आसपास कुछ वैक्यूम तेल जोड़ें ।
    5. प्रयोग शुरू करने से पहले, ग्लास स्लाइड और ४२ एस के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ PDMS चिप साफ करने के लिए PDMS हाइड्रोफिलिक प्रदान करते हैं ।
    6. शीर्ष धारक ( चित्रा 3सी) पर PDMS के साथ कांच स्लाइड प्लेस और धीरे तेल पर गिलास प्रेस (3 सी आंकड़ा) ।
  3. धारक सभा
    1. एक सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के १०० µ एल तैयार है और यह बर्फ पर रहते हैं ।
    2. ध्यान से चिप से बफर निकालें और सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के 10 µ एल के साथ एक बार धो लें । अगले, चिप पर सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के ६० µ एल जोड़ें और चिप के किनारों से दो घटक सिलिकॉन गोंद निकालें (पहले से ही चित्र में हटा बी) ।
    3. PDMS पर अभिव्यक्ति प्रणाली के 20 µ एल जोड़ें । PDMS पर छोटी बूंद रखने के बाद, जल्दी से त्रिविम माइक्रोस्कोप कि डिब्बों अच्छी तरह से गीला कर रहे हैं और हवा के बुलबुले के बिना में जाँच करें । अगर हवा के बुलबुले हैं तो उन्हें सेल-फ्री एक्सप्रेशन सिस्टम के बाकी हिस्सों से धोने की कोशिश करें ।
    4. धारक के दो टुकड़ों को इकट्ठा करने और चैंबरों और डीएनए ब्रश, एक त्रिविम माइक्रोस्कोप के तहत काम और एक मनोरंजक बांह के साथ नीचे धारक स्थिर, तो दो शिकंजा और wingnuts आसानी से दोनों हाथों से सुलभ है (चित्रा 3 डी-एफ ).
    5. नीचे धारक में शीर्ष धारक डालें और सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली बूंदों फ्यूज (चित्रा 3 डी) जब तक यह कम । त्रिविम माइक्रोस्कोप के माध्यम से जाँच करें कि डिब्बों और संरेखण निशान एक्स-वाई विमान में एक समान क्षेत्र में हैं, अन्यथा शीर्ष धारक ऊपर खींचने के लिए और शीर्ष धारक पर ग्लास स्लाइड फिर से स्थिति.
    6. नीचे से, wingnuts ऊपर पेंच जब तक वे धारक के नीचे की ओर स्पर्श करें । ध्यान से wingnuts कस, जबकि डिब्बों में संरेखित और चिप धारक (चित्रा 3E) के तल पर संभाल के माध्यम से एक्स-वाई में विमान-हवाई जहाज । एक बार संपर्क में, wingnuts केवल बहुत धीरे (चित्रा 3F) कस ।
      नोट: इस चरण में कुछ अनुभव की आवश्यकता है और प्रायोगिक सेटअप पर निर्भर करता है । माइक्रोस्कोप के तहत, हस्तक्षेप PDMS और कांच के बीच तरल से उत्पंन होने का संकेत कर सकते है कि लागू बल बहुत छोटा है, जबकि एक कम प्रतिदीप्ति तीव्रता (एक डीएनए ब्रश से या प्रोटीन व्यक्त) एक डिब्बे संकेत के केंद्र में एक बहुत अधिक दबाव (अनुपूरक जानकारी भी देखें, धारा 6) ।
    7. पानी के साथ विरोधी वाष्पीकरण बाड़े में स्पंज स्प्रे और बॉक्स में धारक डालें । दो घटक सिलिकॉन गोंद के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज भरें और इसका इस्तेमाल करने के लिए बॉक्स (चित्रा 3 जी) सील ।
    8. एक तापमान नियंत्रित माइक्रोस्कोप और छवि डीएनए ब्रश और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में प्रतिक्रिया करने के लिए बॉक्स स्थानांतरण । यहां तक कि रोशनी के बिना, डीएनए ब्रश के प्रतिदीप्ति एक सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में फ़ेड । फिर भी, ब्रश अपनी गतिविधि बरकरार रखती है, के रूप में एक ही ब्रश से दोहराया जीन अभिव्यक्ति द्वारा दिखाया जा सकता है ।
      नोट: जब एक सिलिकॉन चिप के बजाय एक Bephore ग्लास स्लाइड का उपयोग कर, PDMS और Bephore चिप की स्थिति (ऊपर/नीचे), छोटे काम कर दूरी के साथ उद्देश्यों के उपयोग के लिए अनुमति विमर्श किया जा सकता है ।

6. Microfluidic उपकरणों में निरंतर अभिव्यक्ति

नोट: प्रयोगात्मक सेटअप चित्रा 4aमें दिखाया भागों से इकट्ठे है. तापमान नियंत्रित मंच के विधानसभा पर विवरण अनुपूरक जानकारी (धारा 7) में दिए गए हैं ।

  1. सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली और टयूबिंग
    1. एक नमूना ट्यूब में सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली तैयार (के बारे में २०० µ एल). Polystyrene मोती फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल के लिए बाद में एक आपूर्ति चैनल के माध्यम से प्रवाह की दर की निगरानी जोड़ा जा सकता है ।
    2. एक दबाव नियंत्रक के लिए ट्यूब कनेक्ट । एक बड़े बर्फ जलाशय है कि लगभग 12 घंटे के लिए ठंडा रहता है में ट्यूब प्लेस । यदि आवश्यक हो तो बर्फ फिर से भरना ।
      नोट: एक दबाव नियंत्रक के लिए एक विकल्प के रूप में, एक सिरिंज पंप सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के एक निरंतर प्रवाह दर प्रदान करता है भले ही प्रवाह प्रतिरोध परिवर्तन, जैसे हवा के बुलबुले के कारण, जो दीर्घकालिक प्रयोगों के साथ मदद कर सकता है.
    3. PTFE ट्यूबिंग (०.८ मिमी के भीतरी व्यास) है, जो गर्म मंच तक पहुँचता करने के लिए सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली युक्त tube कनेक्ट. एक सिरिंज सुई (०.९ मिमी के व्यास) कुंद समाप्त होता है और PTFE टयूबिंग में एक टुकड़ा डालने के साथ 1-2 सेमी टुकड़ों में तोड़ । यह बाद में PDMS के लिए कनेक्टर के रूप में सेवा करेंगे । मंच और ट्यूब (चित्रा 4c) के बीच टयूबिंग की लंबाई को कम करने की कोशिश करो ।
    4. PTFE टयूबिंग शांत करने के लिए, यह बड़ा रबर टयूबिंग कि एक बर्फ पानी जलाशय और एक सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ा है चारों ओर लपेट । उन्हें स्कॉच टेप (फिगर 4c) के साथ एक साथ टेप.
  2. शीर्ष धारक विधानसभा
    1. ऑक्सीजन प्लाज्मा (४२ s) के साथ PDMS चिप के फ्लैट की ओर साफ और यह छेद फिटिंग प्रवेश और PDMS (चित्रा 4B) के आउटलेट के साथ एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर जगह है । गिलास में छेद पहले से drilled किया जा सकता है एक ग्लास ड्रिलिंग सिर के साथ । सुनिश्चित करें कि माइक्रो चैंबर्स ग्लास स्लाइड का सामना नहीं कर रहे हैं ।
    2. PDMS होल्डर के समतल साइड पर डबल-पक्षीय चिपकने वाला टेप लागू करें । चिपकने वाला टेप से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से बचने के लिए धारक के दो छेद के बीच क्षेत्र में काले पन्नी का एक टुकड़ा (उदाहरण के लिए एक लिथोग्राफी मुखौटा से) छड़ी ।
    3. होल्डर को PDMS चिप के साथ कांच की स्लाइड चिपकाएं ।
    4. PDMS और एक प्लाज्मा क्लीनर में ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ संलग्न ग्लास स्लाइड के साथ PDMS धारक का इलाज (४२ s) ।
    5. शीर्ष धारक में बड़े छेद के चारों ओर वैक्यूम तेल लागू करें और PDMS धारक (चित्रा 4B) डालें । PDMS धारक अब शीर्ष धारक का पालन करता है, जबकि पुनः के लिए संभावना को बनाए रखने x-y दिशाओं में स्थिति ।
    6. PDMS चिप के प्रवेश के लिए सिरिंज सुई संबंधक के साथ PTFE टयूबिंग कनेक्ट । शीर्ष धारक के माध्यम से PDMS के लिए उपयोग की सुविधा के लिए, ऊपरी प्लास्टिक की थाली संक्षेप में इस और निंनलिखित कदम के लिए हटा दिया जा सकता है ।
    7. आउटलेट (चित्रा 4d) पर एक सिरिंज सुई संबंधक के साथ PTFE टयूबिंग (के बारे में 5 सेमी) का एक दूसरा टुकड़ा डालें ।
    8. शीर्ष धारक में PDMS धारक की स्थिति तो यह सभी दिशाओं में स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र है । किसी भी wingnuts कस बिना चित्रा 4E में की तरह गर्म मंच पर ढीला शीर्ष धारक प्लेस ।
    9. माइक्रोस्कोप के साथ, PDMS डिब्बों की स्थिति के लिए नेविगेट और देखने के कैमरे के क्षेत्र में उन्हें केंद्र. मंच पर इस बिंदु से मत हटो ।
    10. शीर्ष धारक को मंच से PDMS से हटा दें ।
  3. गर्म स्टेज और Bephore ग्लास स्लाइड
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म चरण के तापमान सेट
    2. गोंद एक Bephore ग्लास स्लाइड (no .4) के तापमान के लिए जीन ब्रश के साथ-उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप, देखने के माइक्रोस्कोप के क्षेत्र के केंद्र में लगभग संरेखण चिह्न के साथ चरण नियंत्रित । संरेखण चिह्न की यह स्थिति सुनिश्चित करती है कि डिब्बों को एक ही क्षेत्र में लगभग कम किया जाएगा ।
    3. जीन ब्रश के इसी प्रतिदीप्ति चैनल में एक छवि ले लो और कैमरे की छवि में अपनी स्थिति को चिह्नित ।
    4. जीन ब्रश से बफर निकालें, लेकिन इसे सूख जाने न दें । जीन ब्रश करने के लिए सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के 20 µ एल जोड़ें और सिलिकॉन गोंद फ्रेम को दूर करने के लिए चिमटी का उपयोग करें ।
  4. microfluidic सेटअप की असेंबली
    1. नमूना ट्यूब करने के लिए दबाव जोड़ें जब तक सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली PTFE ट्यूबिंग भर दिया है और PDMS डिवाइस के तल पर प्रकट होता है । इसके अतिरिक्त, पिपेट पर सूक्ष्म कक्षों पर सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के 10 µ एल PDMS । सुनिश्चित करें कि डिब्बों हवाई बुलबुले से मुक्त कर रहे हैं ।
    2. ध्यान से गिलास स्लाइड पर शीर्ष धारक को कम और जीन ब्रश के साथ सूक्ष्म कक्षों संरेखित करें । दोनों PDMS और संरेखण निशान एक ही फोकल हवाई जहाज तक पहुंचने से पहले, ठीक x-y-स्थिति और जीन ब्रश (चित्रा 4E) के साथ PDMS डिवाइस के अभिविन्यास संरेखित करने के लिए PDMS धारक के पीछे छोटे शिकंजा का उपयोग करें ।
    3. स्थिति पकड़ो और शिकंजा कि खुर्दबीन स्टेज (चित्रा 4E) के लिए शीर्ष धारक कनेक्ट के साथ wingnuts कस द्वारा ग्लास स्लाइड पर PDMS दबाएँ ।
    4. सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली युक्त ट्यूब में दबाव बढ़ाएं और आपूर्ति चैनल के माध्यम से फ्लोरोसेंट मोतियों के प्रवाह की निगरानी (०.५ के बीच प्रवाह दर 5 µ एल प्रति घंटे की सिफारिश कर रहे हैं) (चित्रा 4F) । यदि आवश्यक हो तो wingnuts को कस कर शीशे पर PDMS का दबाव बढ़ाएं ।

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Representative Results

दो कदम लिथोग्राफी: चित्रा 5 एक दो कदम lithographic प्रक्रिया का परिणाम से पता चलता है फ्लोरोसेंट लेबल जिले किस्में के पैटर्न अतिव्यापी के साथ एक गिलास स्लाइड पर ।

एक जीन ब्रश से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति: चित्रा 6 मैटीरियल डीएनए से फ्लोरोसेंट प्रोटीन YPet की अभिव्यक्ति दर्शाता है । समय में कई बिंदुओं पर हम आंशिक रूप से सफेद फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा जीन अभिव्यक्ति की दर का आकलन किया और प्रतिदीप्ति संकेत की वसूली देख, तत्काल वसूली, जो प्रोटीन अभिव्यक्ति से परिणाम नहीं है की अवहेलना । अभिव्यक्ति के दो घंटे में पहली ब्लीचिंग के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता को ब्लीच करने से पहले उसके मूल्य से जल्दी और गुलाब के ऊपर बरामद किया । चार और छह घंटे के बाद, प्रतिदीप्ति अपनी पिछली तीव्रता को ठीक नहीं किया, यह दर्शाता है कि ताजा अभिव्यक्ति मिश्रण की आपूर्ति के बिना, प्रतिक्रिया लगभग 3-4 एच के बाद समाप्त हो गया ।

microfluidics के लिए युग्मन: जीन अभिव्यक्ति microfluidics के माध्यम से अतिरिक्त अग्रदूत अणुओं के साथ अभिव्यक्ति डिब्बों की आपूर्ति से समय की लंबी अवधि में निरंतर किया जा सकता है । चित्रा 7 ऐसी प्रणाली से पता चलता है, 10 से अधिक YPet की अभिव्यक्ति को सक्षम करने एच ।

TIRF अवलोकन: Bephore भी एक अणु स्तर पर एक डीएनए ब्रश के साथ फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन के संपर्क का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । विशेष रूप से एक शोर वातावरण में, लिथोग्राफी ब्रश या सतह के साथ विशिष्ट और विशिष्ट बातचीत के बीच अंतर करने में मदद करता है, क्रमशः । चित्रा 8 इस तरह के एक उदाहरण देता है, फ्लोरोसेंट लेबल T7 आरएनए पोलीमरेज़ बंधन के साथ या आसपास की सतह की तुलना में डीएनए ब्रश करने के लिए तरजीह का पालन ।

Figure 1
चित्रा 1 : Bephore photolithography. a. सिलिकॉन डाइऑक्साइड (सिइओ2) की सतह के साथ एक सब्सट्रेट biotinylated पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी-बीटी) की एक परत है, जो संगत है और एक photocleavable डीएनए hairpin के माध्यम से लगाव के लिए अनुमति देता है के साथ कवर किया जाता है बायोटिन-streptavidin इंटरैक्शन. यहां, पीसी अनुक्रम डोमेन abcb * और एक photocleavable संशोधन (बैंगनी सितारा) शामिल है और एक डोमेन *के साथ किनारा पीएच को संकर है । B. पराबैंगनी (यूवी) रोशनी पीसी सट, एक डीएनए टुकड़ा जारी (सीबी *) समाधान में । सी-डी. पीसी पर परिणामी एकल-असहाय क्षेत्र (ख) एक फ्लोरोसेंट लेबल (ग्रीन स्टार) जिले किनारा द्वारा पीएच के विस्थापन के लिए एक toehold के रूप में एड्स । E. इसके अलावा अब, डबल-कतरा डीएनए ("टेम्पलेट") नमूनों की सतह से जुड़ा जा सकता है. इस तरह के डीएनए एक प्राइमर के साथ पीसीआर द्वारा तैयार किया जाता है अपने 5 ' अंत में एक जिले अनुक्रम ले, जहां प्राइमर और जिले एक triethylene ग्लाइकोल स्पेसर से अलग कर रहे है जिले सिंगल रखने के लिए पीसीआर के दौरान फंसे (यह भी अनुपूरक जानकारी देखें, 2-4 वर्गों) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : photolithography के लिए नमूना तैयारी । a. एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड या किसी अन्य चिप धारक पर एक संरेखण चिह्न के साथ एक Bephore चिप प्लेस (उदाहरण के लिए चित्र बीमें धारक). चिप के किनारों के साथ एक hydrophobic बाधा के रूप में दो घटक सिलिकॉन गोंद लागू करें (3.1.2-3 कदम) । B. मुखौटा एक मुखौटा धारक पर प्लेस । यहां, हम क्षेत्र बंद के आईरिस हटा दिया और उसके धारक संशोधित तो मुखौटा छोटे मैग्नेट द्वारा आयोजित किया जा सकता है । बहु-चरण लिथोग्राफी में सटीक (कोणीय) संरेखण के लिए, होल्डर पर संरेखण चिह्न और मास्क मिलान (step 3.2.1) सुनिश्चित करें । C. चिप पर नेविगेट करने के लिए और चिप पर संरेखण चिह्न, लाल फ़िल्टर में स्लाइड के साथ मास्क संरेखित करने के लिए । यूवी एक्सपोजर के लिए, यूवी फिल्टर डालें (स्टेप्स 3.2.2-5) । पिछले काम27के समर्थन जानकारी से reproduced चित्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : compartmentalized जीन अभिव्यक्ति के अवलोकन के लिए एक धारक के विधानसभा । A. धारक का भाग (शासक इकाई: मुख्यमंत्री) । बी-सी. ऊपर और नीचे धारक का हिस्सा अलग से इकट्ठे हुए हैं, एक नमूनों Bephore चिप (धारा ५.१) और शीर्ष धारक डिब्बों के साथ एक PDMS चिप ले जाने (धारा ५.२) के साथ नीचे धारक के साथ । डी-एफ. चिप और PDMS को सावधानी से तंग संपर्क में लाया जाता है, जबकि एक साथ एक त्रिविम माइक्रोस्कोपी (स्टेप्स 5.3.1-6) में कंपार्टमेंट और डीएनए ब्रश को मेटाबॉलिज्म और संरेखित करता है । जी एक औंधा, तापमान नियंत्रित माइक्रोस्कोप के लिए धारक को स्थानांतरित करने से पहले, पूरे सिस्टम एक विरोधी वाष्पीकरण बॉक्स (कदम 5.3.7-8) में समझाया गया है. पिछले काम27के समर्थन जानकारी से reproduced चित्रा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Microfluidic सेटअप और compartmentalized जीन अभिव्यक्ति के लिए नमूना धारक । A. नमूना धारक के पार्ट्स, PDMS डिवाइस, तापमान नियंत्रित माइक्रोस्कोप स्टेज और Bephore ग्लास स्लाइड (शासक इकाई: सेमी). B. एक माइक्रोस्कोपी PDMS डिब्बों के साथ ले जाने के PDMS धारक से चिपके हुए है और ऑक्सीजन प्लाज्मा एक साथ एक प्लाज्मा क्लीनर में PDMS के साथ उजागर । इसके बाद PDMS को टॉप होल्डर (स्टेप्स 6.2.2-5) में डाला जाता है । C. सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली ट्यूब एक दबाव नियंत्रक से जुड़ा हुआ है और बर्फ पर रखा गया है । सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए टयूबिंग (लाल डैश्ड लाइन इनसेट में) रबर टयूबिंग (नीली डैश्ड लाइन) जिसके माध्यम से बर्फ के पानी एक सिकुड़नेवाला पंप (धारा ६.१) द्वारा पंप है द्वारा ठंडा है । घ. टयूबिंग PDMS डिवाइस पर प्रवेश की स्थिति से जुड़ा है । टयूबिंग का एक टुकड़ा आउटलेट (कदम 6.2.6-7) से जुड़ा है । E. शीर्ष धारक सूक्ष्मदर्शी मंच पर रखा गया है और ध्यान से Bephore स्लाइड की ओर कम है । PDMS धारक अभी भी एक्स-वाई-विमान में ले जाया जा सकता है Bephore चिप पर जीन ब्रश के साथ PDMS में डिब्बों संरेखित करें । wingnuts Bephore चिप पर PDMS प्रेस और माइक्रोस्कोप चरण (स्टेप्स 6.4.1-3) के लिए शीर्ष धारक को ठीक करने के लिए उपयोग किया जाता है । F. सेल-फ्री एक्सप्रेशन सिस्टम PDMS में माइक्रो-चैनलों के माध्यम से पंप किया जाता है और डीएनए ब्रश से जीन एक्सप्रेशन epifluorescence माइक्रोस्कोपी (स्टेप 6.4.4) में नजर आ सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : दो कदम photolithography । ए-बी. फ्लोरोसेंट लेबल oligonucleotides (ग्रीन: एटो ५३२; लाल: Alexa Fluor ६४७) लगातार किया गया एक Bephore ग्लास स्लाइड पर मास्क प्रक्षेपण के माध्यम से लिथोग्राफी के जोखिम समय के साथ ४५ एस. सी. एक और बी के ओवरले, एकल जोखिम के सटीक संरेखण का प्रदर्शन । स्केल बार्स: 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6 : Compartmentalized जीन एक्सप्रेशन. a. एक Bephore ग्लास स्लाइड पर एक डीएनए ब्रश (यूवी जोखिम समय: 2 मिनट), फ्लोरोसेंट प्रोटीन YPet के लिए कोडिंग एक PDMS चिप पर एक डिब्बे के साथ गठबंधन किया गया था (5 खंड और 3 चित्रादेखें) । B. डीएनए के साथ चैंबर में जीन अभिव्यक्ति एक प्रोटीन एकाग्रता एक चैनल है, जो PDMS डिवाइस के बाहर अभिव्यक्ति मिश्रण करने के लिए चैंबर जुड़ा साथ बनाने ढाल के साथ एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत झुकेंगे । बिना मैटीरियल जीन के नियंत्रण कक्ष में अपेक्षाकृत अंधेरा बना रहा. C. प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल दोनों मंडलों के लिए समय के साथ । हर दो घंटे फ्लोरोसेंट प्रोटीन आंशिक रूप से ब्लीच किया गया (काले तीर) की जांच करने के लिए कि क्या अभिव्यक्ति अभी भी सक्रिय था । 4 एच के बाद, प्रतिदीप्ति अपनी पिछली तीव्रता को ठीक नहीं किया, यह दर्शाता है कि अभिव्यक्ति समाप्त हो गया था । स्केल बार्स: ३०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7 : वृ compartmentalized जीन अभिव्यक्ति । a. एक Bephore ग्लास स्लाइड पर एक डीएनए ब्रश (यूवी जोखिम समय: 2 मिनट), YPet के लिए कोडिंग एक PDMS चिप पर एक डिब्बे के साथ गठबंधन किया गया था । डिब्बों एक आपूर्ति चैनल (सफेद तीर) के माध्यम से जो सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली पंप है (अनुभाग 6 और चित्रा 4देखें) से जुड़े हुए हैं । B. जीन ब्रश युक्त डिब्बे में सेल रहित जीन एक्सप्रेशन सिस्टम द्वारा YPet एक्सप्रेशन (ग्रीन में) से एक प्रतिदीप्ति संकेत दिखाता है. एक जीन ब्रश के बिना पड़ोसी डिब्बे अपेक्षाकृत अंधेरा रहता है । सेल के ताजा घटक मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली आपूर्ति चैनल के माध्यम से प्रवाह और डिब्बों में फैलाना, जबकि अपशिष्ट उत्पादों को दूर पहुंचाया जाता है । C. प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल दोनों मंडलों के लिए समय के साथ । फ्लोरोसेंट प्रोटीन आंशिक रूप से समय में विभिंन बिंदुओं पर प्रक्षालित थे (काले तीर) की जांच करने के लिए कि अभिव्यक्ति अभी भी सक्रिय था । आपूर्ति चैनल में प्रवाह के कारण, जीन अभिव्यक्ति के लिए कम से 10 ज बनाए रखा गया था (लाल तीर द्वारा चिह्नित रेड ट्रेस में चोटी एक हवा बुलबुला है कि अस्थाई रूप से डिब्बों से हल सूखा के कारण होता था) । स्केल बार्स: ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्र 8 : एकल-अणु अध्ययन पर Bephore ग्लास स्लाइड में कुल आंतरिक परावर्तन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM). A. उद्देश्य-प्रकार TIRFM सक्षम बनाता है एकल-अणु इमेजिंग गिलास पानी इंटरफ़ेस करने के लिए बंद । हम फ्लोरोसेंट लेबल जीन (ग्रीन, एटो ५३२, यूवी जोखिम समय: 2 मिन) lithographically के साथ एक T7 प्रमोटर के साथ परिभाषित धारियों और T7 आरएनए पोलीमरेज़ के व्यवहार मनाया (नारंगी, Alexa Fluor ६४७ के साथ लेबल) सतह के साथ बातचीत । B. प्रतिदीप्ति छवि मैटीरियल जीन की दो पट्टियां दिखाती हैं । C. T7 आरएनए polymerases विशेष रूप से सतह (एकल छवि, ५० ms जोखिम समय) के लिए विशिष्ट और गैर-विशेष रूप से अनुलग्न करें । D. एक औसत छवि एक प्रतिदीप्ति वीडियो के सभी फ्रेम से प्राप्त की (५,००० फ्रेम्स में जैसे उपचित्र सी) डीएनए ब्रश के साथ आरएनए पोलीमरेज़ की विशिष्ट बातचीत को उजागर करता है । स्केल बार्स: 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

Bephore लिथोग्राफी डीएनए या आरएनए के नमूनों में स्थिरीकरण के लिए एक मजबूत और बहुमुखी तकनीक है । फिर भी, प्रक्रिया कई कदम है, जो-अगर बदल-विफलता या प्रणाली के प्रदर्शन को कम करने के लिए एक स्रोत हो सकता है शामिल हैं ।

Bephore चिप्स के निर्माण में एक महत्वपूर्ण कदम सब्सट्रेट के PEGylation है, जो सतह के लिए अनुकूलता प्रदान करता है । यहां, एक आरसीए प्रक्रिया के साथ सफाई कदम महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह भी बाद silanization के लिए सतह को सक्रिय करता है । वास्तविक PEGylation के दौरान, सब्सट्रेट बाहर शुष्क नहीं करना चाहिए । इसके अलावा, Silane-खूंटी-बायोटिन ठीक से संग्रहीत किया जाना चाहिए अपनी प्रतिक्रिया (धारा १.२) की रक्षा और crosslinking से बचने के लिए । PEGylation के परिणाम का आकलन करने के लिए, सब्सट्रेट फ्लोरोसेंट लेबल streptavidin के साथ और गैर-PEGylated नियंत्रण की तुलना में मशीन किया जा सकता है । सफलतापूर्वक PEGylated सब्सट्रेट नियंत्रण से काफी अधिक streptavidin बांध चाहिए.

इसके अलावा, lithographic प्रक्रिया के बाद के चरणों में, चिप के सूखने प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप पहले से ही बंधे डीएनए को हटाने में या एक उच्च सोखना में डीएनए के लिए सब्सट्रेट पर unexposeded क्षेत्रों.

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है (धारा ३.२), lithographic प्रक्रिया के संकल्प और आवश्यक निवेश बार प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर (उद्देश्य, प्रकाश स्रोत, आदि) । इसलिए, पहले चरण में, जोखिम समय की एक विस्तृत श्रृंखला का परीक्षण किया जाना चाहिए ।

जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों के लिए, प्रयोगात्मक सेटअप उपलब्ध हार्डवेयर (माइक्रोस्कोप, तापमान नियंत्रण, आदि) फिट करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । हम दो ऐसे implementations, लघु प्रयोगों के लिए एक (4 एच, 5 खंड), जहां प्रणाली एक बॉक्स में समझाया अभिव्यक्ति मिश्रण के वाष्पीकरण को कम किया गया था, और एक लंबी टिप्पणी के लिए (6 खंड), जहां एक microfluidic डिवाइस एक सतत सक्षम दिखाया पूर्ववर्ती अणुओं की आपूर्ति । दोनों ही मामलों में, PDMS में सब्सट्रेट और डिब्बों पर डीएनए ब्रश के संरेखण trickiest कदम का प्रतिनिधित्व किया । इसलिए हम अनुशंसा करते हैं इस कदम की कोशिश कर एक डमी सब्सट्रेट के साथ कई बार एक नमूनों एक का उपयोग करने से पहले (यह भी अनुपूरक जानकारी, 6 खंड देखें). अलग जीन ब्रश के बड़े सिस्टम के विधानसभा में, लंबे समय तक गर्मी समय, कक्षों की सटीक कोणीय संरेखण और लंबी दूरी पर ब्रश, और गैर के लिए डीएनए के सोखना द्वारा संदूषण-नमूनों क्षेत्रों passivation की गुणवत्ता के आधार पर, मई व्यावहारिक रूप से व्यवहार्य प्रणालियों के आकार के लिए सीमाएं मुद्रा ।

इस तकनीक के लिए एक विकल्प Karzbrun एट अल द्वारा प्रदर्शन किया गया था । 25, inductively युग्मित प्लाज्मा प्रतिक्रियाशील-आयन नक़्क़ाशी (बॉश प्रक्रिया), प्लाज्मा के बाद बढ़ाया वाष्प जमाव (PECVD) एक सिलिकॉन डाइऑक्साइड की परत के द्वारा एक चिप में डिब्बों बनाया है । सतह functionalization, पैटर्न और एक pipetting रोबोट द्वारा nanoliter डीएनए बूंदों के स्थान के बाद, डिब्बों एक PDMS-कवर ग्लास स्लाइड के साथ बंद कर दिया गया । इस प्रक्रिया का लाभ यह है कि डीएनए सीधे आसपास के कक्षों को दूषित करने के खतरे के बिना डिब्बों के अंदर स्थिर हो सकता है, लेकिन यह अतिरिक्त निर्माण कदम और प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है ।

प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत सक्षम बनाता है शोधकर्ताओं सेल में काम कर मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान समाधान से अध्ययन के अपने सिस्टम को हस्तांतरण के लिए चिप आधारित प्रतिक्रिया कंटेनरों के लिए setups आधारित है । विरोध के विकास के दौरान केंद्रीय कदम के रूप में डीएनए किनारा विस्थापन का उपयोग अद्वितीय डीएनए दृश्यों के साथ उजागर क्षेत्रों के लेबलिंग सक्षम बनाता है, जो multistep लिथोग्राफी के प्रति एक सतही दृष्टिकोण प्रदान करता है । microfluidics के साथ संयोजन समय की विस्तारित अवधि में जीन अभिव्यक्ति प्रक्रियाओं के अवलोकन की अनुमति देता है । ओपन फ्लो रिएक्टर शर्तों के तहत सेल मुक्त जीन अभिव्यक्ति प्रक्रियाओं की जांच के अलावा, एक ही पद्धति को स्थिर करने और विशेष रूप से एक चिप सतह पर अंय अणुओं को व्यवस्थित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तरह के प्रतिदीप्ति के रूप में कार्यात्मक और भौतिक अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए उपयोगी साबित करना चाहिए आधारित एकल अणु प्रयोगों यहां का प्रदर्शन किया ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं है ।

Acknowledgments

हम कृतज्ञता वोक्सवैगन Stiftung (अनुदान no. ८९ ८८३) और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान समझौते no. ६९४४१०-AEDNA) द्वारा इस परियोजना के लिए वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । M.S.-एस. GRK २०६२ के माध्यम से DFG द्वारा समर्थन स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4 Menzel 22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5 Assistent 24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane Laysan Bio MW 5,000
Anhydrous toluene Sigma Aldrich (Merck) 244511
Streptavidin Thermo-Fisher Scientific S888
DNA Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress New England Biolabs E6800S Cell-free expression system
PDMS  Dow Corning Slygard 184
FluoSpheres Thermo-Fisher Scientific F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) Bola S 1810-10
EpoCore 20 micro resist technology GmbH Photoresist
mr-Dev 600 micro resist technology GmbH Photoresist developer
Ti-Prime MicroChemicals Adhesion promoter
Two-component silicon glue Picodent Twinsil 
UV-protection yellow foil Lithoprotect (via MicroChemicals) Y520E212
Equipment
Masks for photolithography Zitzmann GmbH 64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope Olympus BX51 Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera Photometrics Coolsnap HQ Used with Olympus BX51
Ligtht source EXFO X-Cite 120Q Used with Olympus BX51
Inverted microscope Nikon Ti2-E Fluorescence imaging of gene expression
4x objective Nikon CFI P-Apo 4x Lambda Used with Nikon Ti2-E
Camera Andor Neo5.5 Used with Nikon Ti2-E
Light source Lumencor SOLA SM II Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator Okolab bold line Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller Elveflow OB1 MK3
NanoPhotometer Implen DNA concentration measurement
Plasma cleaner Diener Femto 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

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References

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