Summary
我们描述了一种简单的光刻程序, 用于固定在表面上的基因长度 DNA 分子, 可用于在生物芯片上执行无细胞基因表达实验。
Abstract
光刻结构表面上的基因固定化可以研究开放微流控生物反应器系统中的分割基因表达过程。与其他用于人工蜂窝系统的方法相反, 这种设置允许使用基因表达试剂和同时排出废物产品的持续供应。这有助于在较长时间内实现无细胞基因表达过程, 这对于实现动态基因调控反馈系统非常重要。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 用于制造遗传生物芯片使用一种简单易用的平版印刷技术, 基于 DNA 链位移反应, 专门使用商业上可用的组件。我们还提供了一个关于将分型基因与基于硅油 (PDMS) 的微流控系统相结合的协议。此外, 我们还表明该系统与全内部反射荧光 (TIRF) 显微镜相兼容, 可用于直接观察 DNA 与表达混合中所含分子之间的分子相互作用。
Introduction
无细胞基因表达反应对生物化学、生物技术和合成生物学的各种应用都有很大的兴趣。蛋白质的无细胞表达有助于制备纯蛋白样品, 这是结构生物学中大量研究的基础。例如, 无细胞系统被成功地用于蛋白配合物1或膜蛋白2的表达, 这是很难用细胞表达的方式产生的。值得注意的是, 无细胞基因表达反应也被用来阐明基因编码的结构, 从尼伦伯格分享和 Matthaei 在 1961年3的开创性实验开始。
最近, 对生物技术和合成生物学中的无细胞方法的兴趣重新开始了4,5,6。无细胞系统可以用非生物化合物来增强, 不同生物来源的成分可以更容易地结合起来7。即使无细胞系统有明显的劣势, 他们不 "生长和分裂", 它是可以想象的准备开放无细胞生物反应器与基本代谢功能, 让他们合成代谢物, 当提供简单的碳和能量输入8。在合成生物学的新兴领域内, 无细胞系统有望成为实现合成生物学功能的更可预测的 "底盘"。
目前, 无细胞基因表达反应是使用细胞提取物 (从细菌、酵母、昆虫等不同来源) 或转录/翻译系统进行的, 这些都是针对不同应用进行优化的 (例如,原核与真核基因的表达, 膜蛋白的生产等)。最近由 v. Noireaux 和同事9提供了一种用于制备细菌细胞萃取物 (通常称为 TXTL) 的流行协议。其生物物理特性已被彻底地表征为10, TXTL 系统已经成功地用于执行一系列复杂的生化任务:例如, 通过无细胞表达的噬菌体基因组11, 合成细菌蛋白花丝12, 或实施无细胞基因电路13,14。
在无细胞合成生物学中流行的另一个系统是纯系统, 它是从纯化的成分15,16重组。与 TXTL 系统相比, 它不含核酸酶或蛋白质降解机械。虽然线性 DNA 的降解, RNA 分子或蛋白质在纯系统中是较少的问题, 衰变通路实际上是重要的执行动态功能。为了减少线性基因模板在 TXTL 系统中外切酶降解的影响 (通过 RecBCD), 必须添加末端保护 GamS 蛋白。TXTL 和纯系统均可在商业上使用。
与无细胞生物学密切相关的一个话题涉及对生物化学反应进行划分的影响的研究, 以及进一步创建人工细胞样结构或原始细胞17,18,19 ,20。人工细胞的研究通常涉及在由磷脂或其他双亲制成的水泡夹层内的生化反应系统的封装。虽然这些系统有助于探讨划分的基本方面, 或细胞构成和自复制结构的出现, 但它们面临着封闭系统的典型问题: 在缺乏正常新陈代谢和适当膜传输机制, 很难保持分割反应运行的长时间-燃料分子被耗尽和废品积累。
在这种细胞模拟的隔间内进行划分的一个有趣的替代方法是使用光刻法的基因材料的空间组织。在十年前的魏兹曼研究所, Ziv 集团率先将 "芯片上的基因" 固定在21。必须解决的主要问题之一是 DNA 的非特异吸附和芯片表面蛋白质的潜在变性。Ziv等开发了一个专门的光刻抗称为 "雏菊", 这是由反应终端硅烷固定在二氧化硅表面的抗分子, 一个长聚乙烯乙二醇 (PEG) 垫片, 确保生物相容性, 和 photocleavable 头, 它被转换成反应胺在辐照紫外线 (UV) 光。结果表明, 菊花可用于固定基因长度的 DNA 分子 (长度为几公斤碱基对 (kbp)) 在芯片表面上。从高分子物理学的角度来看, 这些系统代表了在固体基底上接枝的聚合物画笔。由于 DNA 的聚电解质性质, 这些画笔的构象受到渗透和其他离子特异效应22,23的强烈影响。
最重要的是, 它已经表明, 基底固定化基因仍然是功能性的, 可以转录和转化成 RNA 和蛋白质。基因画笔可从溶液24中获得 RNA 聚合酶, 而转录/平移的复杂大分子混合物不会在表面变性。固定在基板上的遗传成分的优点之一是, 它们可以在一个开放的微流体反应器系统中运行, 并持续提供小的前体分子, 并可从中去除废料25,26。
我们最近开发了这种方法的变体称为 Bephore (用于生物相容性电子束和光刻胶)27, 它完全基于商业上可用的组件和使用序列特定的 DNA 链侵入反应实现了一种简单实现的多步骤光刻程序, 用于创建基于芯片的人工细胞。该过程的示意图概述如图 1所示。它是基于 DNA 发夹分子包含 photocleavable 组, 这是固定在生物相容的 PEG 层。Photocleavage 的发夹暴露一个单链立足点序列, 通过它的 DNA 分子的兴趣 (包含 "置换" DIS 序列) 可以通过立足点介导的链侵入连接。
虽然 Bephore 的实现可能更简单, 但菊花允许实现非常致密和干净的 "基因画笔", 这在某些应用中具有优势。然而, 在原则上, 菊花和 Bephore 光刻可以很容易地结合。利用 dna 链位移的相关光刻方法, 对金的 dna 画笔进行了构造, 但未在无细胞基因表达28、29的背景下使用。
在下面的协议中, 我们提供了使用 Bephore 方法对无细胞基因表达进行 DNA 笔刷生产的详细描述。我们描述了基因芯片是如何制造的, 并展示了多步光光刻在芯片上的空间结构化固定化中的应用。我们还讨论了反应腔的制备及微流体在片内基因表达反应中的应用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注: 在补充信息 (第1节) 中给出了不同部分中步骤的时间安排。
1. 芯片制造
注: 作为基材, 使用硅晶片 (直径100毫米, 厚度0.525 毫米) 与 50 nm 厚层的二氧化硅或玻璃玻片 (24 毫米 x 24 毫米, 不 1.5; 22 毫米 x 50 毫米, 不 4)。根据应用情况, 其他尺寸和厚度可能更合适。
- 通过RCA 清洁程序清洁基板 (水、氨水溶液 NH3(aq) 30% 和过氧化氢 H2O2 30%, 在比率 5:1: 1)
- 将水和氨水溶液混合在烧杯玻璃中, 并在搅拌时将混合物加热到热板上的70摄氏度。
- 添加过氧化氢和基底。对于更高的吞吐率, 在聚四氟乙烯 (PTFE) 支架中放置多个基板 (特别是小玻璃玻片)。
- 30分钟后取出基质, 用洗瓶水彻底冲洗, 用氮气枪晾干。立即进行基板的聚乙二醇化。
注意: 佩戴皮肤和眼睛保护, 并在烟雾罩中工作。不要紧紧地关闭废物容器, 以允许从混合物中释放气体。
- 基板的聚乙二醇化
注: 生物素-PEG-硅烷库存的反复冻结和解冻可降低硅烷由于空气水分凝结而产生的反应性。因此, 准备5毫升管与适当数量的生物素-PEG-硅烷 (例如10-20 毫克), 并填补他们与干氩之前冻结它们, 直到使用。- 涡旋 (5 毫克/毫升) 在干甲苯中溶解生物素-PEG-硅烷。
- 将基底放入玻璃培养皿 (直径120厘米、2厘米高) 的烟雾罩中。
- 将溶液移液器 (≈200µL 用于单个玻璃盖玻片、大型硅片的几毫升) 到基底上, 覆盖整个表面, 但避免溶液流过基体边缘。
- 关闭培养皿。为减少承印物的干燥, 请用湿纸巾添加额外的盖子。
- 30分钟后, 加入约40毫升的异丙醇, 然后取出基质, 再用异丙醇彻底冲洗, 用氮气枪 (用于玻璃滑块, 记住聚乙二醇侧) 晾干。将基底储存在黑暗中, 直到使用。
注意: 佩戴皮肤和眼睛保护, 并在烟雾罩中工作。
2. 固定化基因的制备
注: 补充信息 (2-4 节) 给出了底漆序列、DNA 修饰和典型 PCR 方案。
- 使用修饰的引物通过聚合酶链反应 (PCR) 放大兴趣基因。一个底漆携带荧光显微镜可视化荧光剂, 另一底漆由三乙二醇垫片与 dis 序列分离, 以便在整个 PCR 过程中保持 dis 序列单链。
- 使用自旋柱纯化试剂盒纯化 DNA, 并使用吸收光度计测量其浓度。浓度不应低于 100 nM。
- 使用浓缩的 5 m 氯化钠溶液调节氯化钠浓度至 1 m。高盐浓度有利于 DNA 刷组装过程22。
3. 光刻
注: photocleavable DNA (PC) 仅在黄光环境下处理。用于洁净室的黄色箔片可用于过滤传统白光灯的光。
- 基板的制备
- 准备 Bephore 混合物 (1 µM 链霉素, 1.5 µM PC DNA, 7.5 µM PH dna 在 1x pbs (磷酸盐缓冲盐水)) 和钝化混合 (10 µM 未标记的 DIS dna, 1 毫克/毫升 BSA (牛血清白蛋白), 在 1x PBS)。两个都可以储存在黑暗的冰箱里几个星期。
- 通过使用玻璃切割器或通过将硅晶片沿晶体线折断, 用手术刀将基体切成小块 (几厘米2)。作为一个简单的对齐标记, 使用玻璃切割器从中心向基板的边缘创建一个短划痕。用氮气枪将小颗粒从芯片上吹开。
- 混合两个组分的硅胶胶滴, 搅拌它,例如用移液器尖端, 并将胶水涂在芯片表面, 留下刮痕空白的区域 (图 2A)。胶水提供了疏水性屏障, 有助于洗涤步骤和减少孵化所需的 DNA 量。在以后的步骤中, 胶水可以很容易地剥离掉。
- 在芯片的室温 (RT) 下孵育10µL (或尽可能多地覆盖芯片) 的 Bephore 混合。在孵化过程中, 将芯片放在一个盒子里,例如, 用部分填充水的移液头盒来减少蒸发。
- 1小时后, 用 1x PBS 移液洗涤芯片数次 (5x 与50µL), 以去除未绑定的 Bephore 混合。
- 在不干燥芯片的情况下尽可能多地脱下缓冲液, 并在 RT 上孵育10µL 的钝化混合。
- 2小时后, 用 1x PBS 移液洗涤芯片数次 (10x 与50µL), 以去除未绑定的钝化剂。
- 投影光刻
注: 对于光刻, 可以使用60x 水浸泡物镜的直立显微镜。光照时间取决于目标、光源、遮罩、基底 (硅晶片或玻片) 以及所需的 DNA 表面密度。60x 物镜, 典型曝光时间从下一分钟不等, 两步光刻与重叠区域 (十五年代的硅芯片, 四十五年代的玻璃玻片), 以2-3 分钟的完全曝光。不要在基底上使用盖玻片 (熔融石英除外), 因为它会阻挡 UV 光。- 剪切打印的光掩模 (请参阅带有示范性光刻口罩和补充部分5的补充文件) 到适当的尺寸, 以适合合适的面罩支架, 可在现场停止位置插入 (图 2B)。对于精确的多步光刻, 请将面罩与刀柄上的对准标记对齐。
- 将基底置于显微切片上, 然后将其移至显微镜阶段。对于 Bephore 玻片的图案, 在显微切片和 Bephore 滑块之间插入黑色箔 (如印刷光掩模的备用箔), 为光刻提供深色背景。
- 在照明路径中插入一个红色滤镜, 将焦点放在基底表面上, 然后导航到基底的区域, 这将被曝光,例如划痕尖端的区域。
- 插入遮罩支架, 阻止照明并更改 UV 滤镜 (图 2C)。在低光照强度下, 打开快门并使用相机将面罩快速聚焦在基底上。
- 阻挡相机的光路, 并在高光强度下照亮基底, 以达到所需的曝光时间。
- 从显微镜中取出样品, 并小心地从承印物中取出尽可能多的缓冲液, 而不干燥。
- 添加10-20 µL 的 DNA 与 DIS 序列。将基底放置在潮湿的盒子中, 防止其干燥。在室温下孵育 2 h (寡核苷酸在微摩尔浓度) 或几个小时/过夜 (kbp 长的 dna 在大约 100 nM 浓度) 的基板上的 dna。
- 从芯片中取出 DNA, 用 1x PBS 清洗几次。为了减少 dna 的浪费 (特别是对于较长的片段), 储存从基质中提取的 dna 并重新使用。
- 多步光刻
注意: 为了精确对准单个区域中的两个或多个曝光, 请将样品保持在舞台上, 以避免角度偏差。确保芯片不干燥。对于在基板上不同区域的多个 DNA 画笔的定位, 请使用机动阶段驱动到指定区域或使用具有适当对准标记的基板。- 第一次接触后 (第3.2 节), 在基底上孵育 DNA。第一次曝光所产生的所有绑定站点都被占用是很重要的。因此, 孵育寡核苷酸 (10 µM) 约3小时在 RT。
- 要固定标记基因, 将它们放置在基板上几个小时或一夜的 rt, 然后清洗样品, 并在 rt 中添加 2 h 的钝化混合物. 继续下一次曝光。
- 有关其他曝光, 请重复上述步骤 (3.2.3 3.3.2)。
4. PDMS 设备
注意: 最好在洁净室工作。一个 PDMS 设备的制造遵循一个标准协议, 如麦当劳等描述. 30
- 通过光刻制作主模具
- 通过超声在丙酮中以5分钟的高功率清洁硅晶片 (直径为76.2 毫米、525µm 厚度), 用异丙醇和去离子水冲洗。然后将晶片放在150摄氏度的热板上15分钟。
- (可选) 为了提高对晶片的抗粘连性, 在三十年代加入2-3 毫升粘合启动子, 旋转 3000 rpm. 将晶片加热至120摄氏度, 2 分钟。
- 添加约2-3 毫升光刻胶 (见材料表)。旋转晶片的十五年代在 500 rpm, 然后在 3000 rpm 三十年代。这将导致20µm 厚的光刻胶层。让光刻胶层在室温下放松10分钟。
- 对于预曝光烘烤, 将晶片放在50摄氏度的热板上2分钟, 然后在85摄氏度下放置5分钟。
- 将晶片放在光掩模下, 并使用隔间的蓝图。最好使用面罩定位仪。光掩模的分辨率应为 6.4万 dpi (参见带有光刻面罩的补充文件和补充部分 5)。
- 通过光掩模将晶片暴露在紫外光 (I 线 5-10 mW/厘米2) 的1分钟。
- 对于曝光后烘烤, 将晶片放在50摄氏度2分钟, 然后在85摄氏度下放置5分钟。让晶片冷却下来, 在室温下放松1小时。
- 将晶片放入盘子中, 开发人员3分钟, 轻轻搅拌烧杯。用异丙醇冲洗晶片, 用氮气枪擦干。将晶片放在130摄氏度的热板上45分钟。
- PDMS 装置的制备
- 将 pdms 基和 pdms 固化剂混合在一个10:1 的比例, 并将其倒入一个密闭容器中的晶片上, 直到晶片上方形成约 5 mm 的层。要获得仅为 1 mm 厚度的 pdms 设备, 请在 100 rpm 的情况下, 用 pdms 旋转涂层晶片2分钟。
- 将容器放置在干燥器中, 并应用真空 (约85帕) 约30分钟。然后, 加热 PDMS 到约 70°c 1-2 h 在一个烤箱。
- 将 PDMS 设备与晶片分离。将 PDMS 切成台阶, 使每件都包含一组隔间。如果 PDMS 将连接到微流控装置, 在供应通道末端的孔 (直径为 1 mm) 作为入口和出口。
- 用异丙醇和去离子水清洁 PDMS, 用氮气枪擦干。存储 PDMS 无尘。
5. 分割基因表达
注: 以下过程描述了样品架的组装 (图 3), 用于观察倒置显微镜上的分形基因表达, 并使用笼式恒温器进行温度控制。该支架采用现成的材料和工具 (3.5-5 毫米厚聚氯乙烯 (PVC) 塑料、螺钉和螺母、钻头) 制成, 可根据不同类型的显微镜进行定制。应执行5.1 和5.2 中描述的步骤, 以便持有者的两个部分同时准备就绪。
- 底部支架组件
- 使用双面胶带 (图 3B) 准备带有对准标记 (例如刮痕) 的 Bephore 芯片并将其粘附到芯片支架上。芯片应大于将覆盖它的 PDMS 设备。
- 固定芯片上的一个或多个基因 (参见章节2和 3)。
- 在底部支架的中心孔周围添加一些真空润滑脂, 然后插入芯片支架。
注: 芯片支架现在通过润滑脂附着在底部支架上, 同时保留在 x-y 平面中重新定位芯片的可能性。
- 顶部支架组件
- 使用步骤4.2.1 中的旋涂工艺, 准备一个带隔层的薄型 PDMS 芯片。尽可能小地切断 PDMS, 使通道向一侧开放, 以允许通过扩散交换废物和前体分子。
- 将玻璃盖板 (24 mm x 24 mm, 1.5) 和 PDMS 芯片 (侧面无夹层) 的背面清洁至四十二年代的氧气等离子体 (在法拉第笼中以 200 W 和0.8 毫巴操作)。
- 将 PDMS 芯片放在玻璃滑块的中心, 并将隔间朝上。用 PDMS 在70摄氏度烘烤玻璃1小时。
- 在顶部支架的大孔周围添加一些真空润滑脂。
- 在开始试验之前, 四十二年代用氧气等离子体清洁玻璃滑块和 pdms 芯片, 使 pdms 亲水性。
- 将玻璃滑块与 PDMS 放在顶部支架上 (图 3C), 然后将玻璃轻轻按压到润滑脂上 (图 3C)。
- 支架总成
- 准备100µL 的无细胞表达系统, 并保持它在冰上。
- 小心地从芯片中取出缓冲器, 用10µL 的无细胞表达系统清洗一次。接下来, 将60µL 的无细胞表达系统添加到芯片上, 并从芯片边缘卸下双组分硅胶胶水 (图 3B中已删除)。
- 将20µL 的表达系统添加到 PDMS 上。将液滴放到 PDMS 上后, 快速检查立体显微镜, 使隔间很湿, 没有气泡。如果有气泡, 试着用其余的无细胞表达系统清洗它们。
- 要组装两个支架并对齐腔室和 DNA 画笔, 请在立体显微镜下工作, 并将底部支架固定在夹持器臂上, 这样两个螺钉和眼热就可以方便地使用双手 (图 3D-F).
- 将顶部支架插入底部支架并将其向下, 直到无细胞表达系统液滴保险丝 (图 3D)。检查立体显微镜, 无论隔间和对准标记是否在 x-y 平面的相似区域内, 否则向上拉动顶部支架并将玻璃滑块重新定位在顶部支架上。
- 从底部拧紧眼热直到触点底部。小心拧紧眼热, 同时通过芯片支架底部的手柄将隔间和芯片对准 x y 平面 (图 3E)。一旦接触, 只需轻轻拧紧眼热 (图 3F)。
注意: 此步骤需要一些经验, 并取决于实验设置。在显微镜下, 在 PDMS 和玻璃之间的液体产生的干扰模式可以表明施加的力太小, 而较低的荧光强度 (从脱氧核糖核酸画笔或表达的蛋白质) 在隔间的中心提示在一个太高压力 (另见补充信息, 第6节)。 - 用清水将海绵喷入防蒸发外壳中, 然后将支架插入盒中。用双组分硅胶胶填充5毫升注射器, 并用它密封盒 (图 3G)。
- 将盒子转移到温度控制显微镜, 并在荧光显微镜中成像 DNA 画笔和反应。即使没有光照, DNA 画笔的荧光也会在无细胞表达系统中消失。然而, 画笔保留其活动, 因为可以通过重复的基因表达从相同的画笔显示。
注意: 当使用 Bephore 玻片而不是硅芯片时, 可以交换 PDMS 和 Bephore 芯片的位置 (顶部/底部), 允许使用较小工作距离的目标。
6. 微流控器件的持续表达
注: 实验设置由图 4A所示的部件组装而成。有关温度控制阶段的装配的详细信息载于补充资料 (第7节)。
- 无细胞表达系统和管材
- 在样品管中制备无细胞表达系统 (约200µL)。用荧光染料标记的聚苯乙烯珠子可以添加到以后通过供应通道监控流速。
- 将管子连接到压力控制器。把管子放在一个大的冰库里, 保持寒冷12小时。必要时补充冰块。
注: 作为压力控制器的替代品, 注射器泵提供恒定的无细胞表达系统流速, 即使流动阻力发生变化,例如由于气泡, 这可能有助于长期实验。 - 将含有无细胞表达系统的管子连接到 PTFE 管 (内径为 0.8 mm), 达到加热阶段。将注射器针 (直径为 0.9 mm) 拆成1-2 厘米的钝端, 并将一块插入聚四氟乙烯管中。之后, 它将成为 PDMS 的连接器。尽量减少阶段和管子之间的油管长度 (图 4C)。
- 要冷却聚四氟乙烯管, 请将其缠绕在连接到冰水油藏和蠕动泵的较大橡胶管上。将它们连同苏格兰胶带一起胶带 (图 4C)。
- 顶部支架组件
- 用氧等离子体清洁 pdms 芯片的扁平侧 (四十二年代), 并将其放置在带有孔的显微镜滑块上, 并安装在 pdms 的入口和出口处 (图 4B)。玻璃孔可以事先用玻璃钻头钻孔。确保微室不朝向玻璃滑块。
- 将双面胶带涂在 PDMS 支架的扁平侧。在夹持器的两个孔之间的区域中粘贴一块黑色箔 (例如, 从光刻面罩), 以避免胶带上的背景荧光。
- 将带有 PDMS 芯片的玻璃滑块粘在支架上。
- 在等离子清洁器 (四十二年代) 中, 将含氧等离子体的玻璃玻片与 pdms 和 pdms 支架一起处理。
- 在顶部支架的大孔周围涂抹真空润滑脂, 然后插入 PDMS 支架 (图 4B)。PDMS 支架现在附着在顶部支架上, 同时保留在 x-y 方向重新定位的可能性。
- 将 PTFE 管与注射器针接头连接到 PDMS 芯片的入口。为便于通过顶部支架进入 PDMS, 可在此和以下步骤中简要删除上部塑料板。
- 在出口处插入第二片聚四氟乙烯管 (约5厘米), 并将注射器针接头 (图 4D)。
- 将 PDMS 支架放置在顶部支架上, 以便在所有方向上自由移动。如图 4E所示, 将顶部固定器松散地放在加热台上, 无需拧紧任何眼热。
- 使用显微镜, 导航到 PDMS 隔间的位置, 并将它们集中在摄像机的视野中。不要从此时移动舞台。
- 从舞台上取下与 PDMS 的顶部支架。
- 加热级和 Bephore 玻片
- 将加热阶段的温度设置为37摄氏度
- 将 Bephore 玻璃滑块 (no. 4) 与基因画笔结合使用双面胶带的倒置荧光显微镜的温度控制阶段, 其对准标记大约在显微镜视野的中心。对齐标记的这种定位可确保隔间将大致降低到同一个区域。
- 在基因画笔的相应荧光通道中拍摄图像, 并在相机图像中标记其位置。
- 从基因刷中取出缓冲液, 但不要让它变干。将无细胞表达系统的20µL 添加到基因画笔中, 并用镊子去除硅胶胶架。
- 微流控装置的组装
- 向样品管添加压力, 直到无细胞表达系统填充 PTFE 管并出现在 PDMS 设备的底部。此外, 移液器10µL 无细胞表达系统到 PDMS 的微室。确保隔间没有气泡。
- 小心地将顶部支架放在玻璃滑块上, 并将微室与基因画笔对齐。在 pdms 和对准标记到达相同的焦平面之前, 使用 pdms 支架背面的小螺钉将 pdms 设备的 x-y 位置和方向精确对准基因画笔 (图 4E)。
- 按住该位置并将 PDMS 按在玻璃滑块上, 方法是将顶部支架与显微镜级连接的螺钉拧紧眼热 (图 4E)。
- 增加含有无细胞表达系统的管内的压力, 并通过供应通道监测荧光珠的流动 (建议流速为每小时0.5 至5µl) (图 4F)。如有必要, 通过拧紧眼热, 增加 PDMS 在玻璃上的压力。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
两步光刻:图 5显示了在带有重叠图案的荧光标签的玻璃滑块上进行两步光刻工艺的结果。
从基因画笔中的荧光蛋白的表达:图 6显示了固定 DNA 中荧光蛋白 YPet 的表达。在一些时间点, 我们通过部分漂白荧光蛋白和观察荧光信号的恢复来评估基因表达率, 无视直接恢复, 这不是由蛋白质表达造成的。在两小时的表达后第一次漂白后, 荧光强度迅速恢复, 并在漂白前上升到其价值之上。四和六小时后, 荧光没有恢复到其先前的强度, 表明没有新鲜的表达混合的供应, 反应终止后约3-4 小时。
微流体耦合: 通过微流体向表达室提供额外的前体分子, 可以持续较长时间的基因表达。图 7显示了这样一个系统, 使 YPet 的表达式超过 10 h。
TIRF 观察: Bephore 也可用于研究荧光标记蛋白与 DNA 画笔在单分子水平上的相互作用。特别是在嘈杂的环境中, 光刻有助于区分特定的和非特异性的与画笔或表面的相互作用。图 8给出了这样一个例子, 荧光标记 T7 RNA 聚合酶结合或优先地附着在 DNA 画笔与周围表面相比。
图 1: Bephore 光刻. a.具有二氧化硅表面 (2) 的基底覆盖有生物素化聚乙烯乙二醇 (PEG bt) 层, 这是生物相容性的, 允许通过photocleavable DNA 发夹附着生物素-链霉亲和作用。在这里, PC 包含序列域abcb *和 photocleavable 修改 (紫色星), 并与链 PH 与域a *杂交。B.紫外线 (UV) 照明劈开 PC, 将 DNA 片段 (cb *) 释放到溶液中。C D.所产生的单链区域在 PC (b) 帮助作为一个立足点的 PH 值置换荧光标记 (绿星) DIS 链。E.也更长, 双链 DNA ("模板") 可以附加到图案表面。这种 DNA 是通过 pcr 制备的, 其 5 ' 末端带有一个 DIS 序列, 其中底漆和 dis 由三乙二醇垫片隔开, 在 PCR 过程中保持单链滞留 (参见补充信息, 章节 2-4)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 光刻的样品制备。a.将带有对准标记的 Bephore 芯片放置在显微镜滑块或其他芯片支架上 (例如图 3B中的支架)。将双组分硅胶胶作为沿芯片边缘的疏水性屏障 (步骤 3.1. 2-3)。B.将面罩放在面罩支架上。在这里, 我们删除了光圈的现场停止和修改它的持有人, 所以面具可以由小磁铁举行。对于多步光刻中的精确 (角度) 对准, 确保刀柄上的对准标记和蒙版匹配 (步骤 3.2.1)。C.要在芯片上导航并将蒙版与芯片上的对准标记对齐, 请在红色滤镜中滑动。对于 uv 曝光, 请插入 uv 滤镜 (步骤 3.2. 2-5)。图从以前的工作27的支持信息中再现。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 用于观察分割基因表达的支架的组装。A.支架的零件 (标尺单位: 厘米)。B C.支架的顶部和底部分别组装, 底部支架带有一个带图案的 Bephore 芯片 (第5.1 节) 和顶部支架, 带有带隔层的 PDMS 芯片 (第5.2 节)。D F.芯片和 PDMS 被小心地带入紧密接触, 同时观察和调整夹层和 DNA 画笔在一个立体显微镜 (步骤 5.3. 1-6)。G.将支架转到倒置的温度控制显微镜之前, 整个系统将封装在防蒸发盒中 (步骤 5.3. 7-8)。图从以前的工作27的支持信息中再现。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 微流控装置和样品支架, 用于分割基因表达。A.样品架、PDMS 装置、温度控制显微镜阶段和 Bephore 玻片 (标尺单位: cm) 的零件。B.将 pdms 带隔层的显微镜滑块粘在 pdms 支架上, 并在等离子清洗器中与 pdms 一起接触氧等离子体。然后将 PDMS 插入顶部支架 (步骤 6.2. 2-5)。C.无细胞表达系统管连接到压力控制器并放置在冰上。无细胞表达系统的油管 (插页中的红色虚线) 通过橡胶管 (蓝色虚线) 进行冷却, 通过该管道可通过蠕动泵 (6.1 节) 泵送冰水。D.油管连接到 PDMS 装置上的入口位置。另一块油管连接到插座 (步骤 6.2. 6-7)。E.顶部支架放置在显微镜台上, 并小心地朝 Bephore 滑动。pdms 支架仍可在 x-y 平面中移动, 使 pdms 中的隔间与 Bephore 芯片上的基因画笔对齐。眼热用于将 PDMS 压到 Bephore 芯片上, 并将顶部支架固定到显微镜阶段 (步骤 6.4. 1-3)。F.无细胞表达系统通过 PDMS 中的微通道泵送, DNA 画笔中的基因表达可以通过落射荧光显微镜 (步骤 6.4.4) 进行监测。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: 两步光刻。a B.荧光标记寡核苷酸 (绿色: ATTO 532; 红色: Alexa 福陆 647)通过面具投影光刻连续固定在 Bephore 玻片上, 曝光时间为四十五年代. 绘制 a 和 B 的叠加, 展示了单次曝光的精确对准。比例尺:10 µm.请单击此处查看此图的更大版本.
图 6: 分割基因表达。a. Bephore 玻片上的 DNA 画笔 (UV 曝光时间: 2 分钟), 用于荧光蛋白 YPet 的编码与 PDMS 芯片上的一个隔间对齐 (参见第5和图 3)。B. DNA 在腔室中的基因表达产生了一个强荧光信号, 其蛋白质浓度梯度沿通道形成, 将腔室与 PDMS 装置外的表达混合连接在一起。没有固定化基因的控制室仍然相对较暗。C.两个腔室随时间推移的荧光强度剖面。每两小时荧光蛋白部分漂白 (黑色箭头), 以检查表达式是否仍处于活动状态。4小时后, 荧光没有恢复到先前的强度, 表明表达已终止。比例尺: 300 µm.请单击此处查看此图的更大版本.
图 7: 持续的分割基因表达。a. Bephore 玻片上的 DNA 画笔 (UV 曝光时间: 2 分钟), YPet 编码与 PDMS 芯片上的隔间对齐。这些隔间连接到一个供应通道 (白色箭头), 通过它可以抽取无细胞表达系统 (参见第6节和图 4)。B.含有基因画笔的隔间显示了 YPet 表达 (绿色) 中的无细胞基因表达系统的荧光信号。没有基因刷的相邻隔间仍然相对较暗。无细胞表达系统的新鲜成分流经供应通道并扩散到隔间, 而废弃产品则被运走。C.两个腔室随时间推移的荧光强度剖面。荧光蛋白在不同时间点 (黑色箭头) 部分漂白, 以检查表达是否仍处于活动状态。由于供应通道中的流量, 基因表达保持至少10小时. (红色箭头标记的红迹中的峰值是由气泡暂时从隔间排出的) 引起的。比例尺:50 µm.请单击此处查看此图的更大版本.
图 8: 全内反射荧光显微镜 (做) 中 Bephore 玻片的单分子研究。A.目标型做使单分子成像接近玻璃-水界面。我们固定荧光标记基因 (绿色, ATTO 532, UV 暴露时间: 2 分钟) 与 T7 启动子沿光刻定义的条纹和观察 T7 RNA 聚合酶的行为 (橙色, 标记为 Alexa 氟 647) 与表面相互作用。B.荧光图像显示固定基因的两条条纹。C. T7 RNA 聚合酶专门和非特定地附着在表面 (单张图像, 50 ms 曝光时间)。D.从荧光视频的所有帧获得的平均图像 (如子图形 C 中的5000帧) 暴露了 RNA 聚合酶与 DNA 画笔的特定相互作用。比例尺:10 µm.请单击此处查看此图的更大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bephore 光刻技术是一种强大而通用的方法, 用于 DNA 或 RNA 的图案固定化。然而, 该过程包括几个步骤, 如果发生更改, 则可能是系统故障或性能降低的原因。
制造 Bephore 芯片的关键步骤是基底的聚乙二醇化, 它提供了表面的生物相容性。在这里, 使用 RCA 过程的清理步骤非常重要, 因为它还激活了后续硅烷化的表面。在实际聚乙二醇化中, 基体不能干燥。此外, 硅烷 PEG-生物素必须妥善储存, 以保持其反应性 (第1.2 节) 并避免交联。为了评估聚乙二醇化的结果, 基质可以用荧光标记的链霉素孵化, 并与非聚乙二醇对照。成功的聚乙二醇基底应比对照组具有更大的亲和链霉素。
此外, 在光刻工艺的后期阶段, 芯片的干燥会产生不良影响,例如在去除已经绑定的 dna 或对基材上未暴露的区域进行更高的 dna 吸附。
如上所述 (第3.2 节), 光刻工艺的分辨率和必要的曝光时间取决于实验设置 (物镜、光源等)。因此, 在第一步, 应测试各种曝光时间。
对于基因表达实验, 应定制实验装置以适应可用的硬件 (显微镜、温度控制等)。我们展示了两个这样的实现, 一个用于短实验 (4 h, 第5节), 其中系统被封装在一个盒子中, 以减少表达式混合物的蒸发, 另一个用于长时间观察 (第6节), 其中微流控器件使连续前体分子的供应。在这两种情况下, DNA 画笔在 PDMS 的基底和隔间的对齐代表了最棘手的步骤。因此, 我们建议在使用带图案的基板前多次尝试此步骤 (参见补充信息, 第6节)。在大型系统的不同的基因画笔, 长潜伏期, 精确的角对齐室和画笔远距离, 并通过吸附 DNA 到非图案区域的污染, 根据钝化的质量, 可能对实际可行系统的大小构成限制。
这项技术的一种替代方法是通过 Karzbrun等来证明的。25, 世卫组织通过电感耦合等离子体反应离子蚀刻 (博世工艺) 在芯片中创建隔间, 其次是二氧化硅层的等离子体增强气相沉积 (等离子体)。通过移液机器人对纳升 DNA 液滴进行表面功能化、阵列和放置后, 隔间用 PDMS 盖玻片闭合。这种方法的优点是 DNA 可以直接固定在隔间内, 而不会污染附近的腔室, 但需要额外的制造步骤和实验室设备。
此处提供的协议使研究人员能够在无细胞合成生物学中进行研究, 从基于解决方案的设置转移到基于芯片的反应容器。利用 dna 链位移作为抗蚀剂开发过程中的中心步骤, 可以使用独特的 DNA 序列对暴露区域进行标记, 从而为生物相容多步法光刻提供了一种简便的方法。与微流体结合, 可在较长时间内观察基因表达过程。除了研究开放流反应器条件下的无细胞基因表达过程外, 同样的方法也可用于固定和空间地组织芯片表面上的其他生物分子。这对于各种各样的功能性和生物物理学研究是有用的, 例如在这里演示的基于荧光的单分子实验。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢大众基金会 (89 883) 和欧洲研究理事会 (赠款协议 no. 694410-AEDNA) 对该项目的财政支持。硕士学位。确认通过 GRK 2062 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180x240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
References
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
- Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
- Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
- Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
- van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
- Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
- Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
- Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
- Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
- Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
- Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
- Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
- Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
