Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Storstilet Top-down Proteomics brug af kapillar Zone elektroforese Tandem massespektrometri

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58644
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2,3, 1
1Department of Chemistry, Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics, Indiana University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

En detaljeret protokol er beskrevet for adskillelse, identifikation og karakterisering af proteoforms i protein prøver ved hjælp af kapillar zone elektroforese-electrospray Ionisation-tandem massespektrometri (CZE-ESI-MS/MS). Protokollen kan bruges til høj opløsning karakterisering af proteoforms i enkle protein prøver og omfattende identifikation af proteoforms i komplekst proteom prøver.

Abstract

Kapillar zone elektroforese-electrospray Ionisation-tandem massespektrometri (CZE-ESI-MS/MS) er blevet anerkendt som et nyttigt redskab for top-down proteomics, der har til formål at karakterisere proteoforms i komplekse proteomes. Men anvendelsen af CZE-MS/MS for storstilet top-down proteomics har været hæmmet af lav prøve-loading kapacitet og smalle adskillelse vindue af CZE. Her, er en protokol, der beskrevet ved hjælp CZE-MS/MS med en microliter-skala prøve-loading volumen og en 90-min adskillelse vindue for storstilet top-down proteomics. CZE-MS/MS platformen er baseret på en lineær polyacrylamid (LPA)-coatede adskillelse kapillær med ekstremt lav elektroosmotisk flow, en dynamisk pH-junction-baseret online prøve koncentration metode med en høj effektivitet for protein stabling, en Electro-kinetically pumpede kappe flow CE-MS interface med ekstremt høje følsomhed og en ion trap massespektrometer med høj opløsning og scanne hastighed. Platformen kan anvendes til høj opløsning karakteriseringen af simple intakt protein prøver og storstilet karakterisering af proteoforms i forskellige komplekse proteomes. Som et eksempel, er en yderst effektiv adskillelse af en standard protein blanding og en yderst følsom påvisning af mange urenheder ved hjælp af platformen påvist. Som et andet eksempel, denne platform kan producere mere end 500 proteoform og 190 protein identifikationer fra en Escherichia coli proteomet i en enkelt CZE-MS/MS køre.

Introduction

Top-down proteomics (TDP) sigter mod en storstilet karakterisering af proteoforms inden for en proteomet. TDP er afhængig af effektiv væske-fase adskillelse af intakt proteiner før electrospray Ionisation-tandem massespektrometri (ESI-MS/MS) analyse på grund af den høje kompleksitet og stor koncentration dynamikområde af proteomet1,2 ,3,4,5. Kapillar zone elektroforese (CZE) er en kraftfuld teknik til separation af biomolekyler baseret på deres størrelse-til-lade nøgletal6. CZE er relativt simpel, kræver kun en åben rørformede fused silica kapillær, en baggrund elektrolyt (BGE) og en strømforsyning. En prøve af intakt proteiner kan indlæses i kapillær bruge pres eller spænding, og adskillelse er initieret af nedsænkning begge ender af kapillar i BGE og anvender en høj spænding. CZE kan henvende sig til ultra-høje adskillelse effektivitet (> 1 million teoretiske plader) til adskillelse af biomolekyler7. CZE-MS har en drastisk højere følsomhed end almindeligt anvendte omvendt-fase væskekromatografi (RPLC)-MS til analyse af intakt proteiner8. Selvom CZE-MS har et stort potentiale for store top down proteomics, har dens bred anvendelse i proteomics været hæmmet af flere problemer, herunder en lav prøve-loading kapacitet og smalle adskillelse vindue. Den typiske prøve lastning diskenheden i CZE er omkring 1% af den samlede kapillær volumen, som normalt svarer til mindre end 100 nL9,10,11. Vinduet adskillelse af CZE er normalt mindre end 30 min på grund af stærkt elektroosmotisk flow (EOF)9,10. Disse spørgsmål begrænse CZE-MS/MS til identifikation af et stort antal proteoforms og lav rigelige proteoforms fra et komplekst proteom.

Stor indsats har gjort at forbedre prøven lastning volumen af CZE via online prøve koncentration metoder (f.eks.fast-fase microextraction [SPME]12,13, felt-enhanced prøve stabling [FESS]9 , 11 , 14, og dynamisk pH junction15,16,17,18). FESS og dynamisk pH junction er enklere end SPME, der kun kræver en betydelig forskel mellem prøvebuffer og BGE i ledningsevne og pH. FESS beskæftiger en prøvebuffer med meget lavere ledningsevne end BGE, fører til en stabling af analysander på grænsen mellem prøve zone og BGE zone i kapillar. Dynamisk pH junction udnytter en grundlæggende prøve plug (f.eks., 50 mM ammoniumbicarbonat, pH 8) og en syrlig BGE (fx, 5% [v/v] eddikesyre, pH 2.4) på begge sider af prøven plug. På begæring af en høj positiv spænding enden injektion af kapillar opstår titrering af grundlæggende prøve plug, fokuserer analysander i en stram stik før det gennemgår en CZE adskillelse. For nylig, gruppen solen systematisk sammenlignet FESS og dynamisk pH krydset for online stabling af intakt proteiner, demonstrerer, at dynamiske pH junction kunne producere langt bedre ydeevne end FESS for online koncentrationen af intakt proteiner når Injektionsvolumen prøve blev 25% af den samlede kapillære bind19.

Neutralt belagt adskillelse kapillærer (f.eks.lineær polyacrylamid [LPA]) har været ansat til at reducere EOF i kapillær, bremse CZE adskillelse og udvide adskillelse vindue20,21. For nylig, Dovichi gruppen udviklet en enkel procedure for udarbejdelse af stabil LPA belægning på indersiden af kapillærer, udnytte ammonium persulfat (APS) som initiativtager og temperatur (50 ° C) for frie radikaler produktion og polymerisation22 . Ganske nylig, gruppen solen ansat kapillær LPA-belagt adskillelse og dynamisk pH junction metode til CZE adskillelse af intakt proteiner, at nå frem til en microliter-skala prøve lastning diskenheden og en 90-min adskillelse vindue19. CZE systemet åbner døren til ved hjælp af CZE-MS/MS for storstilet top-down proteomics.

CZE-MS kræver en yderst robust og følsom interface til par CZE til MS. Tre CE-MS grænseflader har været godt udviklede og kommercialiseret i historien om CE-MS, og de er den co-axial kappe-flow interface23, den sheathless interface ved hjælp af en porøs tip som ESI emitter24, og den electro-kinetisk pumpede kappe flow interface25,26. Den electro-kinetically pumpede kappe-flow-brugergrænseflade-baseret CZE-MS/MS har nået et lavt zeptomole peptid påvisning grænse9, over 10.000 peptid identifikationer (IDs) fra HeLa celler proteomet i én køre14, en hurtig karakterisering intakt proteiner11, og meget stabil og reproducerbar analyser af biomolekyler26. For nylig, LPA-belagt adskillelse kapillær, metoden dynamisk pH junction og electro-kinetically pumpede kappe flow interface blev brugt til store top down proteomanalyse af en Escherichia coli (E. coli) proteomet19 ,27. CZE-MS/MS platform henvendte sig til over 500 proteoform-id'er i en enkelt køre19 og næsten 6.000 proteoform id'er via kobling med størrelse-udelukkelse kromatografi (SEC)-RPLC fraktionering27. Resultaterne viser tydeligt CZE-MS/MS kapacitet til store top down proteomics.

Heri, er en detaljeret procedure for at bruge CZE-MS/MS til store top down proteomics beskrevet. CZE-MS/MS system beskæftiger LPA-belagt kapillær at reducere EOF i kapillær, dynamisk pH junction metode for online koncentrationen af proteiner, electro-kinetically pumpede kappe flow interface til kobling CZE til MS, en orbitrap masse spektrometer til indsamling af MS og MS/MS-spektre af proteiner, og en TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identifikation og karakterisering) software til proteoform ID via databasesøgning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af LPA belægning på indersiden af adskillelse kapillær

  1. Forbehandling af kapillær
    1. Skyl en smeltet silica kapillær (120 cm i længde, 50 µm i indre diameter [id], 360 µm i ydre diameter [OD]) successivt med 500 µL 1 M natriumhydroxid, deioniseret vand, 1 M saltsyre, deioniseret vand og LC-MS grade metanol ved hjælp af en sprøjten pumpe.
    2. Tørre kapillær med nitrogen gas (10 psi, ≥ 12 h) og fyld kapillar med 50% (v/v) 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylat i methanol ved hjælp af en sprøjten pumpe. Forsegle begge ender af kapillar med silica gummi og der inkuberes ved stuetemperatur i mindst 24 timer.
      Bemærk: Under dette trin, den indre væg af kapillar er functionalized med C = C. længere inkubation resulterer i bedre kapillær belægning på grund af en mere komplet reaktion.
    3. Skær en lille del (~ 5 mm) af kapillar fra begge ender med en cleaving sten. Skyl kapillær med methanol (500 µL) ved hjælp af en sprøjte pumpe til at rense op i ureageret reagenser. Tørre kapillær med nitrogen gas (10 psi, ≥12 h).
  2. Forberedelse af LPA belægning
    Bemærk: Denne procedure er baseret på Zhu et al. 22 med mindre ændringer.
    1. Forbered en acrylamid løsning (40 mg af akrylamid i 1 mL af vand) og ammonium persulfat (APS) løsning (5% [w/v] i vand).
    2. Tilføje 2-3 µL af opløsningen APS til 500 µL af opløsningen acrylamid, vortex blandingen, og degas det med nitrogen gas for 5 min at fjerne ilt i løsningen.
    3. Læg blandingen i massiv kapillarrør ved hjælp af et vakuum, forsegle begge ender af kapillar med silica gummi, og Inkuber i et vandbad på 50 ° C i 40 min.
    4. Fjern en lille del (~ 5 mm) af kapillar fra begge ender med en cleaving sten. Skubbe den ureageret løsning ud af kapillar med vand (200 µL), ved hjælp af sprøjten pumpe.
      Bemærk: Sørg for polymer skubbet ud af kapillar er en Agarosen gel-lignende konsistens. En længere inkubation trin (op til ~ 45-50 min.) kan resultere i en bedre kapillær belægning. Med længere reaktion kapillar kan blive blokeret og højt tryk er forpligtet til at skubbe ud polymer med vand. En HPLC pumpe kan bruges til dette formål.

2. ætsning af kapillar med flussyre

Forsigtig: Brug passende sikkerhedsprocedurer mens håndtering af flussyre (HF) løsninger. Alle HF-relaterede operationer skal gøres i en kemisk hætte. Inden enhver HF-relaterede, Sørg for, at 2,5% calcium gluconat gel er tilgængelige til brug i tilfælde af eksponering. Dobbelt handsker er nødvendige, en typisk nitrilhandske inde og en kraftig neopren handske uden for. Bære en lab coat og kemiske beskyttelsesbriller. Efter HF operationer, adskille flydende og fast affald. Den flydende HF affald skal neutraliseres omgående med en høj koncentration natriumhydroxidopløsning til midlertidig oplagring før affald pick-up. HF affald skal være midlertidigt opbevares i en plastikbeholder, der er foret med to tykke plast one-gallon Ziploc poser og et låg. Både de faste og flydende affald skal mærkes korrekt.

  1. Brænde en del af kapillar ved hjælp af en blid flamme (fxlomme lettere) at fjerne polyimid ydre-belægning (1 cm i længden) ca 4 cm fra ene ende af kapillar. Forsigtigt rense den brændte del af kapillar ved aftørring for at fjerne den polyimid, belægning helt.
    Bemærk: Gå videre med forsigtighed, som del af kapillar uden polyimid belægning vil være lidt skrøbelig.
  2. Bore et lille hul i slutningen af en 200-µL rør omkring samme størrelse som den kapillære ydre diameter til tilstrækkelig holde kapillar på plads, når det er gevind gennem dette hul. Tråd i slutningen af den kapillar, der er tæt på den brændte del gennem hullet, indtil den brændte del er i røret.
    Bemærk: Det anbefales at teste størrelsen af hullet med udgangen af kapillar fra den brændte del at sikre den korrekte størrelse, da den brændte del af kapillar er skrøbelige.
  3. Føje ~ 150 µL af HF (48-51% opløsning i vand) til 200 µL røret, så HF løsning er omkring halvvejs op den brændte del på kapillar. Inkuber kapillær i HF løsning ved stuetemperatur i 90-100 min.
    Bemærk: Det anbefales at et andet hul er lavet i låget af glasset og nogle små objekt (f.eks., en lille pipette tip) bruges til at holde op i røret, mens inkubation finder sted. Pipette tip kan bruges til at punktere skum eller nogle andre solid platform hvorfra reaktionskammeret kan hænge fra, at skabe et sikkert miljø. Lægge papirhåndklæder under røret indeholder HF og korrekte procedurer i tilfælde af et olieudslip.
  4. Fjerne kapillar fra røret og vaske ydre med deioniseret vand for at fjerne enhver resterende HF.
    Bemærk: Sikre, at den udvendige diameter af kapillar på den smalleste del af den brændte del er nu mindre end 100 µm, som det skal være.
  5. Skær den ætsede del af kapillar på midten af den smalleste del ved hjælp af en cleaving sten til at producere en adskillelse kapillær med mindre end 100 µm i OD i den ene ende. Skær ikke ætset årets kapillær at få en 1-m adskillelse kapillær.
    Bemærk: Afhænde HF affald efter institutionelt foreskrevne protokol.

3. forberedelse af prøverne

  1. Forberedelse af en standard protein blanding
    1. Forbered en standard protein blanding indeholdende cytokrom c (Cyto.c, 12 kDa, 0,1 mg/mL), lysozym (14.3 kDa, 0,1 mg/mL), β-kaseiner (24 kDa, 0,4 mg/mL), myoglobin (16,9 kDa, 0,1 mg/mL), kulsyreanhydrase (CA, 29 kDa, 0,5 mg/mL) og bovint serumalbumin (BSA, 66,5 kDa 1,0 mg/mL) i LC-MS grade vand som en stamopløsning.
      Bemærk: Stamopløsningen kan være aliquoted og opbevares ved-80 ° C til brug.
    2. Fortynd stamopløsningen med en faktor på 10 med en 50 mM Ammoniumbicarbonatopløsning (pH 8,0) i LC-MS grade vand i CZE-MS analyse.
      Bemærk: Filtrere ammoniumbicarbonatopløsning før brug med et membranfilter (fx, 0,2 µm cellulosenitrat membran og 50 mm i diameter).
  2. Forberedelse af en E. coli -prøve
    1. Kultur E. coli (K-12 MG1655) celler i LB medium ved 37 ° C under omrystning ved 225 rpm, indtil værdien OD600 tilgange 0,7. Indsamle E. coli celler viacentrifugering (3,283 x gi 10 min.) og vask dem flere gange med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til at fjerne mediet.
    2. Suspendere E. coli celler i lysisbuffer indeholdende 8 M urinstof, proteasehæmmere og 100 mM ammoniumbicarbonat (pH 8,0) og ultrasonicate på is i 15 min. ved hjælp af en ultralyds celle disruptor med en kop horn for komplet celle lysering.
      1. Sat Duty Cycle (%) til 50 og Output-kontrol til 7 for ultralyd celle disruptor.
    3. Centrifugeres den lysate på 18.000 x g i 10 min. indsamle supernatanten og kassér pelleten. Bruge en lille delprøve af supernatanten for protein koncentrationsmåling med bicinchoninic syre (BCA) assay.
      Bemærk: Lysate skal være fortyndet mindst med en faktor på tre at reducere urinstof koncentration lavere end 3 M for at blive kompatible hos BCA assay. BCA analysen udføres baseret på fabrikantens procedure.
    4. Mix 1 mg af E. coli proteiner med kolde acetone med et volumen-forholdet på 1:4 og holde blanding ved-20 ° C natten over at udfælde proteiner.
      Bemærk: Udfør alle eksperimenter ved hjælp af acetone i en kemisk hætte.
    5. Spin ned bundfaldne proteiner (12.000 x g, 5 min) og Fjern supernatanten. Vaske pellet med kolde acetone igen (samme mængde som før) og spin ned igen.
    6. Fjern supernatanten og tillade pellet tørre i den kemiske hood i et par minutter.
      Bemærk: Ikke overdry protein pellet.
    7. Opløse de udfældede E. coli proteiner (1 mg) i 200 µL af 8 M urinstof i 100 mM ammoniumbicarbonat (pH 8.0).
    8. Denaturere og reducere alkylatbenzin prøven.
      1. Inkuber prøve ved 37 ° C i 30 min til at denaturere proteinerne.
      2. Reducere dithiothreitol (DTT) ved at tilføje 2 µL 1 M DTT løsning (i 100 mM ammoniumbicarbonat) ind i prøven og inkubere prøve ved 37 ° C i 30 min.
      3. Alkylatbenzin proteiner med iodoacetamide (IAA) ved at tilføje 6 µL 1 M IAA løsning (i 100 mM ammoniumbicarbonat) til prøven og der inkuberes prøven i 20 min. ved stuetemperatur i mørke.
      4. Slukke den overskydende IAA med DTT ved at tilføje 2 µL 1 M DTT-opløsning og inkuberes i 5 min ved stuetemperatur. Surt prøve med myresyre (FA) til at få en endelig FA koncentration på 1% (v/v).
        Bemærk: Reduktion og alkylering er udført for at støtte udfoldelsen af proteiner for downstream fragmentering. Disse skridt vil miste oplysninger af disulfidbroer. Hvis målet er at studere disulfid obligationer på proteiner, undgå disse trin. Husk at håndtere alle koncentreret syre løsninger i en kemisk hætte.
    9. Desalt prøven ved hjælp af en C4 fælde kolonne (f.eks., 4 mm i.d., 10 mm i længden, pakket med 3 µm partikler har 300-Å porer) med et system til HPLC. Bruge en UV-detektor med en bølgelængde på 254 nm til påvisning.
      1. Angive strømningshastigheden af den mobile fase til 1 mL/min. Aktiver kolonnen ved gennemskylning det med 80% (v/v) acetonitril (ACN), 0,1% FA i vand i 10 min, og Blandingen henstår ved gennemskylning det med 2% (v/v) ACN, 0,1% FA i vand i 10 min.
      2. Belastning 500 µg proteiner over på kolonnen og desalt ved at skylle dem med 2% (v/v) ACN, 0,1% FA i vand i 10 min. ved en 1 mL/min. strømningshastighed.
      3. Elueres proteiner med 80% (v/v) ACN, 0,1% FA i vand i 3 min på en 1 mL/min. strømningshastighed. Eluatet opsamles og lyophilize det med en vakuum koncentrator.
        Bemærk: C4 fælde kolonne kan bruges til desalt store mængder af proteiner, men ikke lave mikrogram af proteiner som følge af muligt prøve tab. For begrænset protein materialer, overveje at bruge pipette tips med C4 medier for protein afsaltning. Vær omhyggelig med ikke at overdry proteiner, når lyophilizing prøven.
    10. Opløse den 500 µg af proteiner (forudsat ingen prøve tab under prøveforberedelsen) i 250 µL af 50 mM ammoniumbicarbonat (pH 8,0) for CZE-MS eksperimenter.

4. opsætning af CZE-MS/MS System og analyse af prøver

  1. Opsætning af CZE system
    1. Forberede en BGE indeholdende 5% eller 10% (v/v) eddikesyre (pH ~2.4 eller ~ 2.2) i LC-MS grade vand. Sætte ~1.5 mL af BGE i en BGE hætteglas, der matcher med pufferkar af CZE autosampler.
      Bemærk: Gøre friske BGE hver uge og ændre BGE løsning i hætteglasset hver dag at undgå kontaminering.
    2. Tilføje en prøveopløsningen (5-200 µL) til en Indsæt tube og lægge Indsæt røret i en stikprøve hætteglasset thatmatches med sample bakken af CZE autosampler.
    3. Læg prøven, BGE og adskillelse kapillær i CZE autosampler.
      Bemærk: Det sprog, der anvendes i denne protokol mest præcist afspejler brugen af en bestemt autosampler (Se Tabel af materialer), men principperne kan anvendes til andre autosamplers.
      1. Vælg eksempel indlæse på siden manuel kontrol i CZE autosampler. Indlæse BGE hætteglasset i pufferkar af autosampler, at bemærke sin position i pufferkarret. Læg prøven hætteglasset i prøven bakke med autosampler, at bemærke sin position i bakken prøve.
        Bemærk: Apparatet kan betjenes i manuel kontrol ved at klikke på billedet af instrumentet for Enhedens skærm på siden vigtigste instrument og derefter vælge Manuel under Direkte kontrol.
      2. Indlæse adskillelse kapillær i CZE autosampler, ved hjælp af ikke-ætset årets kapillar. Sætte autosampler til tilpasning position ved hjælp af manuel kontrol. Tråd ikke ætset årets kapillar i et hul, der bruges til at holde adskillelse kapillær indtil det ikke kan være fysisk gevind yderligere.
        Bemærk: I dette tilfælde i slutningen af kapillar er næsten for på samme højde som udgangen af elektroden, og mindst 50 µL af prøven kræves i stikprøven hætteglas for at sikre afslutningen af kapillær er nedsænket i prøven under injektion. Hvis prøven volumen er lav (dvs., 5 µL), højden af injektion slutningen af kapillar skal justeres som beskrevet i trin 4.1.3.2.1.
        1. Justere højden på injektion slutningen af kapillar, hvis prøven er lavere end 50 µL (dvs., 5 µL). Skifte autosampler til Standby ved hjælp af manuel kontrol. Indtast prøve position i systemet og flytte kapillar til prøven. Skubbe injektion slutningen af kapillar yderligere ned for at nå bunden af prøven hætteglas.
          Bemærk: I dette tilfælde, prøve injektion kan udføres med en prøve af kun 5 µL i hætteglasset.
      3. Fortsætter med at bruge den manuelle kontrol, skylle kapillær med BGE i 20 min., ved hjælp af et tryk på 20 psi.
  2. Opsætning af grænsefladen CZE-MS
    1. Trække en kapillær borsilikatglas (1 mm i OD, 0,75 mm i.d., 10 cm lang) i to electrospray udledere med en blænde på 20-40 µm i OD
      Bemærk: Holde electrospray emitter som 4-5 cm længde og skære det med en cleaving sten hvis nødvendigt. Bortskaf alle glas affald i en skarpe container. Indstillingerne for at få 20 - 40 µm tips er som følger. Sæt varmen til 498, pull-5, hastighed 10, forsinkelsen til 150, og presset for at 200. Kontrollere størrelsen af udledere med et mikroskop før brug. Justere parametrene lidt, hvis det er nødvendigt.
    2. Montere en kommerciel electro-kinetically pumpede kappe flow interface (Se Tabel af materialer) på forsiden af den massespektrometer. Fyld kappe buffer reservoir med en buffer, som indeholder 10% (v/v) metanol og 0,2% (v/v) FA i LC-MS grade vand.
    3. Skyl T i grænsefladen med den kappe buffer via pressionsmiddel manuelt med en sprøjte. Tråd 1-mm-OD slutningen af en electrospray emitter gennem et ærme slanger og forbinde udleder med en port af Tvia en montering. Blot skylle T manuelt igen med en sprøjte til at fylde udleder med kappe buffer.
    4. Justere afstanden mellem blænde af emittent og indgangen til massespektrometer til ~ 2 mm ved hjælp af kameraet, der fulgte med grænsefladen. Anvende en 2 - 2.2 kV spændingen på kappe buffer hætteglas til electrospray. Justere spray spændingen til at nå frem til en stabil electrospray.
      Bemærk: Hvis ingen electrospray eller en ustabil electrospray er observeret, kontrollere interface til at sørge for der er ingen store bobler i udleder, Tog slangen, der bruges til at forbinde kappe buffer hætteglas og T. Afstanden mellem blænde af emittent og massespektrometer indgangen kan anslås groft ved at sammenligne det med 1-mm OD af emittent. Spray spændingen afhænger af størrelsen af emittent. For 20 - 40 µm udledere er 2-2.2 kV god nok. Husk altid at være omhyggelig, når du bruger høje spændinger.
    5. Slukke spray spænding og forsigtigt tråd ætset slutningen af adskillelse kapillær gennem T i udleder indtil det ikke kan blive skubbet videre. Anvende et lavt tryk (dvs., 5 psi) injektion-ultimo kapillar under denne proces til at sørge for der er ingen bobler i kapillar.
      Bemærk: Kapillar er forbundet til T via et ærme slanger og en montering. Justere ætset slutningen af kapillar stilling i udleder ved hjælp af kameraet for at inden for 500 µm. Afstanden kan anslås groft ved at sammenligne det med 1-mm OD af emittent.
    6. Stop lavtryk enden injektion af kapillar. Skyl udleder en lille smule med kappe buffer. Igen, anvende 2-2.2 kV af spray spænding for at teste sprayen.
  3. Opsætning af CZE metode til prøven injektion, adskillelse, kapillær rødme og udløsning af massespektrometer til dataopsamling
    1. Vælg ny metode under fil henlægge-nede menu på skærmen hovedinstrumentet til at indlede en ny metode.
    2. Vælg indløb som SV/EV, bakke som prøve, pres som 5 psi, KV som 0, og varighed som 95 s til en prøve injektion.
      Bemærk: Prøven sprøjtes ind i kapillære via pressionsmiddel. Prøven injektionsvolumen kan beregnes baseret på pres og injektion tid ved hjælp af Poiseuilles lov. For eksempel, 5 psi til en 95-s prøve injektion svarer til omkring 500 nL af prøve-loading volumen for en 1 m lange adskillelse kapillær (50 µm i.d.).
    3. Vælg parametre for CZE adskillelse og konfigurere parametre for at udløse dataopsamling.
      1. Indstille indløb som InV, bakke som Buffer, pres som 0 psi, KV som 30 og varighed som 4.200 s til adskillelse af standard protein blanding prøve. Indstille indløb som InV, bakke som Buffer, pres som 0 psi, KV som 20 og varighed som 6.600 s til adskillelse af E. coli proteomet prøve.
        Bemærk: Spænding til adskillelse kan justeres baseret på prøve kompleksitet. For simple protein prøver, 30 kV kan anvendes til at fremskynde analysen. For komplekse prøver, 20 kV er anvendt for at bremse adskillelsen og erhverve flere MS/MS-spektre for proteoform id'er.
      2. Konfigurer parametre for at udløse dataopsamling under Timet arrangementer. Angivet tid (s) som 0,0 og Type som relæ 1 for Aktiver i trin 1; Sæt tid (s) som 1,0 og Type som relæ 1 for deaktivere i trin 2.
    4. Vælg indløb som InV, bakke som Buffer, pres som 10 psi, KV som 30 og varighed som 600 s for kapillær rødme.
    5. Gem filerne metode for CZE-MS og MS/MS eksperimenter.
  4. Opsætning af MS og MS/MS
    1. Konfigurere parametrene MS og MS/MS for intakt proteinanalyse ved hjælp af en Quadrupol-ion trap massespektrometer (Se Tabel af materialer).
      Bemærk: Den positive ion mode og højere energi collisional dissociation (HCD) for fragmentering er ansat.
      1. Justere indstillingerne tune fil: slå intakt protein tilstand og bruge en diffusering pres på 0,2. Sat ion overførsel kapillær temperatur til 320 ° C og s-objektiv RF level 55.
      2. Opbygge filen MS og MS/MS metode.
        1. For fuld MS, skal du angive antallet af microscans til 3, dagsorden hen til 240.000 (på m/z 200), automatisk gain control (AGC) målværdi til at 1E6, maksimal indsprøjtning tid til 50 ms og scanningsområde til 600-2000 m/z.
      3. For MS/MS, skal du bruge data-afhængige erhvervelse (DDA) for de otte mest intense ioner i en fuld MS-spektrum. Indstil vinduet isolation til 4 m/z og den normaliserede collisional energi (IOU) til 20%. Angiv antallet af microscans til 1, opløsning til 120.000 (på m/z 200), AGC målværdi til 1E5 og den maksimale injektion tid til 200 ms.
      4. Skal intensiteten tærsklen for udløsning af fragmentering til 1E5 og angive ioner med en afgift tilstand højere end 5 at være isoleret for opsplitning. Tænd den udelukke isotoper og Indstil dynamiske udelukkelse til 30 s.
        Bemærk: Antallet af microscans for MS/MS kan øges til 3. I dette tilfælde kan en Top3 DDA metode anvendes for at reducere cyklustid.
    2. Oprette en kabelforbindelse mellem CE autosampler og massespektrometer til automatisk udløsning af dataopsamling. Tilslut den ene ende af en ledning til relæ 1 kontakt A og relæ 1 kontakt B på bagsiden af CE autosampler. Tilslut anden enden af kablet til Start i - og starter i + på siden af den massespektrometer.
  5. CZE-MS/MS eksperiment og analyse af prøver
    1. Anvende 30 kV ved hjælp af kontrolelementet CE manuel til prøven injektion og 2-2.2 kV på kappe buffer hætteglasset ved hjælp af den eksterne strømforsyning til at teste adskillelse kapillær og electrospray.
      Bemærk: Adskillelse aktuelle, i dette tilfælde, er omkring 8-9 µA hvis 5% (v/v) eddikesyre bruges som BGE.
    2. Konfigurer en data erhvervelse sekvens på massespektrometer computer ved at vælge en ny sekvens.
      1. Vælg Ukendt som prøvetypen og angive et filnavn og sti. Angiv metoden MS skal bruges til hver prøve køre under Instrument metode.
        Bemærk: Da der er en separat computer til at kontrollere CE autosampler, prøve holdning behøver ikke at være angivet her.
    3. Oprette en CZE adskillelse sekvens på CE computer at angive positionen buffer, prøve position og metoden CZE. For at starte en ny sekvens, skal du vælge sekvens under rullemenuen analyse på siden vigtigste instrument.
    4. Starte data erhvervelse metode på massespektrometer computer først ved at vælge Kør sekvens (eller køre prøve for enkelt løber). Derefter starte CE sekvens på CE autosampler computer.
      Bemærk: Når den adskillelse spænding er på efter prøven injektion, sendes et signal fra CE autosampler til massespektrometer til udløsning af dataopsamling. Den nuværende adskillelse vil falde i begyndelsen under separation på grund af dynamiske pH junction prøve stabling. Derefter, nuværende genopretter gradvist.

5. databasesøgning af indsamlede Raw-filer med TopPIC Software

  1. Overføre .raw filer, herunder MS og MS/MS data fra massespektrometer computer til en computer dedikeret til database søgning.
    Bemærk: Disse .raw filer kan være stor og kræver en kraftfuld computer for at nå en hurtig databasesøgning.
  2. Download ProteoWizard og TopPIC suite på computeren dedikeret til database søgning.
    Bemærk: ProteoWizard og TopPIC suite er open source-software og kan findes online (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; TopPIC suite: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt databaser anvendes til databasen søgninger og kan findes på webstedet UniProt.
  3. Konvertere filerne .raw til .mzML filer med msconvert, en MS fil format konverteringsværktøj i ProteoWizard28. I GUI af msconvert (MSConvertGUI.exe), klik på knappen Gennemse og vælge filen .raw skal konverteres. Vælg mzML som outputformat og holde alle andre indstillinger til deres standardværdier. Klik på knappen Start nederst til højre på GUI.
  4. Konvertere .mzML filer til .msalign med værktøjet TopFD i TopPIC suite29.
    1. I GUI af TopFD (topfd_gui.exe), klik på filen og vælg filen .mzML oprettet i forrige trin. Beholde standardværdierne for parametrene, og derefter klikke på knappen Start nederst til højre på GUI.
      Bemærk: TopFD konverterer forløber og fragment isotopiske klynger til monoisotopic masserne og identificerer mulige proteoform funktioner i MS1 data ved at kombinere forløber isotopiske klynger med lignende monoisotopic masserne og tæt migration gange. Tre filer vil blive genereret fra TopFD, herunder en ms1.msalign fil, en ms2.msalign-fil og en .feature fil. Filerne ms1.msalign og ms2.msalign indeholder deconvoluted monoisotopic masserne af MS1 og MS/MS-spektre, henholdsvis. Filen .feature indeholder mulige proteoform funktioner.
  5. Udføre en databasesøgning med TopPIC (version 1.1.3) i TopPIC suite30.
    1. Klik på databasefil i TopPIC GUI (toppic_gui.exe), og vælg en passende database til søgning.
    2. Klik på spektrum fil og vælg filen ms2.msalign genereret i trin 5.4.1 som input. Vælg MS1 funktion fil og vælge filen .feature genereret i trin 5.4.1.
    3. Indstille cystein carbamidomethylation (C57) som en fast ændring på grund af IAA behandling.
      Bemærk: En tekst-fil kan også laves med forskellige faste ændringer af en teksteditor. Derefter kan tekstfilen vælges ved hjælp af knappen fil ved siden af faste ændringer i TopPIC GUI.
    4. Vælg funktionen lokkedue database , og under cutoff indstillinger, Vælg FDR (falsk opdagelse sats) i rullemenuen ved siden af spektrum niveau. Angiv FDR til 0,01 spektrum og 0,05 på proteoform niveau.
      Bemærk: TopPIC giver flere muligheder for filtrering af resultater: spektrum-niveau FDR og/eller proteoform-niveau FDR. FDR er evalueret baseret på mål-lokkedue tilgang31.
    5. Forlade generering funktion unselected og angive fejl tolerance (ppm) til 15.
    6. Under Avancerede parametre, tryk på 2 for det maksimale antal masse forskydninger i drop-down menuen. Angiv den maksimale masse Skift (Da) af ukendt ændringer til 500 Da. forlade alle andre parametre til deres standardværdier og klikke på knappen Start på nederst til højre i GUI.
      Bemærk: TopPIC software genererer to resulterende tekstfiler. Filen med endelsen. OUTPUT_TABLE indeholder en liste over identificerede proteoform-spektrum kampe (PrSMs), og ene med et suffiks. FORM_OUTPUT_TABLE indeholder en liste over identificerede proteoforms. For hver PrSM, softwaren indeholder generelle oplysninger om kampen, observerede fragmentering mønster, matchede fragmentioner og opdaget masse skifter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser et diagram over den dynamiske pH-junction-baserede CZE-ESI-MS system, der anvendes i forsøget. En lang stik af prøven i en grundlæggende buffer er injiceres en LPA-belagt adskillelse kapillær fyldt med en syrlig BGE. Efter anvender høje spændinger vil I og II, analysander i zonen prøve være koncentreret via metoden dynamisk pH junction. For at evaluere effektiviteten af CZE-MS system, er en standard protein blanding (cytokrom c, Lysozym, β-kaseiner, myoglobin, CA og BSA) typisk analyseret. De repræsentative elektroferogrammet for standard protein blandingen er vist i figur 2A. Standard protein blandingen drives typisk mindst i to eksemplarer til at vurdere adskillelse effektivitet og reproducerbarhed af systemet. Adskillelse effektivitet kan vurderes med antallet af teoretiske plader af nogle proteiner, som vist i figur 2B. Reproducerbarhed kan vurderes af de relative standardafvigelser af protein intensitet og migration tid. Figur 3 A viser en zoomet i visningen af en elektroferogrammet af E. coli protein prøven analyseret af den dynamiske pH-junction-baserede CZE-MS/MS. Normaliseret niveau (NL) protein intensiteten bør være på omfanget af 108 hvis 1 µg af E. coli proteiner er indlæst for analyse med en Quadrupol ion trap massespektrometer. Zoomet i udsigt over elektroferogrammet kan bruges til at vurdere vinduet adskillelse af systemet. I dette tilfælde er vinduet adskillelse 80-90 min. figur 3B viser et eksempel PrSM, herunder generelle tilsvarende proteoform oplysninger, protein sekvens, observerede fragmentering mønster og ændringer. Den meget lave E-værdi (2.11E-48) og spektral FDR (0) tyder på høj tillid til proteoform-ID. Det høje antal matchede fragmentioner (60) yderligere angiver høj tillid af ID. Observerede fragmentering mønster viser, at fragmenteringen af proteoform højeffektive dækker termini og midterste del af proteoform. Den N-terminale kløvningen af tre aminosyrer (MTM) bestemmes gennem til databasesøgning.

Figure 1
Figur 1 : Diagram af den dynamiske pH-junction-baserede CZE-ESI-MS system. Prøven opløses i 50 mM ammoniumbicarbonat, pH 8. BGE er 5% eller 10% (v/v) eddikesyre, pH ~2.4 eller ~ 2.2. En 1-m LPA-belagt kapillær bruges til adskillelse. En electro-kinetically pumpede kappe flow grænseflade bruges til at koble CZE til MS. En Quadrupol ion trap massespektrometer bruges. Den høje spænding jeg (HV jeg) er fastsat af strømforsyningen integreret i CE autosampler for adskillelse. Højspænding II (HV II) er fastsat ved en separat strømforsyning electrospray. Den massespektrometer er jordet. Afstanden mellem blænde af emittent og indgangen til den massespektrometer er ~ 2 mm. Afstanden mellem slutningen af det ætsede kapillarrør i udleder og blænde af emittent er mindre end 500 µm. Størrelse af blænde af electrospray emitter er 20-40 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Data af en standard protein blanding analyseret af dynamiske pH-junction-baserede CZE-MS. (A) dette panel viser en basistoppen elektroferogrammet. (B) dette panel viser antallet af teoretiske plader (N) af tre proteiner. Injektionsvolumen prøve blev 500 nL. HV jeg var 30 kV for adskillelse, og HV II var 2.2 kV for electrospray. BGE var 5% (v/v) eddikesyre, pH 2.4. Prøven var i 50 mM ammoniumbicarbonat (pH 8) og indeholder cytokrom c (0,01 mg/mL), lysozym (0,01 mg/mL), β-kaseiner (0,04 mg/mL), myoglobin (0,01 mg/mL), kulsyreanhydrase (CA, 0,05 mg/mL) og bovint serumalbumin (BSA, 0,1 mg/mL). Ingen MS/MS-spektre blev erhvervet for standard protein blanding prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Data af E.coli proteomeanalyzed af den dynamiske pH-junction-baserede CZE-MS/MS. (A) denne panel viser en zoomet i visning af baseret peak elektroferogrammet af E. coli protein prøve. (B) dette panel viser et eksempel PrSM identificeret gennem TopPIC databasesøgning af de erhvervede MS/MS-spektre. De generelle oplysninger, tilsvarende proteoform, protein sekvens, observeret fragmentering mønster, og ændringer er præsenteret. De matchede fragmentioner fra enkelte PrSM kan også ses, hvis det er nødvendigt. HV jeg var 20 kV for adskillelse, og HV II var 2.2 kV for electrospray. BGE var 10% (v/v) eddikesyre, pH ~ 2.2. Prøven var i 50 mM ammoniumbicarbonat (pH 8) og proteinkoncentration 2 mg/mL. Injektionsvolumen prøve blev 500 nL. En top8 DDA metode blev brugt til at erhverve data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her giver vi en detaljeret protokol for at bruge CZE-MS/MS for høj opløsning karakterisering af proteoforms i enkle protein prøver og for omfattende kortlægning af proteoforms i komplekst proteom prøver. Et diagram over CZE-ESI-MS/MS systemet er vist i figur 1. Der er fire afgørende trin i protokollen. Første er forberedelse af høj kvalitet LPA belægning på indersiden af adskillelse kapillær ekstremt vigtigt. En kapillær LPA-belagt separation kan reducere EOF i kapillar, udvide vinduet adskillelse af CZE og reducere protein adsorption på sin indre væg19. Polymerisation reaktion for at gøre LPA belægningen er udført via påfyldning kapillær med en blanding af acrylamid (monomer) og ammonium persulfat (polymerisering initiativtager), efterfulgt af varme kapillær i et vandbad til at udløse den reaktion22. Timingen i vandbadet er kritisk. For kort en reaktionstid vil føre til en ufuldstændig reaktion og dårlig belægning. Vi tillader typisk reaktion på Group til 50 minutter, så reaktionen fortsætte i en længere periode for en bedre belægning. Med længere reaktion kapillar kan blive blokeret og en HPLC pumpe skal muligvis bruges til at skubbe ud polymer inde i kapillær med vand. En LPA-belagt kapillær kan løbende bruges til omkring en uge, baseret på litteraturen data og vores erfaring22.

Det andet vigtige skridt er kobling CZE til MS med electro-kinetically pumpede kappe flow CE-MS interface25,26. Afstanden mellem slutningen af adskillelse kapillær i ESI emittent og emitter blænde påvirker følsomheden af CZE-MS betydeligt, og en kortere afstand producerer en højere følsomhed25. Slutningen af adskillelse kapillær skal være ætset med HF, at reducere dens ydre diameter fra 360 µm til mindre end 100 µm, så slutningen af kapillar skubbes tæt på emitter blænde. Afstanden mellem emitter blænde og massespektrometer indgangen er blevet optimeret for at opnå den bedste følsomhed og god stabilitet26. Vi holder typisk afstand omkring 2 mm.

Det tredje kritiske trin er CZE-MS og MS/MS analyse med dynamisk pH-junction-baseret online prøve stabling19. PH-værdien af prøvebuffer og BGE skal være væsentligt anderledes for at sikre effektiv prøve stabling. Proteinkoncentration i stikprøven skal være passende. Hvis protein er for høj, kan proteinerne udfældes i kapillar under prøven stabling. Protein koncentrationer af de prøver, der indgår i figur 2 og 3 kan betragtes som typiske eksempler. Den sidste kritiske trin er til databasesøgning med TopPIC for proteoform id'er30. Flere trin er nødvendige for fil konverteringer før til databasesøgning med TopPIC kan udføres. En ordentlig FDR filter er nødvendige for at sikre kvaliteten af de identificerede proteoforms. Vi bruger typisk en 1% spektrum-niveau FDR at filtrere søgeresultaterne database. Vi bemærke, at top-down proteomics initiativ er en meget god kilde til top-down proteomics metoder og data analyse software32,33.

Vi må konstatere, at nogle dele af protokollen skal muligvis ændres lidt og nogle fejlfinding kan være påkrævet. Tidspunktet for polymerisering i vandbad til forberedelse af LPA belægning kan variere på forskellige laboratorier. Tid for HF ætsning af adskillelse kapillær kan skal ændres lidt på grund af en forskellig temperatur i forskellige laboratorier. Når du opretter CE-MS grænsefladen, Sørg for electrospray er stabil før threading adskillelse kapillær i electrospray emitter. Hvis ingen electrospray eller en ustabil electrospray er observeret, skal du kontrollere interface til at sørge for der er ingen store bobler i udleder, Teller slangen, der bruges til at forbinde kappe buffer hætteglas og T. Derudover afstanden mellem blænde af emittent og massespektrometer indgangen kan påvirke electrospray stabilitet og er normalt ca. 2 mm. Electrospray spænding kan også påvirke spray stabilitet. For 20 - 40 µm udledere er 2-2.2 kV normalt god nok. Som beskrevet i det foregående afsnit, skal proteinkoncentration i stikprøven være passende. Hvis protein er for høj, kan proteinerne udfældes i kapillar under prøven stabling. Være opmærksom på den aktuelle profil på CE autosampler computer. Hvis aktuelt nul i begyndelsen af CZE run, betyder det, at et stik af luft injiceres i kapillar under prøven indsprøjtning skridt. Sørg for at volumen af prøven i hætteglasset er stor nok. Hvis aktuelt er normalt i starten og pludselig bliver nul under flugt, betyder det normalt, at proteinkoncentration er for høj.

CZE-MS/MS baseret på denne protokol giver høj opløsning karakteriseringen af simple protein prøver og den store top down proteomanalyse af komplekse proteomes. Som et eksempel nærmede CZE-MS høj opløsning karakterisering af en standard protein blanding indeholdende seks proteiner19. Som vist i figur 2, CZE-MS klart adskilt seks proteiner med en høj adskillelse effektivitet, afsløret tre former af β-kaseiner og opdaget mange urenheder. Som et andet eksempel givet single-shot CZE-MS/MS reproducerbar over 500 proteoform-id'er og 190 protein-id'er fra E. coli proteomet, bruger kun 1 µg af E. coli proteiner med en 1% spektrum-niveau FDR19. CZE-MS/MS forbedret antallet af proteoform-id'er fra et komplekst proteom af mindst tre gange, sammenlignet med tidligere single-shot CZE-MS/MS undersøgelser. Som vist i figur 3A, nåede CZE-MS/MS samtidig en 500-nL prøve-loading volumen og en 90-min adskillelse vindue til analyse af E. coli proteomet19. TopPIC software kan give omfattende oplysninger om de identificerede proteoforms (fig. 3B). CZE-MS/MS system giver proteomics Fællesskabet med et nyttigt redskab for storstilet og høj opløsning top-down proteomics.

CZE-MS/MS har stadig nogle begrænsninger for dybt top-down proteomics. Selv om vi viste, at CZE-MS/MS kan nå over 500proteoform-id'er fra E. coli proteomet i et enkelt løb, er antallet af proteoform-id'er fra single-shot CZE-MS/MS kun omtrent 50% af det fra state-of-the-art RPLC-MS/MS34, 35. I denne protokol bruges kun HCD til protein fragmenteringen, fører til begrænset fragmentering dækningsområder af identificerede proteoforms. Flere forbedringer kan foretages CZE-MS/MS-protokollen til at forbedre både antallet og kvaliteten af proteoform id'er fra single-shot CZE-MS/MS. Første, øge længden af adskillelse kapillær bør give et bredere adskillelse vindue, fører til mere proteoform id'er. For det andet ved hjælp af et massespektrometer med en meget højere opløsningsevne, hurtigere Skan sats, og flere fragmentering metoder (f.eks.HCD,36 elektron overførsel dissociation [ETD],37 og ultraviolet photodissociation [UVPD]38 ) vil uden tvivl forbedre både antallet af proteoform id'er og fragmentering dækningsområder af identificerede proteoforms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Heedeok Hong-gruppen på Institut for kemi, Michigan State University, venligst give Escherichia coli celler for forsøgene. Forfatterne takke støtte fra National Institute of General Medical Sciences, National Institutes of Health (NIH) gennem Grant R01GM118470 (til X. Liu) og Grant R01GM125991 (til L. solen og X. Liu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fused silica capillary Polymicro Technologies 1068150017 50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets Macron Fine Chemicals 7708-10 Corrosive
LC-MS grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA48-1 Corrosive
Methanol Fisher Scientific A456-4 Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich M6514 Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid Acros Organics 423805000 Highy toxic
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic, health hazard
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678 Health hazard, Oxidizer
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Cytochrome C Sigma-Aldrich C7752
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
ß-casein Sgma-Aldrich C6905
Carbonic anhydrase Sigma-Aldrich C3934
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Urea Alfa Aesar 36428-36
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632 Health Hazard
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122270250 Health Hazard
Formic Acid Fisher Scientific A117-50 Corrosive, Health Hazard
C4 trap column Sepax Technologies 110043-4001C 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile Fisher Scientific A998SK-4 Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters Thermo Scientific 126-0020 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8537
BCA assay Thermo Scientific 23250
Acetone Fisher Scientific A11-1
HPLC system for protein desalting Agilient 1260 Infinity II
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
CE autosampler CMP Scientific ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis Branson 101063196 Model S-250A
Vaccum concentrator Thermo Fisher Scientific SPD131DDA-115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. TopPIC Suite. , Available from: http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/ (2017).
  30. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  31. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  32. Methods - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/ (2018).
  33. Software - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/software/ (2018).
  34. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  35. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  36. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  37. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  38. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Tags

Kemi spørgsmål 140 Top-down proteomics kapillær zone elektroforese electrospray Ionisation tandem massespektrometri proteoform Escherichia coli
Storstilet Top-down Proteomics brug af kapillar Zone elektroforese Tandem massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen,… More

McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e58644, doi:10.3791/58644 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter