Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה להקמת עכברים הומניזציה עם מערכת החיסון האנושית ותאי הכבד. השני עכברים לקויה מחדש השיגה באמצעות הזרקה התוך הטחול של האדם hepatocytes ו CD34+ תאי גזע המטרופאיות רגישים לנגיף הכשל החיסוני האנושי-1 זיהום ונזק הכבד לכידה כפי שנצפתה ב . חולים נגועים באיידס
Abstract
למרות תוחלת החיים המוגבר של חולים נגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי-1 (HIV-1), מחלת הכבד התפתחה כגורם נפוץ של התחלואה שלהם. הכבד immunopathology הנגרמת על ידי HIV-1 נשאר חמקמק. מודלים בעלי חיים קטנים של השתלה עם המעי האנושי ומערכת החיסון האנושית יכולים ללכוד את הביולוגיה האנושית של הפתוגנזה של המחלה. בזאת, פרוטוקול מתואר כדי להקים מודל הומניסטי כפול העכבר באמצעות האדם hepatocytes ו CD34+ המטפאות גזע/מחולל קדמון תאים (HSPCs) השתלת, כדי ללמוד הכבד immunopathology כפי שנצפתה בחולים נגועים באיידס. כדי להשיג החוקה הכפולה, זכר TK-חעוגה (נוד. Cg-prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK) 7-2/ShiJic) עכברים הם intraperitoneally וזרק עם ganciclovir (gcv) מינונים כדי לחסל את תאי הכבד טרנסגניים העכבר, עם treosulfan עבור מיזוג nonmyeloablative, שניהם להקל על מערכת החיסון האנושית של המערכת החיסונית (שלו). רמות אלבומין האנושי (ALB) מוערכות עבור מינון הכבד, והנוכחות של תאי החיסון האנושיים בדם שאותרו על ידי הזרימה cy, try מאשרת את הקמתה של המערכת החיסונית האנושית. המודל פיתח באמצעות פרוטוקול המתואר כאן דומה רכיבים מרובים של נזק לכבד מזיהום HIV-1. הקמתה יכולה להוכיח להיות חיוני למחקרים של דלקת וירוס הפטיטיס ושיתוף הערכה של תרופות אנטי ויראליות ואנטי.
Introduction
מאז הופעתו של טיפול תרופתי, יש כבר ירידה משמעותית במקרי מוות הקשורים HIV-1 monoinfection. עם זאת, מחלת כבד התפתחה כגורם נפוץ של תחלואה בחולים נגועים ב-HIV1,2. זיהומים הפטיטיס של וירוסי צהבת עם hiv-1 זיהום נפוצים יותר, חשבונאות עבור 10%-30% של אנשים נגועים באיידס בארצות הברית3,4,5.
המארח-ספציפיות של HIV-1 ווירוסים צהבת מגביל את השירות של מודלים בעלי חיים קטנים כדי ללמוד מחלות זיהומיות אדם ספציפי או לחקור היבטים מרובים של הפתוגנזה הקשורים בכבד HIV-1. עכברים לקויה המאפשרים את החרט של תאים אנושיים ו/או רקמות (כינה מודלים של עכברים הומניזציה) הם מודלים בעלי חיים מקובלים עבור מחקרים קדם-קליניים6,7,8. מאז המבוא של עכברים הומניזציה בתחילת שנות האלפיים, מחקרים פרה-קליניים מרובים של רעילות הכבד האנושי, פתוגנים אנושיים, כולל HIV-1 ו-HIV הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות, וירוס אפשטיין בר, צהבת, ועוד מחלות זיהומיות, נחקרו אלה עכברים6,9,10,11. מודלים של עכבר מרובים עבור CD34+ hspcs ו/או השתלת hepatocyte האדם כבר זמן רב פותחו ושופרו לאורך זמן כדי ללמוד את הפתוגנזה המחלה של הפטיטיס B וירוס (hbv)-הקשורים מחלת הכבד12, מיכל בן 13 , 14. מספר דגמים עבור hspc ו hepatocyte האדם (הפטיטיס) השתלת מבוססים על זנים, המכונה חעוגה (נוד. Cg-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, nsg (הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, balb/C-Rag2- γc-/- (Rag2tm 1.1 flv Il2rgtm 1.1 flv/j)12, ו-פה-/- הנהון rag1-/- il2rγnull העכבר16. עם זאת, לכל דגם יש יתרונות ומגבלות משלו; לדוגמה, AFC8 עכברים כפולים הומניזציה עבור HEPs ותאי גזע האדם (HSCs) ב Balb/C-Rag2- γc-/- רקע מאפשר את החרט המוצלח של תאים חיסוניים ו HSCs, אבל יש העדר של אנטיגן ספציפי T-ו-B-cell תגובה במודל12זה. החששות העיקריים במרכיבי עכברים הומניזציה כפולה כוללים בתאום מחדש, חוסר מודלים מתאימים לתמוך ברקמות שונות, תנאים לא תואמים, דחייה החיסונית, או השתל-מול-מארחים מחלה (gvhd), וטכני קשיים, כגון מניפולציות מסוכן עם ילודים ושיעורי תמותה גבוהים בשל חריגות מטבולית13.
למרות עכברים הומניזציה שימשו למחקר HIV במשך שנים רבות17,18,19, השימוש של עכברים הומניזציה ללמוד נזק לכבד שנגרם על ידי HIV-1 כבר מוגבל20. בעבר דיווחו על הקמתה של הומניזציה כפולה TK-חעוגה מודל העכבר ויישומו במחלת הכבד הקשורים ל-HIV8. מודל זה מראה את החרט החסון של הכבד ואת התאים החיסוניים ולכידה הפתוגנזה זיהום HIV. דיון זה מציג פרוטוקול מפורט, כולל הצעדים הקריטיים ביותר בהשתלה של הפטוציטים אנושיים. תיאור של HSPCs נדרש העפיל מוצלחת של HEPs והקמת מערכת חיסונית תפקודית ב-TK-חעוגה עכברים מוצגים גם. השימוש בעכברים אלה כדי ללמוד immunopathogenesis הכבד הקשורים לאיידס מפורט. TK-חעוגה עכברים זכרים נושאים את הכבד הספציפי הרפס וירוס סוג 1 תימידין קינאז (HSV-TK) טרנסגנטית משמשים. כדוריות הכבד של העכבר ביטוי זה יכול בקלות להיות בלתי מבוקר לאחר חשיפה קצרה למינון רעיל של GCV. תאים המושתלים בכבד האדם נשמרים באופן בלתי נשכח בתוך הכבד של העכבר ללא תרופות אקסוגני21. העכברים הם גם ממוזג עם מינונים nonmyeloablative של treosulfan ליצור נישה במח העצם העכבר עבור תאים אנושיים8. חעוגה לקויה-הזרקת טי-טי-טי. העכברים מנוטרים לאחר מכן באופן סדיר עבור מחדש דם והכבד החוקה על ידי immunophenotyping קלדה ומדידות של סרום ברמות אנושיות-אלבומין, בהתאמה. עכברים עם חוקה מוצלחת של יותר מ 15% עבור תאי החיסון האנושיים ו-HEPs הם intraperitoneally וזרק עם HIV-1. ההשפעה של HIV על הכבד ניתן להעריך מוקדם ככל 4-5 שבועות לאחר ההדבקה. חשוב לציין כי בגלל HIV-1 נעשה שימוש, כל אמצעי הזהירות הדרושים יש לנקוט בעת טיפול בווירוס והזרקת אותו לתוך עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.
הערה: קבל אישור IACUC המקומי לפני ביצוע ניסויים על בעלי חיים.
1. עיבוד דם חבל הטבור ובידוד האדם העברי
- בצע את כל השלבים של הפרוטוקול תחת תנאים סטריליים בארונות זרימה למינארי.
- קח דם חבל הטבור (CB) שנאסף בצינורות heparinized ולעשות את הנפח עד 35 mL על ידי הוספת מלוחים באגירה פוספט (PBS). שכבה את המדגם על גבי בינונית הפרדת לימפוציטים (LSM) כפי שמודגם באיור 1 ו צנטריפוגה את LSM עם CB שכבתית ב 400 x g עבור 35 דקות ב 4 ° c ללא בלמים.
הערה: מדלל את הדם בזהירות ובעדינות כדי להימנע מערבוב בממשק. - הסר את LSM העליון ואת שכבת הפלזמה בזהירות להעביר את הממשק הלבן מעיל באפי לצינור חדש באמצעות העברה פיפטה.
- השהה מחדש את מעיל באפי ב-30-40 מ ל של מאגר קר-קרח (PBS + 0.5% בסרום של חומצה ביורית [BSA] + 2 ממ מ של חומצת החומץ [EDTA]). באמצעות פיפטה, לשלב 20 μL של השעיית התא עם 20 μL של 0.4% טרימטר כחול ופיפטה 10 μL של התערובת לתוך הפתח החיצוני של אחד משני התאים של שקופית ספירה ולהוסיף את השקופית בונה התא האוטומטי כדי לספור את התאים.
הערה: השתמש מאגר קר קרח בכל השלבים, כפי שהוא מסייע לשמור על התאים קיימא. - צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c ומכה את הסופרנטנט בזהירות. לאחר מכן, הוסף 300 μL של מאגר קר-קרח.
- הוסף 100 μL של האדם חסימת קולטן Fc מגיב ו 100 μL של עכבר חד שבטיים אנטי אדם CD34 נוגדן מיקרו חרוזים עבור עד 1 x 108 תאים (לראות את הטבלה של חומרים). דגירה עבור 30 דקות ב 4 ° צ', להוסיף 10 מ ל של מאגר קר קרח כדי לשטוף את התאים, ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
הערה: קנה מידה זה לפי מספר הטלפון אם קיימים יותר מ-1 x 108 תאים. - הסר בזהירות את הסופרנטאנט, השהה מחדש את הגלולה ב-500 μL של המאגר, והמשך בשלב ההפרדה המגנטי כדי להעשיר את HSPCs.
- מקם עמודת LS בחירה חיובית (ראה את טבלת החומרים) בשדה המיון של תא מגנטי המופעל והעבר אותו באמצעות 3 מ ל של מאגר.
- טען את המדגם לעמודת LS שיכולה להיות מיקרוחרוזים הקשורים לCD34 האנושית + בדגימות ולאפשר לו לזרום תחת השפעת הכבידה לתוך צינור הגבייה.
- שטוף את העמודה 3x עם מאגר ולאסוף את האלט באותה שפופרת אוסף של CD34- חלק של תאים.
- לצלול את העמודה עם 5 מ ל של מאגר כדי להפוך את CD34+ תאים לתוך צינור אוסף חדש. חזור על ההליך כדי להשיג טוהר של > 90%.
- לספור את התאים CD34+ באמצעות טרימיה צבע כחול ב הומוציטוטומטר. לאחר ספירה, צנטריפוגה את CD34+ תאים ב 300 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.
- השהה מחדש את CD34+ תאים ב 25 ΜL של PBS לזריקה לשמש מיד השתלת או cryopreserve התאים בריכוז של 1-2 מיליון/mL בהקפאה בינונית (רוזוול פארק הזיכרון בינוני המכון [RPMI 1640 בינוני] + 50% העובר סרום שור (FBS) + 10% diמתיל סולפוקסיד [DMSO]) לשימוש נוסף בהשתלה.
הערה: תמיד לספור תאים קיימא לפני השימוש בהם השתלת. - כדי לבדוק את הטוהר של CD34+ elute לקחת 50 μl של ההשעיה ו-דגירה אותו עם 10 μl של מצו אנטי אדם נוגדן CD34 עבור 30 דקות ב 4 ° c. לאחר הדגירה של נוגדן, לשטוף את התאים המוכתמת עם PBS, להשעות אותם מחדש ב-100 μL של PBS, ולאחר מכן, להמשיך לבצע את cy, הזרימה. הוסף שפופרת נוספת של תאים ללא נוגדן כדי לעצב את השער של הזרימה cytometer.
- לאחר הרכישה, נתח את הנתונים על-ידי בחירת אזור הריבית בחלקה של פיזור (FSC) ופיזור בצד (העברה לפני הקרקע), ואחריו באמצעות מעבר עבור תאים בודדים בחלקות FSC-area ו-FSC-height. שער CD34-תאים חיוביים בתאים בודדים בערוץ PE ומגרש באזור המרכז לחיוב.
2. הכנת הפטציטים אנושיים להשתלה
- הסר את הקריוציטים שמורות מן החנקן הנוזלי, במהירות להטביע את הבקבוקון באמבט מים, ולהפשיר כ 90-120 s.
- הסירו את כובע המבחנה ויוצקים את ההיפציטים המופשות לתוך השפופרת החרותית ה50 mL של המדיום החומם.
- להשעות את התאים על ידי הנדנדה את הצינור 50 mL ביד כמה שניות.
הערה: . אל תעשה מערבולת בצינור - גלולה את התאים ב 100 x g עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים מפלטד ב-PBS עם 0.1% BSA ובריכה אותם עם החדש או המוסדר HSPCs (יחס 10:1) ב-PBS בנפח הסופי של 80 μL/עכבר.
3. טיפול בבעלי חיים, הקרנה, הגנוהקלדה, טיפול באמצעות השתלת האדם HSPC והפטציט
- טיפול בבעלי חיים
- כתוצאה של כשל חיסוני חמור, גזע, בית, ולטפל TK-חעוגה עכברים תחת תנאים אספטי.
- תמיד ללבוש חלוק מעבדה, כפפות, כיסויי נעליים, ומסכת פנים כדי למנוע זיהום עם מיקרואורגניזמים הפתוגניים פוטנציאלי.
- השתמש כפפות סטרילי וכלים לניתוח ולהתמודד עם בעלי החיים באופן כאוסטי לאורך הניתוח.
- בחירה בעכבר TK-חעוגה עבור הניסוי
- שמרו על מושבת הזנים TK-חעוגה באמצעות רבייה של עכברים מסוג TK-חעוגה עם גברים שאינם מסוג TK-חעוגה, ובחרו צאצאים מבוססי-מגנטית.
הערה: ביצוע הגנואיות (ראה שלב 3.3) כדי לקבוע את הנוכחות או העדר של הטרנסגנים אצל גברים ועכברים היילוד והנשיים בזמן הגמילה. - גברים לבחור ב 6-8 שבועות של גיל עבור השתלת עקב רגישות גבוהה שלהם GCV-בתיווך המחסור של HSV-TK-המבטא הפטוציטים21.
- האוזן לתייג את העכברים בזמן הגמילה או ניתוח כדי להקל על הזיהוי. שימו לב למצב המשקל והבריאות של החיות.
- שמרו על מושבת הזנים TK-חעוגה באמצעות רבייה של עכברים מסוג TK-חעוגה עם גברים שאינם מסוג TK-חעוגה, ובחרו צאצאים מבוססי-מגנטית.
- ג'נויוקליד לנוכחות של ה-HSV-TK טרנסגנטית באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת
- ביצוע הגנוזה בזמן הגמילה (בדרך כלל ב 3-4 שבועות של גיל). עבור הגנוזה, חותכים פיסת האוזן של העכבר בארון למינארי בטיחות ביולוגית כדי לשמור על עקרות לחלץ דנ א גנומית באמצעות ערכת DNA הבידוד של גנומית.
- להגביר את ה-DNA גנומית שחולצו מתוך האוזן פיסת התגובה 20 μL למסך עבור HSV-TK transgene תחת שליטה של מיזם אלבומין האנושי על ידי הוספת 1 μL של פריימר קדימה 5 '-CCATGCACGTCTGG-3 ', 1 μL של פריימר הפוכה 5 '-TAAGTTGC4-3 ', 0.5 μL של משפחה בדיקה 5 ′-משפחה-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 ', ו 10 μL של מיקס בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מכשיר22.
- הגדר את הגדרות ה-PCR בזמן אמת כדלקמן: 60 ° c עבור 30 s (השלב preread), 95 ° צ' עבור 10 דקות (להחזיק בשלב), 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 15 s ו-60 ° c עבור 1 דקות (ה-PCR שלב), ו-60 ° c עבור 30 (שלב).
הערה: מחזור של הסף (Ct) מתחת 22 נחשב חיובי עבור HSV-TK transgene.
- טיפול באמצעות ganciclovir ו treosulfan
- שימוש 27 G מחט, להזריק את ה-TK-חעוגה עכברים עם זריקות GCV הצפק (6 מ"ג/ק"ג) 2x ביום ביום 7 וביום 5 ב 100 μL של תמיסת מלח לפני הניתוח כדי לרוקן את התאים הטרנסגניים של העכברים (כפי שמוצג באסטרטגיה ניסיוני באיור 2)23 .
- בימים 3, 2, ו 1 לפני הניתוח, עכברים התנאי עם מינונים הצפק nonmyeloablative של treosulfan (1.5 g/ק ג/יום) ב 100 μL של תמיסת מלח, באמצעות המחט 27 G.
- יום אחד לפני הניתוח, לצייר 2 עד שלוש טיפות (~ 100 μL) של דם מתוך וריד הלסת התחתונה על ידי החירור זה עם 5 מ"מ ליטר, ולבודד את הסרום על ידי תפרידו (1,500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c) בשביל אלטין עמינח (ALT) שיטת להעריך את הדגל נזק כבד
- הכנה לניתוח
- השימוש קוצץ לגלח את הפרווה של העכבר מסביב לאתר החתך (משמאל לקיר הצפק) לפני הניתוח.
- כוונן את זרימת החמצן ל-1 L/min וזרימת isofלאנה ל-3%-5% בחדר אינדוקציה באמצעות מכונת הרדמה לעכבר. מניחים עכבר אחד בכל פעם בתא אינדוקציה להרדמה.
- לצרף את קצה אחד של צינור הארכה סטרילי (עם קיבולת מחזיק של 550 μL של השעיה; לראות את הטבלה של חומרים מפרטים) כדי המחט 30 גרם והקצה השני ל 1 מזרק mL.
- למלא את המזרק עם ההשעיה (80 μL/עכבר) של HEPs במאגר ו-HSPCs (ראה סעיף 2), להתאים את המזרק בחריץ של מתקן הצינורות החוזרים על עצמו, ולהתאים את המינפק כדי לחלק 10 μL בכל העיתונות.
- לאחר העכברים מורדם (בדרך כלל לאחר 3-4 דקות), להחליף את זרימת isof, כדי לחרוט את האף ולהפחית את קצב הזרימה isofלאנה 2%-3%.
- השתלת הטחול של האדם האנושי והפטציטים בעכברים
- בצע את כל צעדי הניתוח בתוך ארון זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
- מניחים כוית סטרילי נקי על פני השטח העבודה לשפשף את הצד השמאלי של הגוף של כל עכבר עם 10% povidone-יוד ואחריו 70% אלכוהול איזופרופיל, לפני ביצוע חתך.
- לעשות חתך קטן (~ 1-1.5 ס מ אורך ו 5 מ"מ עמוק) בעור, שריר, ו צפק בשמאל הקיר הצפק עם מספריים סוג של Vanna להיכנס חלל הצפק בערך 5 מ"מ מתחת לקצה התחתון של כלוב הצלעות.
- אתר את הטחול, למשוך אותו מעט עם מלקחיים לאזור ההפעלה עבור גישה קלה, ולהכניס את המחט 30 G לתוך הקוטב התחתון של הטחול.
- לפתוח את הבוכנה של הפיפטה מחילוק ולחלק 10 μL של נפח בכל פעם, עם מגבלה של 60-80 μL לכל הטחול. למשוך את המחט לאט ולחתוך את הטחול עם ליגגדירוג קליפים באמצעות אפליקציה לחיבור.
- לדחוף את הטחול בחזרה לחלל הגוף עם כותנה מכשיר מוכשירי מוטורים עם PBS סטרילי.
- סגרו את שכבת השריר של קיר הבטן בעזרת תפר נספג שנקטע בצורת תפר (לא רציפה). לבצע סגירת העור עם דפוס תפר מקוטע באמצעות תפרים שאינם נספגים.
- השימוש רפידות מים חמים מחזורי כדי להגן על עכברים מפני היפותרמיה לאחר הניתוח.
- הסרת תפרים שאינם נספגים 10-14 ימים לאחר הניתוח.
- טיפול פוסט-פעיל
- כאשר בעלי החיים המושתלים, להזריק בופריאנטין כאבים (0.1 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally, 2x ביום ברציפות 3 ימים.
- צפו בחיות לפחות 1 x ביום עד שהם חוזרים לתנאים פיזיים נורמליים.
הערה: בדוק כל משקל הגוף של בעל חיים, מאז כמה עכברים עלולים לאבד משקל הניתוח. עכברים בדרך כלל להחזיר את המשקל המקורי שלהם 1 עד 2 שבועות.
4. בתאום ואלידציה של הכבד האנושי על ידי אליסה והמערכת החיסונית של האדם על ידי זרם Cy, לנסות
הערה: הערכת מחדש את החוקה של הכבד האנושי ואת המערכת החיסונית חודשית, החל 1 חודש השתלת מערכת החיסון הקשורות לאנזימים הקשורים לאנזים (אליסה) ולזרימה cy, בהתאמה.
- איסוף דגימות דם מווריד הלסת התחתונה באמצעות אזמלי בצינורות EDTA, ו צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. לבודד סרום לבדוק רמות אלבומין האנושי כדי להעריך את היעילות של העכבר על הכבד המושתלים האדם hepatocytes, באמצעות אלבומין האדם אליסה להגדיר (לראות את הטבלה של חומרים) על ידי ביצוע היצרן של וראות.
הערה: אין להשליך את הגלולה ולהשתמש בתאי מפלטד עבור הניתוח cy, הזרמת הגוף כדי להעריך את המערכת החיסונית האנושית מחדש. - להשעות מחדש את הגלולה תא ללא סרום ב 35 μL של מאגר FACS (PBS + 2% FBS) ומוכתם עם 5 μL של העכבר ספציפי CD45 (ריכוז 0.5 mg/mL), 5 μL כל אחד של נוגדנים ספציפי לאדם CD45 (0.1 mg/mL), CD3 (0.2 mg/mL), CD8 (0.1 mg/mL), CD19 (0.5 mg/mL) , ו 20 μL של CD4 (0.25 מ"ג/mL) ו CD14 (0.25 mg/mL) כל אחד עבור 30 דקות ב 4 ° c, כדי לבדוק את הפיתוח של מערכת חיסונית תפקודית מ CD34+ hspcs.
הערה: שקול להוסיף צינור אחד נוסף של תאים לא מוכתמים כדי לקבוע את החסימה של התאים המוכתמת. - לאחר הדגירה, להעביר את ההשעיה המוכתמת (~ 100 μL) בתוך פוליסטירן עגול התחתון הזרימה cy, הצינור להשתמש 2 מ ל של 1x מאגר הליזה (לראות את הטבלה של חומרים) על ידי דילול חלק 1 של מאגר הליזה 10x עם 9 חלקים של מים מזוקקים ו הדגירה 10- 15 דקות כדי לצפות בתאי דם אדומים.
הערה: לצפות בעכירות כדי להעריך את הפירוק של תא הדם האדום. לאחר המדגם הופך להיות ברור, הליזה הושלמה. - לאחר הליזה, להוסיף 3 מ ל של מאגר FACS בצינור, צנטריפוגה ב 300 x g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות כדי לקבל גלולה. חזור על הכביסה על ידי הוספת 3 מ ל של מאגר FACS כדי הגלולה ואת הצנטריפוגה ב 300 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות.
- תקן את התאים בתוצרת טרייה 1% פאראפורמלדהיד (בתוך הרחוב) ולרכוש תאים ויטראז על cytometer מנותח עם תוכנת זרימה.
- לניתוח, בחר באפשרות לימפוציטים על גבי מגרש FSC/המרכז למעקב, ולאחר מכן הפעלת תא בודד על FSC-אזור/FSC-גובה.
- נוסף על כך, שער לCD45 ספציפי לאדם (hCD45) על האוכלוסיה בעלת תא יחיד וכולל CD45 העכבר הספציפי (mCD45) לאי הכללה של תאים ממוצא מוראי. אסטרטגיה של האוכלוסייה המוכתמת המבוססת על החסימה של תאים לא מוכתמים.
- Gate hCD45+ תאים כדי לקבוע את תדירות CD3+ T תאים ו CD19+ B תאים. תאי שער T כדי לקבוע תת-ערכות של CD4 ו-CD8. כדי להעריך את המונולוציטים, השער ב-hCD45 כדי לקבוע CD14+ מונוציטים.
5. HIV זיהום של TK-חעוגה עכברים השפעתו על הכבד האנושי מערכת החיסון
- לטפל בווירוס HIV-1 ואת כל העכברים נגועים במתקן ביולוגי ברמת בטיחות מיועד 2.
זהירות: אוטוקלב ולהיפטר כל פסולת HIV נגוע בשקיות בידוד כפול. מטעמי בטיחות, ללבוש כפפות עמיד לחתוך תוך מתן עכברים נגועים באיידס. - ללבוש ציוד הגנה אישית (PPE), כולל כיסוי חד פעמי כל שמלת, הנעל מכסה, מסכת פנים, וכפפות כפולות בכל עת תוך כדי עבודה עם הווירוס.
- עכברים לבחור עם החוקה של יותר מ 15% של האדם CD45+ תאים (נבדק בשלב 4.7) ועם נוכחות של אלבומין האנושי בסרום לזיהום HIV-1 (נבדק בשלב 4.1).
- הכנס את העכברים עם 1 x 103 אל 1 x 104 תרבות רקמה מינונים זיהומיות 50 (tcid50) HIV-1ADA בנפח של 100-200 μl לכל עכבר, intraperitoneally.
- המתת חסד העכברים נגועים 5 שבועות לאחר הפגיעה באמצעות isofלאנה (עם האדים הריכוז של ה> 5%).
- לאחר המתת החסד של העכברים, לאסוף דם צינורות EDTA על ידי ניקוב לב לבידוד של סרום, כדי לראות את ההשפעה של HIV-1 על הכבד על ידי הערכת רמות אלבומין ספציפי לאדם על ידי אליסה (ראה שלב 4.1) ותאי דם כדי לבדוק שינויים החיסון האנושי תאים באמצעות הזרמת cy, (ראה שלבים 4.2-4.8).
הערה: להעריך את העומס נגיפי היקפי 5 שבועות לאחר ההדבקה על bioanalyzer כדי לאשר אם העכברים נגועים. - לאחר שציירו דם, בלו את הכבד. מעכברי הורדמים
- עבור כריתה הכבד, לחשוף את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך של 1.5-2 ס"מ ארוך ו 0.5 ס"מ עמוק בעור, השרירים, ו צפק, מן xyphoid. לעשות חתך בניצב לעמוד השדרה בין הכבד לסרעפת. הרימו את הכבד והסירו את כל הקרומים הללו לבטן ולמעיים.
- לאסוף ולתקן את הכבד ב 4% פאראפורמלדהיד לילה ופעל פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים כדי להעריך את ההשפעה של HIV על CK18+ hepatocytes באמצעות האדם ספציפי CK18 נוגדן8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקמתה של מודל עכבר כפול הומניזציה עם הכבד האנושי ותאים חיסוניים ניתן לפקח בקלות בכל שלב עם אליסה פשוטה מאוד וזרימה cy, בהתאמה. Cy, הזרמת הזרימה מבוצעת באופן קבוע כדי להעריך את ההתפתחות של מערכת חיסונית תפקודית לראות את ההשפעה של זיהום HIV על התאים החיסוניים. ב עכברים הומניזציה כפולה, התפתחות של תאים חיסוניים פונקציונלי יכול לנוע בין 15% כדי 90% מהשער לימפוציט. קבוצות מערכות מייצגות של תאים חיסוניים מוצגות בחלקות נקודה (איור 3). להערכת החרט של האדם הפטציטים האנושי, אליסה לרמות של אלבומין ספציפי לאדם מבוצעת מדי חודש על סרום לעכבר. עכברים העפילו בשני HSPCs ו-HEPs להראות רמות האלבומין ספציפי אנושי החל ~ 7 μg/mL כדי 377 μg/mL בחודש אחד, המשך לגדול לאורך זמן התבוננות (6 חודשים) (איור 4). ההשפעה של זיהום HIV על תאי החיסון האנושי בדם של עכברים הומניזציה כפולה הוא מפוקח על ידי cy, הזרמת הזרע ועל HEPs בכבד על ידי האדם ספציפי אלבומין אליסה. על ידי 5 שבועות, HIV-1 גורם לירידה ברמות אלבומין האנושי בסרום, כפי שמוערך על ידי אליסה, ויש דלדול של האדם CK18+ hepatocytes במקטעי הכבד של עכברים כפול הומניזציה, כפי שוערך על ידי אימונוהיסטוכימיה (איור 5). יחס נמוך יותר של CD4: CD8 הוא ציין בדרך כלל, על ידי הcy, בזרימה של דם ובכבד של עכברים נגועים באיידס, לעומת רמות שצוין באותו עכבר לפני הזיהום (איור 6). כל הריאגנטים והחומרים החשובים לפרוטוקול נדונים בטבלת החומרים.
איור 1 : סכמטית של העשרת CD34+ תאים מתוך דם טבורי. (A) דם טבורי הוא בשכבות על הפרדת לימפוציטים בינונית (lsm) ו centrifuged לבודד את המעיל באפי. (ב) עמודות ממוקמות על מעמד מגנטי ושוטפים עם מאגר bsa, ואחריו הוספת מעיל באפי. תאים חיוביים עבור CD34 הם לכודים בעמודות, ו CD34- תאים הם השפופרות בצינורות נפרדים. לכוד CD34+ תאים בתוך שרפים טור הם צלל עם בוכנה, ואת התאים נאספים בצינור חדש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : תצוגה סכמטית של התכנון הניסיוני עבור החוקה הכפולה של הכבד הומניזציה ועכברים מערכת החיסון, ואחריו זיהום HIV -1. TK-חעוגה עכברים מוזרק עם ganciclovir (GCV) במינון של 6 מ"ג/ק"ג, 2x ביום, ביום -7 ו-5 יום, ואחריו הזרקת treosulfan בימים-3,-2 ו-1. כדי להקרין את העכברים עבור ההשתלה (Tx), מתבצע היצע של אלטין עמינח (ALT) יום אחד לפני הניתוח, ועכברים עם רמות ALT של > 200 ו-< 600 U/L נבחרים. לאחר השתלת, העכברים נבדקים עבור החוקה של מערכת החיסון האנושית על ידי הזרמת cy, מנסה (FACS) ולאחר התיקון הכבד על ידי הערכת שלהם רמת אלבומין באמצעות אליסה. העכברים נגועים ב-HIV-1 5 שבועות לפני שהם מוקרבים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : . לפיזור התאים האנושיים של הדם (א) הראשון, לימפוציטים הם מגודרת על כל דם על בסיס fsc-a ו-אס. פי. או. (ב) תאים בודדים מגודרת על לימפוציטים. (ג) האדם CD45+ לוקיציטים מגודרת על תאים בודדים באמצעות העכבר CD45 והCD45 האנושי. (ד) CD3+ T תאים ו CD19+ B תאים מזוהים על מגודרת CD45+ האדם לוקיציטים. (E) CD4+ T תאים עוזר ו CD8+ ציטוטוקסיים תאים t מזוהים CD3 מגודרת+ T תאים. (ו) CD14+ מונוציטים מגודרת מCD45 אנושי+ לוקיולוציטים. התוצאות מיוצגות כאן הם מתוך עכבר אחד מושתל עם hepatocytes האדם כפול, HSPCs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : ריכוז אלבומין נמדד על ידי אליסה בסרום של עכברים כפולים הומניזציה. העכברים הם מושתלים עם שני הפטוציטים אנושיים (HEPs) ו CD34+ המטפאות גזע/מחולל קדמון תאים (n = 11). סרום נאסף בזמנים שונים בשעה 1, 4, ו 6 חודשים השתלת הפוסט, ו מדלל נעשים כדי להתאים את ריכוזי מדגם לא ידוע בטווח של סטנדרטים. כל סמל מייצג ערך עכבר בודד. התוצאות מייצגות את החציון, כמו גם ערכים בודדים. * P < 0.05, על ידי כיוון אחד ANOVA. דמות זו השתנתה מדגור ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : ההשפעה על HIV-1 על רמות אלבומין בסרום ואת דלדול של CK18+ האדם hepatocytes בכבד של עכברים הומניזציה כפולה. (א) בריכוזים של אלבומין מנוטרים בעכברים לא נגוע (n = 9) מושתלים עם Heps האנושי ו hspcs במהלך 1 ו 4 חודשים. העכברים נגועים (n = 10) עם HIV ב 4-5 חודשים פוסט השתלת והקריב 5 שבועות posttransplantation. כל סמל מייצג ערך עכבר בודד. התוצאות מייצגות את החציון, כמו גם ערכים בודדים. * P < 0.05, על ידי כיוון אחד ANOVA. דמות זו השתנתה מדגור ואח '. 8. (ב) חמישה מיקרון בכבד סעיפים מ נגוע (Heps + hspcs, שמאל הלוח) ו-HIV נגוע TK-חעוגה עכברים (Heps + hspcs + hiv, בלוח הנכון) הם קבועים, פרפין מוטבע, ומוכתם עבור אנטי אדם ציטוקרטין-18 (CK18) נוגדן. HIV-1 גרימת דלדול של CK18+ hepatocytes הוא עדות על ידי שטח כבוש פחות על ידי CK18+ התאים האנושיים. התוצאות המיוצגות כאן הם מן אחד נגוע ואחד העכבר נגוע HIV מושתלים עם hepatocytes כפול האדם ו-HSPCs. סרגל ברים = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : היחס של CD4+ תאים CD8+ T תאים בתוך דם היקפי בכבד של כפול מחודשת נגוע HIV-1-עכברים נגועים. עבור עכברים כפולים לא נגוע: עיגול סגור; האני מבין דם n = 7; כבד n = 6. לגבי HIV-1 עכברים נגועים: עיגולים פתוחים; האיידס + HIV; דם n = 10; כבד n = 11. התוצאות מייצגות את החציון, כמו גם ערכים בודדים. * P < 0.05, על ידי דרך אחת בדיקה ANOVA בין HIV נגוע עכברים נגוע. דמות זו השתנתה מדגור ואח '8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכבד הוא נפרץ וניזוק בחולים נגועים באיידס24. ניסיוני מודלים בעלי חיים קטנים לחקר מחלות הכבד האנושי בנוכחות HIV-1 הוא מוגבל מאוד, למרות הזמינות של כמה מודלים בעלי חיים המושתלים עם CD34+ hspcs ו hepatocytes7,12, . עשרים וחמש בניסויים מחוץ למבחנה, הפטציטים מופיעים ברמה נמוכה מזיהום HIV-126. עכברים הומניזציה כי לשאת שני סוגים של תאים אנושיים הם מודל רצוי. הכבד של עכברים מחדש עם מערכת החיסון האנושית בלבד הוכח להיות מושפע על ידי זיהום HIV תחת הדילול ניסיוני של תאים התקינה האנושית20,27. עם זאת, ההבדל בתכונות החיסונית ופונקציונלי של העכבר האדם hepatocytes עשוי להדגיש את ההבדלים בתגובות שלהם ל-HIV -1 תאים חיסוניים. בסקירה זו, פרוטוקול מתואר להוות מחדש הן מערכת החיסון האנושי והכבד כדי לטפל HIV-1-משויך הכבד immunopathology, כפי שנצפו בחולים HIV-1 נגועים. TK-חעוגה עכברים זכרים נבחרו עקב ביטוי הכבד שלהם mRNA גבוהה הביטוי של HSV-TK הטרנסגנטית ואת הרגישות של GCV רעילות לכבד transgene העכבר21. יתר על כן, הם יכולים להישמר לתקופות ארוכות לאחר ההשתלה ללא שימוש בתרופות אקזוטיות ולא לפתח מחלות מערכתיות ספונטנית28. כדי לבסס את המערכת החיסונית האנושית ואת החוקה הכבד, אבלציה של המערכת החיסונית העכבר נזק תאי הכבד ספציפיים לעכבר נדרשים ומושגת באמצעות מינונים nonmyeloablative של treosulfan ו GCV, כפי שמוצג בעבר ב-TK-חעוגה עכברים גברים13 ,23. עכברים מוזרקים עם GCV ו treosulfan בגיל 6-8 שבועות, כביטוי של טרנסוגן ו-GCV המושרה פציעה הכבד כפי שמוערך על ידי רמות ALT הם אופטימליים, אז, לספק נישה-to-המושתלים תאים אנושיים21. עכברים המציגים רמות ALT של > 200 U/L, אך < 600 U/L, נבחרים בדרך כלל עבור השתלת. עכברים מראה רמות ALT של > 600 U/L נמצאים בסיכון גבוה יותר של מוות כמו hepatocytes האדם אינם יכולים להציל את תפקוד הכבד של העכבר הפגום.
כיום, הומניזציה כפולה מוצג על ידי השתלת האדם CD34+ hspcs ותאי הכבד העוברי; עם זאת, מניפולציה של בעלי חיים היילוד יוצר בעיות טכניות13,14. HSPCs יכול להיות נגזר או מבודד ממקורות מרובים, כגון תאי הכבד עוברי (FLCs), תאי גזע עובריים (ESCs), ו-CB. עם זאת, בעיות אתיות להגביל את השימוש ESCs ו-FLCs. CB אין הגבלה כזו היא חלופה שימושית ביותר כדי להשיג HSPCs, כמו גם להיות מקור יקר של גזע המטפאות פרימיטיבי ובתאי קדמון שיכולים להוות מחדש את החיסון הפונקציונלי מערכת. דם טבורי לא צריך להיות מבוגר יותר מיום אחד כאשר משמש לבידוד HSPCs, כמו התשואה של HSPCs מושפע מאוד על ידי הגיל. הטוהר של HSPCs מבודדים צריך להיבדק לפני הקפאת הזמן התאים. הצלב זיהום של תאים CD3+ T הוא נמנע, כפי שהוא עלול להוביל השתלת עכבר מערכתית-מחלהלעומתמארח ו allorejection וצאה חריפה של heps תוך שתילת התאים תואמים.
הפאציטים הזמינים מסחרית שימשו כמקור לחוקת הכבד8,13. הפטציטים בוגרים מעדיפים להקים מחדש את הכבד בגלל היעילות המוגברת שלהם במקביל וקיימות לתקופה ארוכה של זמן29.
הנוכחות של מערכת החיסון האנושית במודל עכבר גדל רמות ALB, כפי שמוצג בעבר30,31. עם זאת, היעילות של הפטציטים והמערכת החיסונית משתנה באופן שונה עם מקורות שונים של תאי תורם ותלויים בעכבר הנמען. כך, כל עכבר צריך להיות מוערך על התיאום, ואת החלק הקריטי ביותר הוא להשתמש נוגדנים או מגיב כי הם אנושיים ספציפיים לא להצליב להגיב עם תאי העכבר. הריאגנטים והנוגדנים הספציפיים לאדם המשמשים במחקר המוצג כאן מפורטים בטבלת החומרים. אם משתמשים בנוגדנים שאינם מסופקים בטבלת החומרים , הקפידו לבדוק את היחודיות האנושית.
המצב האופטימלי יהיה השתלת תאים תחבירית; עם זאת, מבחינה טכנית קשה להשיג. בכל מקום אפשרי, יש לחלק את הספקס והפטציטים מתורמים עם מחלקה בעלת התאמה חלקית של אנטיגנים אנושיים-1 (כמו HLA-A2).
כדי להקרין עכברים עבור לימודי HIV, דם מצויר בנקודות זמן מרובות כדי לקבוע את החיסון האופטימלי החיסונית והכבד; הזרימה cy, try ו-אליסה הם העדיפו כפי שהם יכולים להתבצע עם כמות קטנה בלבד של דם. כדוריות הדם והנסיוב מאותה דגימת יכול לשמש להזרמת cy, ובתוספת אליסה, בהתאמה. חשוב לעשות דילול הנכון של סרום בכל נקודת זמן (1,000-40,000 טווח) כדי להעריך את רמות ה-ALB, כך ריכוזים לא ידוע ניתן להביא בתוך טווח של ריכוזים סטנדרטיים (טווח הערכה: 6.25-400 ng/mL).
ציטוקינים proinflammatory בתגובה לזיהום HIV-1 בנוכחות מערכת החיסון האנושית יכול גם להיות שימושי בטיפול באינטראקציה של hepatocytes ותאים חיסוניים. המודל שימושי להצגת הimmunopathogenesis של מחלת הכבד הנגרמת על ידי HIV-1, בהתחשב בכך שהוא לכידה של נזק כבד באותו אופן כמו בבני אדם, המעידים על יחס נמוך של CD4: CD8, ירידה ברמות ALB, המוות האדם hepatocyte, ואת הכבד החיסונית הפעלה. המודל יש גם כמה מגבלות, כגון רמה נמוכה של פעילות בתאי T ציטוטוקסיים ולקויי מיתוג מחלקה חיסונית. בשל נוכחותם של המערכת החיסונית האנושית והכבד, המודל המוצג כאן הוא מבטיח studi זיהומים של HIV-1 ווירוסים צהבת, דלקת הכבד כרונית (כדי להבהיר את המנגנונים של התגובה החיסונית אנטי הפטיטיס), וכחמת ודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי למענק הבריאות R24OD018546 (כדי L.Y.P. ו S.G.). המחברים רוצים להודות Weizhe Li, Ph.D., לעזרה בהליכים כירורגי, אמנדה סניף וודס, בולשיט, יאן צ'נג עבור אימונוהיסטולוגיה, UNMC זרימה cytometry מתקן מחקר חברי המנהל פיליפ הקסלי, Ph.D., ויקטוריה ב. סמית, בולשיט, וסמנתה וול, בולשיט, UNMC מתקדמים הליבה המיקרוסקופיה חברי מתקנים ג'ניס א. טיילור, בולשיט, וג ר. טלסקה, בולשיט, על התמיכה הטכנית. המחברים מכירים בד"ר. מורו איטו והירושי סואמאז מ-CIEA למתן העכברים TK-חעוגה ו ד ר יואכים באומגארט למתן טראוסולפן. המחברים מודים לד ר אדריאן קואסטרים, UNMC, על תרומת המאמר שלה לכתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
- Kong, L., et al.
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
