Summary
Dit protocol biedt een betrouwbare methode om gehumaniseerde muizen te vestigen met zowel menselijk immuunsysteem als levercellen. Dubbele gereconstitueerde immunodeficiënte muizen bereikt via intrasplenische injectie van humane hepatocyten en CD34+ hematopoietische stamcellen zijn vatbaar voor humaan immunodeficiëntie virus-1 infectie en even leverschade zoals waargenomen in HIV-geïnfecteerde patiënten.
Abstract
Ondanks de toegenomen levensverwachting van patiënten die geïnfecteerd zijn met humaan immunodeficiëntie virus-1 (HIV-1), is de leverziekte ontstaan als een veelvoorkomende oorzaak van hun morbiditeit. De lever Immunopathologie veroorzaakt door HIV-1 blijft ongrijpbaar. Kleine xenotransplantaatmodellen is diermodellen met humane hepatocyten en menselijk immuunsysteem kunnen de menselijke biologie van de pathogenese van de ziekte recapituleren. Hierin wordt een protocol beschreven om een dubbel gehumaniseerd muismodel tot stand te brengen door humane hepatocyten en CD34+ hematopoietische stam/voorlopercellen (HSPCs) transplantatie, om lever Immunopathologie te bestuderen zoals WAARGENOMEN bij HIV-geïnfecteerde patiënten. Om dubbele reconstitutie te bereiken, mannelijke TK-nog (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (Alb-tk) 7-2/shijic) muizen zijn intraperitoneaal geïnjecteerd met ganciclovir (gcv) doses te elimineren muis transgene levercellen, en met treosulfan voor nonmyeloablative conditionering, die beide vergemakkelijking van humane hepatocyten (HEP) engraftment en menselijk immuunsysteem (zijn) ontwikkeling. Humaan albumine (ALB) niveaus worden geëvalueerd voor lever engraftment, en de aanwezigheid van menselijke immuuncellen in bloed gedetecteerd doorstroming cytometrie bevestigt de oprichting van menselijk immuunsysteem. Het model ontwikkeld met behulp van het protocol beschreven hier lijkt op meerdere componenten van leverschade van HIV-1-infectie. De inrichting ervan kan essentieel blijken te zijn voor onderzoeken naar co-infectie met Hepatitis virus en voor de evaluatie van antivirale en antiretrovirale geneesmiddelen.
Introduction
Sinds de komst van antiretrovirale therapie, is er een aanzienlijke afname van sterfgevallen gerelateerd aan HIV-1 monoinfectie. Echter, leverziekte is ontstaan als een veel voorkomende oorzaak van morbiditeit bij HIV-geïnfecteerde patiënten1,2. Coinfecties van hepatitis virussen met HIV-1-infectie komen vaker voor dan 10%-30% van de HIV-geïnfecteerde personen in de Verenigde Staten3,4,5.
De gastheer-specificiteit van HIV-1 en hepatitis virussen beperkt het nut van kleine diermodellen om humane-specifieke infectieziekten te bestuderen of om meerdere aspecten van HIV-1-geassocieerde lever pathogenese onderzoeken. Immunodeficiënte muizen die het engraftment van menselijke cellen en/of weefsels (aangeduid als gehumaniseerde Muismodellen) toelaten, zijn acceptabele diermodellen voor preklinische studies6,7,8. Sinds de introductie van gehumaniseerde muizen in de vroege jaren 2000, meerdere Preklinische studies van cholestatische menselijke lever toxiciteit, humaan-specifieke pathogenen, met inbegrip van HIV-1 en HIV-geassocieerde Neurocognitieve stoornissen, Epstein Barr virus, hepatitis, en andere infectieziekten, zijn onderzocht bij deze muizen6,9,10,11. Meerdere Muismodellen voor CD34+ hspc's en/of humane hepatocyten transplantatie zijn al lang ontwikkeld en zijn na verloop van tijd verbeterd om de pathogenese van de ziekte van het hepatitis B-virus (HBV)-geassocieerde leverziekte12te bestuderen, 13 , 14. verschillende modellen voor hspc en humane hepatocyte (HEP) transplantatie zijn gebaseerd op stammen, bekend als nog (NOD. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, en Fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull muis16. Elk model heeft echter zijn eigen voordelen en beperkingen; bijvoorbeeld, AFC8 dubbele gehumaniseerde muizen voor HEPs en menselijke stamcellen (HSCs) op een Balb/C-Rag2-/- γc-/- achtergrond maakt de succesvolle engraftment van immune cellen en hscs, maar er is een afwezigheid van een antigeen-specifieke T-en B-cel antwoord in dit model12. De belangrijkste zorgen bij het reconstitueren van dubbele gehumaniseerde muizen zijn suboptimale engraftment, een gebrek aan geschikte modellen ter ondersteuning van verschillende weefsels, niet-overeenkomende aandoeningen, immuunafstoting of transplantaat-versus-hostziekte (gvhd), en technische moeilijkheden, zoals riskante manipulaties met pasgeborenen en hoge sterftecijfers als gevolg van metabole afwijkingen13.
Hoewel gehumaniseerd muizen zijn gebruikt voor HIV-onderzoek voor vele jaren17,18,19, het gebruik van gehumaniseerde muizen te bestuderen van leverschade veroorzaakt door HIV-1 is beperkt20. We eerder gemeld de oprichting van een dubbele gehumaniseerd TK-nog muismodel en de toepassing ervan in HIV-geassocieerde leverziekte8. Dit model toont de robuuste engraftment van lever en immune cellen en aan HIV infectie pathogenese. Deze discussie presenteert een gedetailleerd protocol, met inbegrip van de meest kritische stappen in de transplantatie van menselijke hepatocyten. Een beschrijving van de Hspc's die nodig zijn voor een geslaagde engraftment van HEPs en de oprichting van een functioneel immuunsysteem bij TK-nog muizen wordt ook gepresenteerd. Het gebruik van deze muizen om HIV-geassocieerde lever immunopathogenese te bestuderen is gedetailleerd. TK-nog mannelijke muizen met een lever-specifieke herpes simplexvirus type 1 thymidine kinase (HSV-tk) transgen worden gebruikt. Muis levercellen die dit transgen uitdrukken, kunnen gemakkelijk worden ablatie na een korte blootstelling aan een niet-toxische dosis van gcv. Getransplanteerde humane levercellen worden stabiel onderhouden binnen de muis lever zonder exogene drugs21. De muizen zijn ook voorgeconditioneerd met niet-myeloablatieve doses van treosulfan om een niche te creëren in het beenmerg van de muis voor menselijke cellen8. Immunodeficiënte TK-nog-muizen zijn intrasplenisch geïnjecteerd met HEPs en multipotente Hspc's. De muizen worden vervolgens regelmatig gecontroleerd op bloed en lever reconstitutie door immunofhenootypering in het bloed en metingen van respectievelijk serum humaan-albuminespiegels. Muizen met een succesvolle reconstitutie van meer dan 15% voor zowel menselijke immuuncellen als HEPs zijn intraperitoneaal geïnjecteerd met HIV-1. Het effect van HIV op de lever kan worden beoordeeld al in 4-5 weken na infectie. Het is van cruciaal belang om op te merken dat, omdat HIV-1 wordt gebruikt, alle nodige voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het hanteren van het virus en het injecteren in muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Nebraska Medical Center.
Opmerking: Verkrijg toestemming van de lokale IACUC voordat u experimenten op dieren uitvoert.
1. verwerking van navelstreng bloed en de isolatie van menselijke Hspc's
- Voer alle stappen van het protocol uit onder steriele omstandigheden in laminaire flow kasten.
- Neem de navelstreng bloed (CB) verzameld in gehepariniseerd tubes en maak het volume tot 35 ml door toevoeging van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Laag het monster bovenop de lymfocyten scheidings medium (LSM) zoals geïllustreerd in Figuur 1 en centrifugeer de LSM met de gelaagde CB bij 400 x g voor 35 min bij 4 °c zonder remmen.
Opmerking: Verdun het bloed voorzichtig en voorzichtig om te voorkomen dat het mengen in de interface. - Verwijder de bovenste LSM-en plasmaslaag zorgvuldig en breng de witte buffy coat-interface over naar een nieuwe buis met behulp van een pipet voor overdracht.
- Rebreng de Buffy coat in 30-40 mL ijskoude buffer (PBS + 0,5% boviene serumalbumine [BSA] + 2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur [EDTA]). Combineer met een pipet 20 μl van de celsuspensie met 20 μL van 0,4% trypeen blauw en Pipetteer 10 μL van het mengsel in de buitenste opening van een van de twee kamers van een teldia en plaats de dia in een geautomatiseerde cel teller om de cellen te tellen.
Opmerking: Gebruik ijskoude buffer in alle stappen, omdat het helpt de cellen levensvatbaar te houden. - Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c en zuig het supernatant voorzichtig op. Voeg vervolgens 300 μL ijskoude buffer toe.
- Voeg 100 μL humaan FC-receptor blokkerende reagens en 100 μL monoklonale muis anti-humane CD34 antilichaam-geconjugeerde microbeads toe voor maximaal 1 x 108 cellen (Zie de tabel met materialen). Inincuberen gedurende 30 minuten bij 4 °C, voeg 10 mL ijskoude buffer toe om de cellen te wassen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
Opmerking: Schaal dit volgens het celnummer als er meer dan 1 x 108 cellen aanwezig zijn. - Verwijder voorzichtig het supernatant, hervat de pellet in 500 μL buffer en ga verder met de magnetische scheidings stap om Hspc's te verrijken.
- Plaats een positieve selectie LS kolom (Zie de tabel van de materialen) in de magnetische-geactiveerde cel sorteren veld en doorgeven met 3 ml buffer.
- Laad het monster in de LS-kolom die microbeads gebonden aan humaan CD34 + in monsters kan verankeren en laat het onder invloed van de zwaartekracht in de opvang buis stromen.
- Was de kolom 3x met buffer en verzamel de Elueer in dezelfde verzamelbuis van de CD34- Fractie van cellen.
- Dompel de kolom in met 5 mL buffer om de CD34+ cellen in een nieuwe verzamelbuis te elzen. Herhaal de procedure om een zuiverheid van > 90% te bereiken.
- Tel de eluteerde CD34+ cellen met behulp van trypan blauwe kleurstof in een hemocytometer. Centrifugeer na het tellen de CD34+ -cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g en gooi het supernatant weg.
- Respendeer de CD34+ cellen in 25 μL PBS voor een injectie die onmiddellijk wordt gebruikt bij transplantatie of invriezen de cellen met een concentratie van 1-2 miljoen/ml in Vries medium (Roswell Park Memorial Institute medium [rpmi 1640 medium] + 50% foetaal runderserum (FBS) + 10% dimethylsulfoxide [DMSO]) voor verder gebruik bij transplantatie.
Opmerking: Altijd te vertellen levensvatbare cellen alvorens ze te gebruiken in transplantatie. - Om de zuiverheid van de CD34+ elute te controleren, neemt u 50 μL van de suspensie en inbroed deze met 10 μL PE-geconjugeerd anti-humaan CD34-antilichaam gedurende 30 minuten bij 4 °c. Na de incubatie van het antilichaam, de bevlekte cellen wassen met PBS, ze hervatten in 100 μL PBS en vervolgens doorgaan met het uitvoeren van Flowcytometrie. Voeg een extra buis van cellen toe zonder antilichamen om de poort in de flow-cytometer te ontwerpen.
- Analyseer na aanschaf de gegevens door het interessegebied te selecteren op een plot voor forward Scatter (FSC) en side Scatter (SSC), gevolgd door gating voor afzonderlijke cellen op FSC-gebied en FSC-Height plots. Gate CD34-positieve cellen op afzonderlijke cellen in het PE-kanaal en het SSC-gebied plot.
2. bereiding van humane hepatocyten voor transplantatie
- Verwijder de cryopreserved hepatocyten uit de vloeibare stikstof, snel onderdompelen de flacon in het waterbad, en ontdooien voor ongeveer 90-120 s.
- Verwijder de dop van de injectieflacon en giet de ontdooide hepatocyten in de conische buis van 50 mL van het verwarmde medium.
- Onderbreek de cellen door de buis van 50 mL met de hand te rocken voor een paar seconden.
Opmerking: Draai de buis niet Vortex. - Pellet de cellen bij 100 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. Was de omhulde cellen in PBS met 0,1% BSA en bad ze met verse of ontdooide Hspc's (verhouding 10:1) in PBS in een eindvolume van 80 μL/muis.
3. verwerking van dieren, screening, genotypering en behandeling van humane HSPC en hepatocyten transplantatie
- Omgaan met dieren
- Als gevolg van ernstige immunodeficiëntie, ras, huis, en omgaan met TK-nog muizen onder aseptische omstandigheden.
- Draag altijd een Labcoat, handschoenen, schoen hoezen en een gezichtsmasker om besmetting met potentieel pathogene micro-organismen te voorkomen.
- Gebruik steriele handschoenen en instrumenten voor chirurgie en behandel de dieren aseptisch gedurende de hele operatie.
- Selecteren van TK-nog-muizen voor het experiment
- Onderhouden van de TK-nog stam kolonie door het fokken van vrouwelijke TK-nog muizen met mannelijke niet-TK-nog littermates en selecteer transgene nakomelingen door genotypering.
Opmerking: Voer genotypering uit (zie stap 3,3) om de aanwezigheid of afwezigheid van het transgen bij pasgeboren mannelijke en vrouwelijke muizen op het moment van spening te bepalen. - Selecteer mannetjes op 6-8 weken voor transplantatie vanwege hun hoge gevoeligheid voor de door GCV gemedieerde depletie van HSV-TK transgene-het uitdrukken van hepatocyten21.
- Oor-tag de muizen op het moment van spening of chirurgie om identificatie te verlichten. Noteer het gewicht en de gezondheidstoestand van de dieren.
- Onderhouden van de TK-nog stam kolonie door het fokken van vrouwelijke TK-nog muizen met mannelijke niet-TK-nog littermates en selecteer transgene nakomelingen door genotypering.
- Genotypering voor de aanwezigheid van het HSV-TK-transgen met behulp van kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie
- Voer genotypering uit op het moment van spenen (meestal op 3-4 weken oud). Snijd voor genotypering een stukje van het muis oor in een biologische veiligheidskast van laminaire stroming om de steriliteit te behouden en het genomisch DNA uit te pakken met behulp van een genomische DNA-isolatiekit.
- Amplify genomisch DNA geëxtraheerd uit het oorstukje in een 20 μL reactiemengsel op het scherm voor HSV-tk-transgen onder controle van de promotor van humane albumine door 1 μL voorwaartse primer 5 '-ccatgcacgtctttatcctgg-3 ' toe te voegen; 1 μl omgekeerde primer 5 '-taagttgcagcagggcgtc-3 ', 0,5 μL van FAM probe 5 ′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 ', en 10 μL Master mix op een real-time polymerase kettingreactie (PCR) instrument22.
- Stel de real-time PCR-instellingen als volgt in: 60 °C gedurende 30 sec. (preread fase), 95 °C gedurende 10 min (Hold stage), 40 cycli van 95 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 1 minuut (PCR-fase) en 60 °C gedurende 30 s (postread stage).
Opmerking: Een cyclus van drempel (CT) onder 22 wordt beschouwd als positief voor HSV-TK transgene.
- Behandeling met ganciclovir en treosulfan
- Injecteer met een naald van 27 G de TK-nog-muizen met intraperitoneale GCV-injecties (6 mg/kg) 2x per dag op dag 7 en op dag 5 in 100 μL zoutoplossing vóór de operatie om de transgene parenchymale cellen van de muizen af te putten (zoals weergegeven in de experimentele strategie in Figuur 2)23 .
- Op de dagen 3, 2 en 1 voor de operatie, voor waarde muizen met nonmyeloablative intraperitoneale doses van treosulfan (1,5 g/kg/dag) in 100 μL zoutoplossing, met behulp van een naald van 27 G.
- Trek één dag voor de operatie twee tot drie druppels (~ 100 μL) bloed uit de submandibulaire ader door het te prikken met een lancet van 5 mm, en Isoleer het serum door centrifugeren (1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c) voor de ALANINEAMINOTRANSFERASE (ALT) assay om de degr te beoordelen ee van leverbeschadiging.
- Voorbereiding voor de operatie
- Gebruik de Clippers om de vacht van de muis rond de incisieplaats te scheren (links van de peritoneale muur) vóór de operatie.
- Stel de zuurstoftoevoer in op 1 L/min en de Isofluraan stroom naar 3%-5% in een inductie kamer met behulp van een muis anesthesie machine. Plaats een muis in een tijd in de inductie kamer voor anesthesie.
- Bevestig het ene uiteinde van een steriele verlengbuis (met een vasthoud capaciteit van 550 μL suspensie; zie de tabel met materialen voor specificaties) op een 30 G naald en het andere uiteinde op een 1 ml spuit.
- Vul de spuit met de suspensie (80 μL/muis) van gepoolde HEPs en Hspc's (zie rubriek 2), plaats de spuit in de inkeping van een repetitieve doseerpipet en pas de dispenser aan om in elke pers 10 μL te doseren.
- Zodra de muizen verdoiliseerd zijn (meestal na 3-4 min), schakelt u de Isofluraan stroom naar de neuskegel en verlaagt u het isofluraandebiet tot 2%-3%.
- Intrasplenische transplantatie van humane Hspc's en hepatocyten bij muizen
- Voer alle operatie stappen uit in een laminaire flowkast onder steriele omstandigheden.
- Plaats een schone steriele draperen over het werkoppervlak en Schrob de linkerzijde van het lichaam van elke muis met 10% Povidon-jodium gevolgd door 70% isopropylalcohol, alvorens een incisie te maken.
- Maak een kleine incisie (~ 1-1,5 cm in lengte en 5 mm diep) in de huid, spier, en peritoneum links van de peritoneale wand met Vanna's type schaar om de peritoneale holte ongeveer 5 mm onder de onderrand van de ribbenkast te betreden.
- Zoek de milt, trek het iets met een tang naar het werkgebied voor gemakkelijke toegang, en steek de 30 G naald in de onderste pool van de milt.
- Ontgrendel de zuiger van de doseerpipet en verdeel 10 μL van het volume per keer, met een limiet van 60-80 μL op de milt. Trek de naald langzaam in en knip de milt met ligende clips met behulp van een ligatie-Applier.
- Duw de milt terug in de lichaamsholte met katoen-getipt applicatoren bevoafd met steriel PBS.
- Sluit de spierlaag van de buikwand met behulp van een absorbabel hechtdraad onderbroken hecht patroon (niet continu). Bereiken van de huid sluiting met een onderbroken hecht patroon met behulp van niet-absorbabele hechtingen.
- Gebruik warm water circulerende pads om de muizen te beschermen tegen hypothermie na de operatie.
- Verwijder niet-absorbabele hechtingen 10-14 dagen na de operatie.
- Postoperatieve zorg
- Wanneer het getransplanteerde dier wordt wakker, Injecteer dan analgetische buprenorfine (0,1 mg/kg) intraperitoneaal, 2x per dag gedurende een opeenvolgende 3 dagen.
- Observeer de dieren ten minste 1x per dag totdat ze terugkeren naar normale fysieke omstandigheden.
Opmerking: Controleer het lichaamsgewicht van elk dier, aangezien sommige muizen een postoperatieve ingreep kunnen verliezen. Muizen krijgen meestal hun oorspronkelijke gewicht in 1 tot 2 weken terug.
4. engraftment validatie van de humane lever door ELISA en het menselijk immuunsysteem door flow Cytometrie
Opmerking: Evalueer de reconstitutie van de menselijke lever en het immuunsysteem maandelijks, beginnend 1 maand na transplantatie door enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) en Flowcytometrie, respectievelijk.
- Verzamel bloedmonsters van de submandibulaire ader met behulp van lantes in EDTA-buisjes en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 1.500 x g . Isoleer serum om de humane albuminespiegels te controleren om de engraftment-efficiëntie van de lever van de muis voor getransplanteerde humane hepatocyten te beoordelen, met behulp van een humane albumine ELISA-kwantitatie set (Zie de tabel met materialen) door de fabrikant Instructies.
Opmerking: Gooi de pellet niet weg en gebruik de gepileerde cellen voor een Flowcytometrie analyse om de reconstitutie van het menselijk immuunsysteem te evalueren. - Respendeer de celpellet zonder serum in 35 μL FACS buffer (PBS + 2% FBS) en gekleurd met 5 μL muis-specifieke CD45 (concentratie 0,5 mg/mL), 5 μL elk van de humaan-specifieke antilichamen CD45 (0,1 mg/mL), CD3 (0,2 mg/mL), CD8 (0,1 mg/mL) en CD19 (0,5 mg/mL) , en 20 μL CD4 (0,25 mg/mL) en CD14 (0,25 mg/mL) elk gedurende 30 minuten bij 4 °C, om de ontwikkeling van een functioneel immuunsysteem van CD34+ hspc's te controleren.
Opmerking: Overweeg het toevoegen van een extra buis van Onbevlekte cellen om te bepalen van de gating van de bevlekte cellen. - Breng na incubatie de bevlekt suspensie (~ 100 μL) in een polystyreen ronde bodem Flow cytometrie buis en gebruik 2 mL 1x lysisbuffer (Zie de tabel met materialen) door 1 deel van de 10x lysisbuffer met 9 delen gedistilleerd water te verdunen en 10- 15 min naar lyse rode bloedcellen.
Opmerking: observeer troebelheid om de rode bloedcel lysis te evalueren. Zodra het monster duidelijk wordt, is de lysis compleet. - Na de lysis, voeg 3 mL van de FACS buffer in de buis en centrifugeer op 300 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten om een pellet te krijgen. Herhaal de wassing door 3 mL FACS buffer toe te voegen aan de pellet en centrifugeer bij 300 x g bij 4 °c gedurende 5 min.
- Repareer de cellen in vers gemaakte 1% Paraformaldehyde (PFA) en verkrijg bevlekte cellen op de flow cytometer, geanalyseerd met Flow software.
- Selecteer voor de analyse lymfocyten gating op een FSC/SSC-plot, gevolgd door eencellige gating op FSC-gebied/FSC-hoogte.
- Verder, poort voor humaan-specifieke CD45 (hCD45) op de eencellige populatie en omvatten muis-specifieke CD45 (mCD45) voor de uitsluiting van cellen van Murine oorsprong. Strategize gating van de bevlekte bevolking op basis van het gating van Onbevlekte cellen.
- Gate hCD45+ cellen om de frequentie van CD3+ T-cellen en CD19+ B-cellen te bepalen. Gate T-cellen om de CD4-en CD8-subsets te bepalen. Om monocyten te evalueren, Gate op hCD45 om te bepalen CD14+ monocyten.
5. HIV-infectie van TK-nog-muizen en het effect ervan op de menselijke lever en het immuunsysteem
- Behandel het HIV-1-virus en alle geïnfecteerde muizen in een aangewezen bioveiligheid Level 2-faciliteit.
Let op: Autoclaaf en gooi alle HIV-geïnfecteerde afvalstoffen weg in dubbele Biohazard zakken. Draag om veiligheidsredenen snijbestendige handschoenen bij het overhandigen van HIV-geïnfecteerde muizen. - Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van een wegwerp overall Gown, schoen hoezen, een gezichtsmasker en dubbele handschoenen te allen tijde tijdens het werken met het virus.
- Selecteer muizen met een reconstitutie van meer dan 15% van de humane CD45+ cellen (getest in stap 4,7) en met een aanwezigheid van humaan albumine in het serum voor HIV-1-infectie (getest in stap 4,1).
- Injecteer de muizen met 1 x 103 tot 1 x 104 weefselkweek infectieuze DOSES 50 (TCID50) HIV-1ADA in een volume van 100-200 μL per muis, intraperitoneaal.
- Euthanuseer de HIV-geïnfecteerde muizen 5 weken na infectie met behulp van Isofluraan (met een Isofluraan dampconcentratie van > 5%).
- Na het euthanaseren van de muizen, het verzamelen van bloed in EDTA buizen door een cardiale punctie voor de isolatie van serum, om het effect van HIV-1 op de lever te zien door het evalueren van humaan-specifieke albumine niveaus door ELISA (zie stap 4,1) en bloedcellen om te controleren op veranderingen in het menselijk immuunsysteem cellen met behulp van Flowcytometrie (Zie stappen 4,2-4,8).
Opmerking: Evalueer de perifere virale belasting 5 weken na infectie op een bioanalysator om te bevestigen of de muizen besmet zijn. - Na het tekenen van bloed, accijnzen de lever van de geëeuthanaseerde muizen.
- Voor de lever excisie, bloot de buikholte door het maken van een incisie van 1,5-2 cm lang en 0,5 cm diep in de huid, spieren, en peritoneum, van de xyphoid. Maak een snede loodrecht op de wervelkolom tussen de lever en het diafragma. Til de lever op en Sever alle membranen die het aan de maag en darmen bevestigen.
- Verzamel en fixeer de lever in 4% Paraformaldehyde 's nachts en volg een standaard immunohistochemisch protocol om het effect van HIV op CK18+ hepatocyten te evalueren met behulp van humaan-specifieke CK18 antilichamen8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De oprichting van een Dual gehumaniseerd muismodel met menselijke lever en immune cellen kan gemakkelijk worden bewaakt bij elke stap met zeer eenvoudige ELISA en flow cytometrie, respectievelijk. Flow cytometrie wordt regelmatig uitgevoerd om de ontwikkeling van een functioneel immuunsysteem te evalueren en om het effect van HIV-infectie op immuuncellen te zien. In Dual gehumaniseerde muizen kan de ontwikkeling van functionele immuuncellen variëren van 15% tot 90% van de lymfocyten poort. Representatieve subgroepen van immuuncellen worden weergegeven in punt plots (Figuur 3). Voor de evaluatie van de engraftment van menselijke hepatocyten, wordt ELISA voor humaan-specifieke albumine niveaus maandelijks uitgevoerd op muizen serum. Muizen die zijn geënt met zowel Hspc's als HEPs tonen humaan-specifieke albuminespiegels variërend van ~ 7 μg/mL tot 377 μg/mL op één maand, en blijven groeien gedurende de observatieperiode (6 maanden) (Figuur 4). Het effect van HIV-infectie op menselijke immuuncellen in het bloed van dubbele gehumaniseerde muizen wordt gecontroleerd door Flowcytometrie en op HEPs in de lever door humaan-specifieke albumine ELISA. Met 5 weken, HIV-1 veroorzaakt een afname van de menselijke albumine niveaus in het serum, zoals beoordeeld door ELISA, en er is een depletie van menselijke CK18+ hepatocyten in de lever secties van dubbele gehumaniseerd muizen, zoals geëvalueerd door immunohistochemie (Figuur 5). Een lagere verhouding van CD4: CD8 wordt meestal waargenomen, door Flowcytometrie, in het bloed en de lever van HIV-geïnfecteerde muizen, in vergelijking met de niveaus genoteerd in dezelfde muis vóór de infectie (Figuur 6). Alle reagentia en materialen die belangrijk zijn voor het protocol worden besproken in de tabel met materialen.
Figuur 1 : Schematische voorstelling van de verrijking van CD34+ cellen uit het snoer bloed. A) het snoer bloed is gelaagd op lymfocyten scheidings medium (LSM) en gecentrifugeerd om buffy coat te isoleren. B) de LS kolommen worden op een magnetische standaard geplaatst en met een BSA-buffer gespoeld, gevolgd door het toevoegen van Buffy coat. Cellen die positief zijn voor CD34, worden in de kolommen gevangen en CD34- cellen worden in afzonderlijke buisjes elzen. Gevangen CD34+ cellen in kolom harsen worden ondergedompeld met een zuiger, en de cellen worden verzameld in een nieuwe buis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Schematische weergave van het experimentele ontwerp voor de dubbele reconstitutie van gehumaniseerd lever-en immuunsysteem muizen, gevolgd door HIV-1-infectie. TK-nog-muizen worden geïnjecteerd met ganciclovir (GCV) in een dosis van 6 mg/kg, 2x per dag, op dag-7 en dag-5, gevolgd door een treosulfan injectie op dagen-3,-2 en-1. Om de muizen voor de transplantatie (TX) te schermen, wordt een alanineaminotransferase (ALAT) test uitgevoerd één dag voor de operatie, en muizen met ALT-niveaus van > 200 en < 600 U/L worden geselecteerd. Na transplantatie worden de muizen gecontroleerd op een reconstitutie van het menselijke immuunsysteem door middel van flow cytometrie (FACS) en voor de reconstitutie van de lever door de beoordeling van hun albumine niveau met ELISA. De muizen zijn geïnfecteerd met HIV-1 5 weken voordat ze worden geofferd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Flow cytometrie analyse gating strategie voor de menselijke celverdeling van bloed. A) eerst worden lymfocyten op volbloed op basis van FSC-a en SSC-a afgesloten. B) enkele cellen worden op lymfocyten afgesloten. (C) humane CD45+ leukocyten worden op enkele cellen afgesloten met behulp van muis CD45 en menselijke CD45. D) CD3+ T-cellen en CD19+ B-cellen worden geïdentificeerd op gated CD45+ humane leukocyten. E) CD4+ t-hulpcellen en CD8+ cytotoxische t-cellen worden geïdentificeerd in gated CD3+ t-cellen. (F) CD14+ monocyten worden afgesloten van humane CD45+ leukocyten. De hier vertegenwoordigde resultaten zijn van de ene muis getransplanteerd met dubbele humane hepatocyten en Hspc's. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Albumine concentratie wordt gemeten door Elisa in het serum van dubbele gehumaniseerde muizen. De muizen worden getransplanteerd met zowel humane hepatocyten (HEPs) als CD34+ hematopoietische stam/voorlopercellen (Hspc's) (n = 11). Serum wordt verzameld op verschillende tijdstippen bij 1, 4 en 6 maanden na transplantatie, en verdunningen worden gemaakt om de onbekende monsterconcentraties in het bereik van normen aan te passen. Elk symbool vertegenwoordigt een afzonderlijke muis waarde. De resultaten vertegenwoordigen de mediaan, evenals individuele waarden. * P < 0,05, in one-way ANOVA. Dit cijfer is gewijzigd van Dagur et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Effect op HIV-1 op albuminespiegels in serum en de uitputting van CK18+ humane hepatocyten in de lever van dubbele gehumaniseerde muizen. A) de albumine concentraties worden gecontroleerd bij niet-geïnfecteerde muizen (n = 9), getransplanteerd met zowel menselijke heps als hspc's na 1 en 4 maanden. De muizen zijn geïnfecteerd (n = 10) met HIV bij 4-5 maanden na transplantatie en geofferd 5 weken na infectie. Elk symbool vertegenwoordigt een afzonderlijke muis waarde. De resultaten vertegenwoordigen de mediaan, evenals individuele waarden. * P < 0,05, in one-way ANOVA. Dit cijfer is gewijzigd van Dagur et al. 8. (B) vijf micron lever secties van niet-geïnfecteerde (heps + hspc's, linker paneel) en HIV-geïnfecteerde tk-nog muizen (heps + hspcs + HIV, rechter paneel) zijn vast, paraffine ingebed, en gekleurd voor anti-menselijke cytokeratin-18 (CK18) antilichaam. HIV-1 veroorzaakt een uitputting van CK18+ hepatocyten wordt aangetoond door een minder bezet gebied door de CK18+ menselijke cellen. De hier vertegenwoordigde resultaten zijn afkomstig van één niet-geïnfecteerde en één met HIV geïnfecteerde muis die is getransplanteerd met dubbele humane hepatocyten en Hspc's. schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Verhouding van CD4+ -cellen tot CD8+ T-cellen in perifeer bloed en in de lever van dubbel gereconstitueerde, niet-geïnfecteerde en met HIV-1 geïnfecteerde muizen. Voor dubbele gereconstitueerde niet-geïnfecteerde muizen: gesloten cirkel; HEPs + HSPCs; bloed n = 7; lever n = 6. Voor met HIV-1 geïnfecteerde muizen: open cirkels; HEPs + HSPCs + HIV; bloed n = 10; lever n = 11. De resultaten vertegenwoordigen de mediaan, evenals individuele waarden. * P < 0,05, door een one-way ANOVA-test tussen HIV-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde muizen. Dit cijfer is gewijzigd van Dagur et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De lever is aangetast en beschadigd bij HIV-geïnfecteerde patiënten24. Experimentele kleine diermodellen voor het bestuderen van menselijke leverziekten in de aanwezigheid van HIV-1 is zeer beperkt, ondanks de beschikbaarheid van een paar gecotransplanteerde diermodellen met CD34+ hspcs en hepatocyten7,12, 25. In in vitro experimenten, hepatocyten worden aangetoond dat een laag niveau HIV-1-infectie26. Gehumaniseerde muizen die beide soorten menselijke cellen dragen, zijn een wenselijk model. De lever van muizen die zijn gereconstitueerd met alleen menselijk immuunsysteem is aangetoond dat het wordt beïnvloed door HIV-infectie onder de experimentele uitputting van humane regulatoire T-cellen20,27. Echter, het verschil in immuun en functionele eigenschappen van muis en menselijke hepatocyten kunnen de verschillen in hun reacties op HIV-1 en immune cellen onderstrepen. In deze review wordt een protocol beschreven om zowel menselijk immuunsysteem als lever te reconstitueren en HIV-1-geassocieerde lever Immunopathologie aan te pakken, zoals waargenomen bij met HIV-1 geïnfecteerde patiënten. TK-nog-mannelijke muizen werden geselecteerd vanwege hun lever selectieve hoge mRNA-expressie van HSV-tk-transgen en de gevoeligheid van gcv-toxiciteit voor transgen lever van muizen21. Bovendien kunnen ze gedurende lange perioden na transplantatie worden gehandhaafd zonder het gebruik van exogene geneesmiddelen en ontwikkelen ze geen spontane systemische ziekten28. Om menselijk immuunsysteem en lever reconstitutie te vestigen, ablatie van het immuunsysteem van de muis en schade aan muis-specifieke levercellen zijn vereist en bereikt met behulp van nonmyeloablative doses van treosulfan en GCV, zoals eerder getoond in TK-nog mannelijke muizen13 ,23. Muizen worden geïnjecteerd met gcv en treosulfan op de leeftijd van 6-8 weken, omdat de expressie van transgen en gcv-geïnduceerde leverbeschadiging, zoals beoordeeld door de Alt-niveaus, optimaal is voor het leveren van niche-naar-getransplanteerde menselijke cellen21. Muizen die de ALT-niveaus van > 200 U/L, maar < 600 U/L, worden meestal geselecteerd voor transplantatie. Muizen tonen ALT niveaus van > 600 U/L zijn op een groter risico van de dood als menselijke hepatocyten zijn niet in staat om de beschadigde muis leverfunctie te redden.
Op dit moment, dubbele humanisatie wordt aangetoond door de transplantatie van menselijke CD34+ hspcs en foetale levercellen; echter, de manipulatie van pasgeboren dieren creëert technische problemen13,14. Hspc's kunnen worden afgeleid of geïsoleerd uit meerdere bronnen, zoals foetale levercellen (Flc's), embryonale stamcellen (ESCs) en CB. Ethische kwesties beperken echter het gebruik van ESCs en Flc's. CB heeft geen dergelijke beperking en is een nuttigst alternatief voor het verkrijgen van Hspc's, evenals een waardevolle bron van primitieve hematopoietische stam-en voorlopercellen die het functionele immuunsysteem kunnen reconstitueren Systeem. Het snoer bloed mag niet ouder zijn dan één dag wanneer het wordt gebruikt om Hspc's te isoleren, omdat de opbrengst van Hspc's sterk wordt beïnvloed door de leeftijd. De zuiverheid van de geïsoleerde Hspc's moet worden gecontroleerd voordat cryopreserverende de cellen. De kruisbesmetting van CD3+ T cellen wordt vermeden, omdat dit kan leiden tot systemische muizen Graft-versus-host ziekte en acute Allorejectie van heps tijdens het transplanteren met niet-overeenkomende cellen.
In de handel verkrijgbare hepatocyten werden gebruikt als een bron voor lever reconstitutie8,13. Volwassen hepatocyten hebben de voorkeur voor de vaststelling van de lever reconstitutie als gevolg van hun verhoogde efficiëntie in engraftment en duurzaamheid voor een lange periode van tijd29.
De aanwezigheid van menselijk immuunsysteem in een muismodel verhoogde Alb-niveaus, zoals eerder weergegeven30,31. De efficiëntie van hepatocyten en reconstitutie van het immuunsysteem kan echter variëren met verschillende bronnen van donor cellen en is afhankelijk van de ontvangende muis. Dus, elke muis moet worden beoordeeld voor engraftment, en het meest kritische deel is het gebruik van de antilichamen of reagens die menselijk-specifieke zijn en niet cross-reageren met muis cellen. De humane-specifieke reagentia en antilichamen die in de hier gepresenteerde studie worden gebruikt, worden gedetailleerd beschreven in de materiaal tabel. Als er andere antilichamen dan in de inhoudstafel worden gebruikt voor de studie, moet u controleren op de menselijke specificiteit.
De optimale conditie zou de transplantatie van syngene cellen zijn; dat is echter technisch moeilijk te verwezenlijken. Waar mogelijk moeten Hspc's en hepatocyten worden samengevoegd van donoren met gedeeltelijk overeenkomende humane leukocyten klasse-1 antigenen (zoals HLA-a2).
Voor het scherm muizen voor HIV-studies, bloed wordt getrokken op meerdere tijdstippen om te bepalen van de optimale immuun en lever reconstitutie; Flow cytometrie en ELISA hebben de voorkeur omdat ze met slechts een kleine hoeveelheid bloed kunnen worden uitgevoerd. Bloedcellen en serum uit hetzelfde monster kunnen respectievelijk worden gebruikt voor Flowcytometrie en ELISA. Het is belangrijk om op elk tijdstip (1.000-40.000 bereik) goede verdunningen van het serum te maken om de ALB-niveaus te evalueren, zodat de onbekende concentraties binnen het bereik van standaardconcentraties kunnen worden gebracht (Kit Range: 6,25-400 ng/mL).
Proinflammatoire cytokines als reactie op HIV-1-infectie in de aanwezigheid van menselijk immuunsysteem kan ook nuttig zijn bij het aanpakken van de interactie van hepatocyten en immuuncellen. Het model is nuttig voor het tonen van de immunopathogenese van HIV-1-geïnduceerde leverziekte, gezien het feit dat het leverschade op dezelfde manier als bij de mens aan, blijkt uit een lage ratio van CD4: CD8, een afname van de Alb niveaus, humane hepatocyten dood, en lever immuun Activering. Het model heeft ook een aantal beperkingen, zoals een laag niveau van cytotoxische T-cellen activiteit en verminderde immunoglobuline klasse schakelen. Als gevolg van de aanwezigheid van zowel menselijk immuunsysteem en lever, het model hier gepresenteerd is veelbelovend voor Studi coinfecties van HIV-1 en hepatitis virussen, chronische hepatitis infectie (ter verduidelijking van de mechanismen van de anti-hepatitis immuunrespons), en als een cirrose Model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door het National Institute of Health Grant R24OD018546 (to L.Y.P. and S.G.). De auteurs willen graag Weizhe Li, Ph.D. bedanken voor de hulp bij chirurgische ingrepen, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng voor immunohistologie, UNMC flow cytometrie Research Facility leden Director Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S. en Samantha Wall, b.s., unmc Advanced microscopie kern faciliteit leden Janice A. Taylor, b.s., en James R. talaska, b.s., voor de technische ondersteuning. De auteurs erkennen drs. Mamoru Ito en Hiroshi Suemizu van CIEA voor het verstrekken van TK-nog muizen en Dr. Joachim Baumgart voor het verstrekken van treosulfan. De auteurs danken Dr. Adrian Koesters, UNMC, voor haar redactionele bijdrage aan het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
