Summary
Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode, um humanisierte Mäuse mit menschlichem Immunsystem und Leberzellen zu etablieren. Dual rekonstituierte immundefizienten Mäuse, die durch intrasplenische Injektion von humanen Hepatozyten und CD34+ hämatopoetischen Stammzellen erreicht werden, sind anfällig für eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 und rekapitulieren Leberschäden, wie in HIV-infizierte Patienten.
Abstract
Trotz der erhöhten Lebenserwartung von Patienten, die mit dem humanen Immundefizienzvirus-1 (HIV-1) infiziert sind, hat sich die Lebererkrankung als häufige Ursache ihrer Morbidität herausgestellt. Die durch HIV-1 verursachte Leberimmunpathologie bleibt schwer fassbar. Kleine Xenograft-Tiermodelle mit menschlichen Hepatozyten und dem menschlichen Immunsystem können die menschliche Biologie der Pathogenese der Krankheit rekapitulieren. Hierin wird ein Protokoll beschrieben, um ein duales humanisiertes Mausmodell durch menschliche Hepatozyten und CD34+ hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs) zu etablieren, um die Leberimmunpathologie zu untersuchen, wie sie bei HIV-infizierten Patienten beobachtet wurde. Um eine doppelte Rekonstitution zu erreichen, ist das männliche TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) Mäuse werden intraperitoneal mit Ganciclovir (GCV) Dosen injiziert, um transgene Leberzellen der Maus zu eliminieren, und mit Treosulfan für nichtmyeloablative Konditionierung, die beide die Entwicklung des humanen Hepatozyten (HEP) und der Entwicklung des menschlichen Immunsystems (HIS). Humanalbumin (ALB) Ebenen werden für Lebertransplantation ausgewertet, und das Vorhandensein von menschlichen Immunzellen im Blut durch Durchflusszytometrie erkannt bestätigt die Etablierung des menschlichen Immunsystems. Das Modell, das mit dem hier beschriebenen Protokoll entwickelt wurde, ähnelt mehreren Komponenten von Leberschäden durch HIV-1-Infektion. Seine Einrichtung könnte sich als wesentlich für Studien zur Hepatitis-Virus-Koinfektion und für die Bewertung antiviraler und antiretroviraler Medikamente erweisen.
Introduction
Seit dem Aufkommen der antiretroviralen Therapie ist die Zahl der Todesfälle im Zusammenhang mit der HIV-1-Monoinfektion erheblich zurückgegangen. Lebererkrankungen haben sich jedoch als häufige Ursache für Morbidität bei HIV-infizierten Patienten1,2herauskristallisiert. Koinfektionen von Hepatitis-Viren mit HIV-1-Infektion sind häufiger und machen 10% - 30% der HIV-Infizierten in den Vereinigten Staaten3,4,5aus.
Die Wirtssspezifität von HIV-1- und Hepatitis-Viren begrenzt den Nutzen von Kleintiermodellen, um menschenspezifische Infektionskrankheiten zu untersuchen oder mehrere Aspekte der HIV-1-assoziierten Leberpathogenese zu untersuchen. Immundefizienten Mäuse, die die Engraftierung menschlicher Zellen und/oder Gewebe (als humanisierte Mausmodelle bezeichnet) ermöglichen, sind akzeptable Tiermodelle für präklinische Studien6,7,8. Seit der Einführung humanisierter Mäuse in den frühen 2000er Jahren wurden mehrere präklinische Studien zur cholestatischen menschlichen Lebertoxizität, humanspezifischen Krankheitserregern, einschließlich HIV-1- und HIV-assoziierter neurokognitiver Störungen, Epstein-Barr-Virus, Hepatitis und Infektionskrankheiten, wurden bei diesen Mäusen untersucht6,9,10,11. Mehrere Mausmodelle für CD34+ HSPCs und/oder menschliche Hepatozytentransplantationen wurden seit langem entwickelt und haben sich im Laufe der Zeit verbessert, um die Krankheit pathogenese des Hepatitis-B-Virus (HBV)-assoziierten Lebererkrankung12, 13 , 14. Mehrere Modelle für HSPC und Humanhepatozyten (HEP) Transplantation basieren auf Stämmen, bekannt als NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- éc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, und fah-/- NOD rag1-/- il2r-null-Maus16. Jedes Modell hat jedoch seine eigenen Vorteile und Einschränkungen; Zum Beispiel ermöglicht AFC8 dual humanized mice for HEPs and human stem cells (HSCs) auf einem Balb/C-Rag2-/- 'c-/- Hintergrund die erfolgreiche Entransplantation von Immunzellen und HSCs, aber es fehlt eine antigenspezifische T- und B-Zelle Antwort in diesem Modell12. Die Hauptprobleme bei der Rekonstituierung doppelt humanisierter Mäuse sind die suboptimale Engraftmentierung, das Fehlen geeigneter Modelle zur Unterstützung verschiedener Gewebe, nicht übereinstimmende Bedingungen, Immunabstoßung oder Transplantat-versus-Wirtskrankheit (GVHD) und technische Schwierigkeiten, wie riskante Manipulationen bei Neugeborenen und hohe Sterblichkeitsraten aufgrund metabolischer Anomalien13.
Obwohl humanisierte Mäuse seit vielen Jahren für die HIV-Forschung verwendet werden17,18,19, die Verwendung von humanisierten Mäusen zur Untersuchung von Leberschäden durch HIV-1 ist begrenzt20. Wir berichteten zuvor über die Etablierung eines dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells und dessen Anwendung bei der HIV-assoziierten Lebererkrankung8. Dieses Modell zeigt die robuste Transplantation von Leber- und Immunzellen und rekapituliert die PATHOGENese der HIV-Infektion. Diese Diskussion enthält ein detailliertes Protokoll, das die wichtigsten Schritte bei der Transplantation menschlicher Hepatozyten enthält. Eine Beschreibung der HSPCs, die für eine erfolgreiche Engraftmentierung von HEPs und die Etablierung eines funktionellen Immunsystems bei TK-NOG-Mäusen erforderlich sind, wird ebenfalls vorgestellt. Die Verwendung dieser Mäuse zur Untersuchung der HIV-assoziierten Leberimmunopathogenese ist detailliert. TK-NOG-Männchenmäuse, die ein leberspezifisches Herpes-Simplex-Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-TK) Transgen tragen, werden verwendet. Mausleberzellen, die dieses Transgen exprossieren, können nach einer kurzen Exposition gegenüber einer ungiftigen Dosis gCV leicht abgetrieben werden. Transplantierte menschliche Leberzellen werden in der Mausleber ohne exogene Medikamente stabil gepflegt21. Die Mäuse sind auch mit nichtmyeloablativen Dosen von Treosulfan, um eine Nische im Mausknochenmark für menschliche Zellen zu schaffen8. Immundefizienten TK-NOG-Mäuse werden intrasplenisch mit HEPs und multipotenten HSPCs injiziert. Die Mäuse werden dann regelmäßig auf Blut- und Leberrekonstitution durch Blutimmunphenotypisierung und Messungen des Serum-Human-Albumin-Spiegels überwacht. Mäuse mit einer erfolgreichen Rekonstitution von mehr als 15% für menschliche Immunzellen und HEPs werden intraperitoneal mit HIV-1 injiziert. Die Wirkung von HIV auf die Leber kann bereits nach 4 - 5 Wochen nach der Infektion beurteilt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass, da HIV-1 verwendet wird, alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen, während das Virus behandelt und in Mäuse injiziert werden.
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Protocol
Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am University of Nebraska Medical Center genehmigt.
HINWEIS: Die Zulassung des örtlichen IACUC erhalten Sie, bevor Sie Tierversuche durchführen.
1. Verarbeitung von Nabelschnurblut und Isolierung menschlicher HSPCs
- Führen Sie alle Schritte des Protokolls unter sterilen Bedingungen in laminaren Durchflussschränken aus.
- Nehmen Sie Nabelschnurblut (CB) in heparinisierten Röhrchen und machen Sie das Volumen bis zu 35 ml durch Zugabe von phosphatgepufferter Saline (PBS). Schichtung der Probe auf dem Lymphozytentrennmedium (LSM), wie in Abbildung 1 dargestellt, und Zentrifugieren Sie das LSM mit dem geschichteten CB bei 400 x g für 35 min bei 4 °C ohne Bremsen.
HINWEIS: Verdünnen Sie das Blut sorgfältig und vorsichtig, um eine Vermischung an der Schnittstelle zu vermeiden. - Entfernen Sie die obere LSM- und Plasmaschicht sorgfältig und übertragen Sie die weiße Buffy-Beschichtungsschnittstelle mit einer Transferpipette in ein neues Rohr.
- Setzen Sie das buffy Mantel in 30 - 40 ml eiskalten Puffer (PBS + 0,5% Rinderserumalbumin [BSA] + 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]) aus. Kombinieren Sie mit einer Pipette 20 l der Zellsuspension mit 20 l 0,4% Trypanblau und Pipette 10 l des Gemischs in die äußere Öffnung einer der beiden Kammern eines Zählschlittens und setzen Sie den Schlitten in einen automatisierten Zellzähler ein, um die Zellen zu zählen.
HINWEIS: Verwenden Sie eiskalten Puffer in allen Schritten, da es hilft, die Zellen lebensfähig zu halten. - Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g 10 min bei 4 °C und aspirieren Sie den Überstand sorgfältig an. Fügen Sie dann 300 L eiskalten Puffer hinzu.
- Fügen Sie 100 l menschliches Fc-Rezeptor-Blockierungsreagenz und 100 l monoklonale Maus anti-human CD34 Antikörper-konjugierte Mikroperlen für bis zu 1 x 108 Zellen hinzu (siehe Tabelle der Materialien). 30 min bei 4 °C inkubieren, 10 ml eiskalten Puffer zum Waschen der Zellen hinzufügen und bei 300 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
HINWEIS: Skalieren Sie diese nach der Zellenzahl, wenn mehr als 1 x 108 Zellen vorhanden sind. - Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, setzen Sie das Pellet in 500 l Puffer wieder auf und fahren Sie mit dem magnetischen Trennschritt fort, um HSPCs anzureichern.
- Platzieren Sie eine positive Auswahl-LS-Spalte (siehe Materialtabelle) in das magnetisch aktivierte Zellsortierfeld und übergeben Sie sie mit 3 ml Puffer.
- Laden Sie die Probe in die LS-Säule, die Mikroperlen, die an menschliche CD34+ gebunden sind, in Proben einfangen und unter dem Einfluss der Schwerkraft in das Sammelrohr fließen lassen kann.
- Waschen Sie die Säule 3x mit Puffer und sammeln Sie die Elute im selben Sammelrohr des CD34- Zellanteil.
- Tauchen Sie die Spalte mit 5 ml Puffer ein, um die CD34+ Zellen in ein neues Sammelrohr zu verwandeln. Wiederholen Sie den Vorgang, um eine Reinheit von >90% zu erreichen.
- Zählen Sie die eluierten CD34+ Zellen mit Trypan-Blaufarbstoff in einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie nach dem Zählen die CD34+ Zellen bei 300 x g für 5 min und entsorgen Sie den Überstand.
- Unterbrechen Sie die CD34+ Zellen in 25 l PBS für eine Injektion, die sofort bei der Transplantation verwendet werden soll, oder kryokonservieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 1-2 Mio. ml im Gefriermedium (Roswell Park Memorial Institute medium [RPMI 1640 medium] + 50% fetal Rinderserum (FBS) + 10% Dimethylsulfoxid [DMSO]) zur weiteren Anwendung bei der Transplantation.
HINWEIS: Erzählen Sie immer lebensfähige Zellen, bevor Sie sie bei der Transplantation verwenden. - Um die Reinheit des CD34+ elute zu überprüfen, nehmen Sie 50 l der Suspension und inkubieren Sie sie mit 10 l PE-konjugierten Anti-Human-CD34-Antikörpern für 30 min bei 4 °C. Waschen Sie die gefärbten Zellen nach der Antikörperinkubation mit PBS, setzen Sie sie in 100 L PBS wieder ab und führen Sie dann die Durchflusszytometrie durch. Fügen Sie ein zusätzliches Rohr von Zellen ohne Antikörper hinzu, um das Tor im Durchflusszytometer zu entwerfen.
- Analysieren Sie die Daten nach der Erfassung, indem Sie den Interessenbereich für ein Forward Scatter (FSC) und ein Side Scatter (SSC)-Diagramm auswählen, gefolgt von gating für einzelne Zellen auf FSC-Flächen und FSC-Höhendiagrammen. Gate CD34-positive Zellen auf einzelnen Zellen im PE-Kanal und SSC-Flächendiagramm.
2. Vorbereitung menschlicher Hepatozyten zur Transplantation
- Entfernen Sie die kryokonservierten Hepatozyten aus dem flüssigen Stickstoff, tauchen Sie die Durchstechflasche schnell in das Wasserbad und tauen Sie ca. 90 - 120 s auf.
- Entfernen Sie die Durchstechflasche und gießen Sie die aufgetauten Hepatozyten in das 50 ml konische Rohr des erwärmten Auftaumediums.
- Die Zellen aufhängen, indem Sie das 50 ml Rohr für ein paar Sekunden von Hand schaukeln.
HINWEIS: Wirbeln Sie das Rohr nicht. - Pellet die Zellen bei 100 x g für 8 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Pelletzellen in PBS mit 0,1% BSA und bündeln Sie sie entweder mit frischen oder aufgetauten HSPCs (Verhältnis 10:1) in PBS in einem Endvolumen von 80 l/Maus.
3. Tierhandhabung, Screening, Genotypisierung und Behandlung bei der Human-HSPC- und Hepatozytentransplantation
- Umgang mit Tieren
- Als Folge einer schweren Immunschwäche, Rasse, Haus, und behandeln TK-NOG Mäuse unter aseptischen Bedingungen.
- Tragen Sie immer einen Labormantel, Handschuhe, Schuhbezüge und eine Gesichtsmaske, um eine Infektion mit potenziell pathogenen Mikroorganismen zu verhindern.
- Verwenden Sie sterile Handschuhe und Instrumente für die Operation und behandeln Sie die Tiere während der gesamten Operation aseptisch.
- Auswahl von TK-NOG-Mäusen für das Experiment
- Erhalten Sie die TK-NOG-Stammkolonie, indem Sie weibliche TK-NOG-Mäuse mit männlichen Nicht-TK-NOG-Wurfgenossen züchten und transgene Nachkommen durch Genotypisierung auswählen.
HINWEIS: Führen Sie Genotypisierung (siehe Schritt 3.3) durch, um das Vorhandensein oder Fehlen des Transgens bei neugeborenen männlichen und weiblichen Mäusen zum Zeitpunkt der Entwöhnung zu bestimmen. - Wählen Sie Männchen im Alter von 6 - 8 Wochen für die Transplantation aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber der GCV-vermittelten Erschöpfung der HSV-TK Transgen-exekutionierenden Hepatozyten21.
- Ohr-Tag die Mäuse zum Zeitpunkt der Entwöhnung oder Operation, um die Identifizierung zu erleichtern. Beachten Sie das Gewicht und den Gesundheitszustand der Tiere.
- Erhalten Sie die TK-NOG-Stammkolonie, indem Sie weibliche TK-NOG-Mäuse mit männlichen Nicht-TK-NOG-Wurfgenossen züchten und transgene Nachkommen durch Genotypisierung auswählen.
- Genotypisierung für das Vorhandensein des HSV-TK-Transgens mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
- Führen Sie Genotypisierung zum Zeitpunkt der Entwöhnung (in der Regel im Alter von 3 - 4 Wochen). Für die Genotypisierung schneiden Sie ein Stück des Mausohrs in einem laminaren Fluss-Biologischen Sicherheitsschrank, um die Sterilität aufrechtzuerhalten und genomische DNA mithilfe eines genomischen DNA-Isolationskits zu extrahieren.
- Amplify genomische DNA aus Ohrstück in einem 20 L Reaktionsgemisch auf Bildschirm für HSV-TK-Transgen unter Kontrolle des menschlichen Albumin-Promoters durch Zugabe von 1 L Vordergrundgrund 5'-CCATGCACCTTTATCCTGG-3', 1 l Reverse Primer 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 FAM-Sonde 5-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3' und 10 L Master-Mix auf einem Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-Instrument (PCR)22.
- Stellen Sie die Echtzeit-PCR-Einstellungen wie folgt ein: 60 °C für 30 s (Vorlesestufe), 95 °C für 10 min (Haltestufe), 40 Zyklen von 95 °C für 15 s und 60 °C für 1 min (PCR-Stufe) und 60 °C für 30 s (Postread-Stufe).
HINWEIS: Ein Schwellenwertzyklus (Ct) unter 22 gilt als positiv für die HSV-TK-Transgene.
- Behandlung mit Ganciclovir und Treosulfan
- Mit 27 G-Nadel, injizieren Sie die TK-NOG-Mäuse mit intraperitonealen GCV-Injektionen (6 mg/kg) 2x pro Tag an Tag 7 und an Tag 5 in 100 l Saline vor der Operation, um die transgenen parenchymalen Zellen der Mäuse zu erschöpfen (wie in der experimentellen Strategie in Abbildung 2gezeigt)23 .
- An den Tagen 3, 2 und 1 vor der Operation Vorkonditionierende Mäuse mit nichtmyeloablativen intraperitonealen Dosen Treosulfan (1,5 g/kg/Tag) in 100 l Saline mit einer 27 G-Nadel.
- Einen Tag vor der Operation zwei bis drei Tropfen Blut aus der submandibulären Vene ziehen, indem Sie es mit einer 5 mm Lanze stechen, und isolieren Sie das Serum durch Zentrifugieren (1.500 x g für 10 min bei 4 °C) für den Alanin-Aminotransferase (ALT)-Assay zur Beurteilung des Degr Leberschäden.
- Vorbereitung auf die Operation
- Verwenden Sie Clipper, um das Fell der Maus um die Einschnittstelle (links der Peritonealwand) vor der Operation zu rasieren.
- Stellen Sie den Sauerstoffstrom auf 1 l/min und den Isofluran-Fluss mit einer Mausanästhesiemaschine auf 3% - 5% in einer Induktionskammer ein. Legen Sie eine Maus nach der anderen in die Induktionskammer für die Anästhesie.
- Befestigen Sie das eine Ende eines sterilen Verlängerungsrohres (mit einer Haltekapazität von 550 l Suspension; siehe Materialtabelle für Spezifikationen) an einer 30 G Nadel und das andere Ende an einer 1 ml Spritze.
- Füllen Sie die Spritze mit der Aufhängung (80 l/Maus) von gepoolten HEPs und HSPCs (siehe Abschnitt 2), passen Sie die Spritze in die Kerbe einer sich wiederholenden Dosierpipeette und stellen Sie den Spender so ein, dass er 10 l in jeder Presse ausgibt.
- Sobald die Mäuse anästhesiert sind (in der Regel nach 3 - 4 min), schalten Sie den Isofluran-Fluss auf den Nasenkegel und reduzieren Sie den Isofluran-Durchfluss auf 2% - 3%.
- Intrasplenische Transplantation menschlicher HSPCs und Hepatozyten bei Mäusen
- Führen Sie alle chirurgischen Schritte in einem laminaren Strömungsschrank unter sterilen Bedingungen durch.
- Legen Sie einen sauberen sterilen Vorhang über die Arbeitsfläche und schrubben Sie die linke Seite des Körpers jeder Maus mit 10 % Povidon-Jod gefolgt von 70 % Isopropylalkohol, bevor Sie einen Schnitt machen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (1 - 1,5 cm in der Länge und 5 mm tief) in der Haut, Muskel, und Peritoneum an der linken Seite der Peritonealwand mit Vanna Typ Schere, um die Peritonealhöhle etwa 5 mm unter dem unteren Rand des Rippenkäfigs zu betreten.
- Suchen Sie die Milz, ziehen Sie sie leicht mit Zangen in den Operationsbereich für einen einfachen Zugang, und setzen Sie die 30 G Nadel in den unteren Pol der Milz.
- Schalten Sie den Kolben der Dosierpipette frei und geben Sie 10 l des Volumens gleichzeitig mit einem Limit von 60 - 80 l pro Milz aus. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück und schneiden Sie die Milz mit Ligating-Clips mit einem Ligations-Applier.
- Schieben Sie die Milz zurück in die Körperhöhle mit baumwollgekippten Applikatoren, die mit sterilem PBS benetzt sind.
- Schließen Sie die Muskelschicht der Bauchwand mit einem resorbierbaren Naht unterbrochen Nahtmuster (nicht kontinuierlich). Erreichen Sie den Hautverschluss mit einem unterbrochenen Nahtmuster mit nicht resorbierbaren Nähten.
- Verwenden Sie warme Wasser zirkulierende Pads, um die Mäuse vor Unterkühlung nach der Operation zu schützen.
- Entfernen Sie nicht resorbierbare Nähte 10-14 Tage nach der Operation.
- Postoperative Pflege
- Wenn das transplantierte Tier weckt, injizieren Analgetika Buprenorphin (0,1 mg/kg) intraperitoneal, 2x pro Tag für aufeinander folgenden 3 Tage.
- Beobachten Sie die Tiere mindestens 1x pro Tag, bis sie zu normalen körperlichen Bedingungen zurückkehren.
HINWEIS: Überprüfen Sie das Körpergewicht jedes Tieres, da einige Mäuse nach der Postchirurgie abnehmen können. Mäuse gewinnen in der Regel ihr ursprüngliches Gewicht in 1 bis 2 Wochen zurück.
4. Transplantationsvalidierung der menschlichen Leber durch ELISA und das menschliche Immunsystem durch Durchflusszytometrie
HINWEIS: Bewerten Sie die Rekonstitution der menschlichen Leber und des Immunsystems monatlich, beginnend 1 Monat Nachtransplantation durch enzymgebundenen Immunsorbent Assay (ELISA) bzw. Durchflusszytometrie.
- Sammeln Sie Blutproben aus der submandibulären Vene mit Lanzen in EDTA-Röhrchen und Zentrifuge bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C. Isolieren Sie das Serum, um den menschlichen Albuminspiegel zu überprüfen, um die Transplantationseffizienz der Mausleber für transplantierte menschliche Hepatozyten zu bewerten, indem Sie ein menschliches Albumin-ELISA-Quantifizierungsset (siehe Tabelle der Materialien) verwenden, indem Sie dem Hersteller folgen Anweisungen.
HINWEIS: Entsorgen Sie das Pellet nicht und verwenden Sie die Pelletzellen nicht für eine Durchflusszytometrieanalyse, um die Rekonstitution des menschlichen Immunsystems zu bewerten. - Das Zellpellet ohne Serum in 35 l FACS-Puffer (PBS + 2% FBS) und mit 5 l mausspezifischem CD45 (Konzentration 0,5 mg/ml), 5 CD45 (0,1 mg/ml), CD3 (0,2 mg/ml), CD8 (0,1 mg/ml) und CD19 (0,5 mg/ml) und 20 l CD4 (0,25 mg/ml) und CD14 (0,25 mg/ml) jeweils 30 min bei 4 °C, um die Entwicklung eines funktionellen Immunsystems von CD34+ HSPCs zu überprüfen.
HINWEIS: Erwägen Sie, eine zusätzliche Röhre von ungefärbten Zellen hinzuzufügen, um das Gating der gefärbten Zellen zu bestimmen. - Nach der Inkubation die gebeizte Suspension (ca. 100 l) in ein Polystyrol-Rund-Boden-Flow-Zytometrierohr übertragen und 2 ml 1x Lysepuffer (siehe Materialtabelle)verwenden, indem 1 Teil des 10-fachen Lysepuffers mit 9 Teilen destilliertem Wasser verdünnt und 10 - 15 min, um rote Blutkörperchen zu lysieren.
HINWEIS: Beobachten Sie Trübung, um die Rote Blutzelllyse zu bewerten. Sobald die Probe klar wird, ist die Lyse abgeschlossen. - Nach der Lyse 3 ml des FACS-Puffers in das Rohr und Zentrifuge bei 300 x g bei 4 °C für 5 min geben, um ein Pellet zu erhalten. Wiederholen Sie die Wäsche, indem Sie dem Pellet und der Zentrifuge 3 ml FACS-Puffer bei 300 x g bei 4 °C für 5 min hinzufügen.
- Fixieren Sie die Zellen in frisch hergestelltem 1% Paraformaldehyd (PFA) und erfassen Sie gefärbte Zellen auf dem Durchflusszytometer, analysiert mit Strömungssoftware.
- Wählen Sie für die Analyse Lymphozyten auf einem FSC/SSC-Plot aus, gefolgt von einzelligen Gatings auf FSC-Fläche/FSC-Höhe.
- Darüber hinaus Gate für humanspezifische CD45 (hCD45) auf der einzelzelligen Population und enthalten mausspezifische CD45 (mCD45) für den Ausschluss von Zellen murinen Ursprungs. Strategisieren Sie die Färbung der gefärbten Population basierend auf dem Gating von ungefärbten Zellen.
- Gate hCD45+ Zellen zur Bestimmung der Frequenz von CD3+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen. Gate-T-Zellen, um CD4- und CD8-Teilmengen zu bestimmen. Um Monozyten auszuwerten, gate auf hCD45, um CD14+ Monozyten zu bestimmen.
5. HIV-Infektion von TK-NOG-Mäusen und ihre Auswirkungen auf die menschliche Leber und das Immunsystem
- Behandeln Sie das HIV-1-Virus und alle infizierten Mäuse in einer ausgewiesenen Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2.
ACHTUNG: Autoklav und entsorgen Sie alle HIV-infizierten Abfälle in doppelten Biohazard-Beuteln. Tragen Sie aus Sicherheitsgründen schnittfeste Handschuhe, während Sie HIV-infizierte Mäuse abgeben. - Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich eines Einweg-Coverall-Kleid, Schuhbezüge, eine Gesichtsmaske und Doppelhandschuhe zu jeder Zeit während der Arbeit mit dem Virus.
- Wählen Sie Mäuse mit einer Rekonstitution von mehr als 15% der menschlichen CD45+ Zellen (getestet in Schritt 4.7) und mit einer Anwesenheit von menschlichem Albumin im Serum für HIV-1-Infektion (getestet in Schritt 4.1).
- Injizieren Sie die Mäuse mit 1 x 103 bis 1 x 104 Gewebekultur infektiösen Dosen 50 (TCID50) HIV-1ADA in einem Volumen von 100 - 200 l pro Maus, intraperitoneal.
- Euthanisieren Sie die HIV-infizierten Mäuse 5 Wochen nach der Infektion mit Isofluran (mit einer Isofluran-Dampfkonzentration von >5%).
- Nach der Einschläferung der Mäuse, sammeln Sie Blut in EDTA-Röhren durch eine Herzpunktion für die Isolierung von Serum, um die Wirkung von HIV-1 auf die Leber zu sehen, indem Sie die humanspezifischen Albuminspiegel von ELISA (siehe Schritt 4.1) und Blutzellen bewerten, um Veränderungen des menschlichen Immunsystems zu überprüfen Zellen mit Durchflusszytometrie (siehe Schritte 4.2 - 4.8).
HINWEIS: Bewerten Sie die periphere Viruslast 5 Wochen nach der Infektion auf einem Bioanalyzer, um zu bestätigen, ob die Mäuse infiziert sind. - Nach dem Ziehen von Blut, verbrauchen Sie die Leber von den eingeschläferten Mäusen.
- Für die Leberexzision, setzen Sie die Bauchhöhle durch einen Schnitt von 1,5 - 2 cm lang und 0,5 cm tief in der Haut, Muskeln, und Peritoneum, aus dem Xyphoi. Machen Sie einen Schnitt senkrecht zur Wirbelsäule zwischen der Leber und der Membran. Heben Sie die Leber und trennen Sie alle Membranen, die sie an Magen und Darm anheften.
- Sammeln und fixieren Sie die Leber in 4% Paraformaldehyd über Nacht und folgen Sie einem Standard-Immunhistochemischen Protokoll, um die Wirkung von HIV auf CK18+ Hepatozyten mit humanspezifischem CK18-Antikörper8zu bewerten.
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Representative Results
Die Etablierung eines dualen humanisierten Mausmodells mit menschlichen Leber- und Immunzellen kann bei jedem Schritt mit sehr einfacher ELISA bzw. Durchflusszytometrie leicht überwacht werden. Die Durchflusszytometrie wird regelmäßig durchgeführt, um die Entwicklung eines funktionellen Immunsystems zu bewerten und die Wirkung einer HIV-Infektion auf Immunzellen zu sehen. Bei dual humanisierten Mäusen kann die Entwicklung funktioneller Immunzellen zwischen 15% und 90% des Lymphozytentors liegen. Repräsentative Teilmengen von Immunzellen werden in Punktdiagrammen dargestellt (Abbildung 3). Für die Bewertung der Transplantation menschlicher Hepatozyten wird ELISA für humanspezifische Albuminspiegel monatlich auf Mausserum durchgeführt. Mäuse, die sowohl mit HSPCs als auch mit HEPs eingerückt sind, zeigen humanspezifische Albumin-Spiegel von 7 g/ml bis 377 g/ml in einem Monat und wachsen während der Beobachtungszeit (6 Monate) weiter (Abbildung 4). Die Wirkung einer HIV-Infektion auf menschliche Immunzellen im Blut von dual enhumanisierten Mäusen wird durch Durchflusszytometrie und auf HEPs in der Leber durch das humanspezifische Albumin ELISA überwacht. Um 5 Wochen verursacht HIV-1 einen Rückgang des menschlichen Albuminspiegels im Serum, wie von ELISA bewertet, und es gibt eine Erschöpfung der menschlichen CK18+ Hepatozyten in den Leberabschnitten von dual humanisierten Mäusen, wie durch Immunhistochemie bewertet (Abbildung 5). Ein niedrigeres Verhältnis von CD4:CD8 wird in der Regel durch Durchflusszytometrie im Blut und in der Leber von HIV-infizierten Mäusen beobachtet, verglichen mit Den Werten, die in der gleichen Maus vor der Infektion festgestellt wurden (Abbildung 6). Alle für das Protokoll wichtigen Reagenzien und Materialien werden im Materialverzeichniserläutert.
Abbildung 1 : Schemat der Anreicherung von CD34+ Zellen aus Nabelschnurblut. (A) Schnurblut wird auf Lymphozyten Trennmedium (LSM) und zentrifugiert, um buffy Mantel zu isolieren. (B) LS-Säulen werden auf einem magnetischen Ständer platziert und mit BSA-Puffer gespült, gefolgt von Buffy-Coat. Zellen, die für CD34 positiv sind, sind in den Spalten gefangen, und CD34- Zellen werden in separaten Röhren eluiert. Gefangene CD34+ Zellen in Säulenharzen werden mit einem Kolben getaucht, und die Zellen werden in einem neuen Rohr gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Schematische Sicht des experimentellen Designs für die doppelte Rekonstitution von humanisierten Leber- und Immunsystemmäusen, gefolgt von einer HIV-1-Infektion. TK-NOG-Mäuse werden mit Ganciclovir (GCV) in einer Dosis von 6 mg/kg, 2x pro Tag, am Tag -7 und Tag -5 injiziert, gefolgt von einer Treosulfan-Injektion an Tagen -3, -2 und -1. Um die Mäuse auf die Transplantation (Tx) zu untersuchen, wird einen Tag vor der Operation ein Alanin-Aminotransferase (ALT)-Test durchgeführt, und Mäuse mit ALT-Werten von >200 und <600 U/L werden ausgewählt. Nach der Transplantation werden die Mäuse auf eine Rekonstitution des menschlichen Immunsystems durch Durchflusszytometrie (FACS) und auf Leberrekonstitution durch Bewertung ihres Albuminspiegels mit ELISA überprüft. Die Mäuse sind mit HIV-1 infiziert, 5 Wochen bevor sie geopfert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Flow Cytometry Analyse Gating Strategie für die menschliche Zellverteilung von Blut. (A) Zunächst werden Lymphozyten auf Vollblut basierend auf FSC-A und SSC-A abgezäut. (B) Einzelne Zellen sind auf Lymphozyten abgesperrt. (C) Menschliche CD45+ Leukozyten werden auf einzelnen Zellen mit Maus-CD45 und humancd45 abgezäut. (D) CD3+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen sind auf geschlossenen CD45+ menschlichen Leukozyten identifiziert. (E) CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxische T-Zellen werden in geschlossenen CD3+ T-Zellen identifiziert. (F) CD14+ Monozyten sind von menschlichen CD45+ Leukozyten abgegrenzt. Die hier dargestellten Ergebnisse stammen von einer Maus, die mit zwei menschlichen Hepatozyten und HSPCs transplantiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Die Albuminkonzentration wird per ELISA im Serum von dual humanisierten Mäusen gemessen. Die Mäuse werden mit beiden humanen Hepatozyten (HEPs) und CD34+ hämatopoetischen Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs) transplantiert (n = 11). Serum wird zu unterschiedlichen Zeiten bei 1, 4 und 6 Monaten nach der Transplantation gesammelt, und Verdünnungen werden vorgenommen, um die unbekannten Probenkonzentrationen im Bereich der Standards anzupassen. Jedes Symbol stellt einen individuellen Mauswert dar. Die Ergebnisse stellen sowohl den Median als auch einzelne Werte dar. * P < 0,05, durch einwegs ANOVA. Diese Zahl wurde von Dagur et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Auswirkungen auf HIV-1 auf den Albuminspiegel im Serum und die Erschöpfung von CK18+ humanen Hepatozyten in der Leber von dual humanisierten Mäusen. (A) Albuminkonzentrationen werden bei nicht infizierten Mäusen(n = 9) überwacht, die mit menschlichen HEPs und HSPCs nach 1 und 4 Monaten transplantiert werden. Die Mäuse sind mit HIV infiziert (n = 10) nach 4 - 5 Monaten nach der Transplantation und geopfert 5 Wochen Nachinfektion. Jedes Symbol stellt einen individuellen Mauswert dar. Die Ergebnisse stellen sowohl den Median als auch einzelne Werte dar. * P < 0,05, durch einwegs ANOVA. Diese Zahl wurde von Dagur et al.geändert. 8. (B) Fünfmikrometer Leberabschnitte von nicht infizierten (HEPs + HSPCs, linkes Panel) und HIV-infizierten TK-NOG-Mäusen (HEPs + HSPCs + HIV, rechtes Panel) sind fixiert, paraffineingebettet und für antihumanes Cytokeratin-18 (CK18) Antikörper gefärbt. HIV-1 verursacht eine Erschöpfung von CK18+ Hepatozyten wird durch einen weniger besetzten Bereich durch die CK18+ menschlichen Zellen belegt. Die hier dargestellten Ergebnisse stammen von einer nicht infizierten und einer HIV-infizierten Maus, die mit zwei menschlichen Hepatozyten und HSPCs transplantiert wurde. Skalenstäbe = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 : Verhältnis von CD4+ Zellen zu CD8+ T-Zellen im peripheren Blut und in der Leber von doppelt rekonstituierten nicht infizierten und HIV-1-infizierten Mäusen. Für doppelt rekonstituierte nicht infizierte Mäuse: geschlossener Kreis; HEP + HSPCs; Blut n = 7; Leber n = 6. Für HIV-1-infizierte Mäuse: offene Kreise; HEPs + HSPCs + HIV; Blut n = 10; Leber n = 11. Die Ergebnisse stellen sowohl den Median als auch einzelne Werte dar. * P < 0,05, durch einseitigen ANOVA-Test zwischen HIV-infizierten und nicht infizierten Mäusen. Diese Zahl wurde von Dagur et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Leber ist bei HIV-infizierten Patienten kompromittiert und geschädigt24. Experimentelle Kleintiermodelle zur Untersuchung menschlicher Lebererkrankungen in Gegenwart von HIV-1 sind extrem begrenzt, trotz der Verfügbarkeit einiger kotransplantierter Tiermodelle mit CD34+ HSPCs und Hepatozyten7,12, 25. In In-vitro-Experimenten haben Hepatozyten nachweislich eine HIV-1-Infektion auf niedrigem Niveau26. Humanisierte Mäuse, die beide Arten menschlicher Zellen tragen, sind ein wünschenswertes Modell. Die Leber von Mäusen, die nur mit dem menschlichen Immunsystem rekonstituiert wurden, hat sich gezeigt, dass sie unter der experimentellen Erschöpfung der menschlichen regulatorischen T-Zellen20,27von einer HIV-Infektion betroffen ist. Der Unterschied in den Immun- und Funktionseigenschaften von Maus und menschlichen Hepatozyten kann jedoch die Unterschiede in ihren Reaktionen auf HIV-1 und Immunzellen unterstreichen. In dieser Überprüfung wird ein Protokoll beschrieben, um sowohl das menschliche Immunsystem als auch die Leber zu rekonstituieren und die HIV-1-assoziierte Leberimmunpathologie anzugehen, wie bei HIV-1-infizierten Patienten beobachtet. TK-NOG-Männchenmäuse wurden aufgrund ihrer leberselektiven hohen mRNA-Expression von HSV-TK-Transgen und der Anfälligkeit der GCV-Toxizität für die transgene Leber der Mausausgewählt 21. Darüber hinaus können sie nach der Transplantation ohne den Einsatz exogener Medikamente für längere Zeit aufrechterhalten werden und entwickeln keine spontanen systemischen Erkrankungen28. Um das menschliche Immunsystem und die Rekonstitution der Leber zu etablieren, sind eine Ablation des Immunsystems der Maus und eine Schädigung mausspezifischer Leberzellen erforderlich und werden mit nichtmyeloablativen Dosen von Treosulfan und GCV erreicht, wie zuvor bei TK-NOG-Männchen 13 gezeigt. ,23. Mäuse werden im Alter von 6 - 8 Wochen mit GCV und Treosulfan injiziert, da die Expression von transgenen und GCV-induzierten Leberverletzungen, die durch ALT-Spiegel beurteilt werden, optimal ist, um Nischen-zu-transplantierte menschliche Zellenbereitzustellen 21. Mäuse mit ALT-Werten von >200 U/L, aber <600 U/L werden in der Regel für die Transplantation ausgewählt. Mäuse mit ALT-Werten von >600 U/L haben ein höheres Sterberisiko, da menschliche Hepatozyten nicht in der Lage sind, die beschädigte Mausleberfunktion zu retten.
Derzeit wird die doppelte Humanisierung durch die Transplantation von humanen CD34+ HSPCs und fetalen Leberzellen gezeigt; die Manipulation von Neugeborenen schafft jedoch technische Probleme13,14. HSPCs können aus mehreren Quellen abgeleitet oder isoliert werden, z. B. fetale Leberzellen (FLCs), embryonale Stammzellen (ESCs) und CB. Allerdings schränken ethische Fragen die Verwendung von ESCs und FLCs ein. CB hat keine solche Einschränkung und ist eine äußerst nützliche Alternative, um HSPCs zu erhalten, sowie eine wertvolle Quelle von primitiven hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen, die das funktionelle Immunsystem rekonstituieren können. system. Schnurblut sollte nicht älter als ein Tag sein, wenn hSPCs isoliert werden, da die Ausbeute von HSPCs stark vom Alter beeinflusst wird. Die Reinheit der isolierten HSPCs muss überprüft werden, bevor die Zellen kryoerhalten werden. Die Kreuzkontamination von CD3+ T-Zellen wird vermieden, da sie zu systemischer Maustransplantat-versus-host-Krankheit und akuter Allorejection von HEPs bei der Transplantation mit nicht übereinstimmenden Zellen führen kann.
Kommerziell erhältliche Hepatozyten wurden als Quelle für die RekonstitutionderLeber 8,13verwendet. Erwachsene Hepatozyten werden bevorzugt für die Etablierung der Leberrekonstitution aufgrund ihrer erhöhten Effizienz in der Engraftment und Nachhaltigkeit für einen langen Zeitraum29.
Das Vorhandensein des menschlichen Immunsystems in einem Mausmodell erhöhte den ALB-Spiegel, wie zuvorgezeigt 30,31. Die Effizienz von Hepatozyten und die Rekonstitution des Immunsystems kann jedoch je nach Quelle der Spenderzellen variieren und von der Empfängermaus abhängen. Daher muss jede Maus auf die Transplantation untersucht werden, und der kritischste Teil besteht darin, die Antikörper oder Reagenzzunutzungen zu nutzen, die menschenspezifisch sind und nicht mit Mauszellen kreuzreagieren. Die humanspezifischen Reagenzien und Antikörper, die in der hier vorgestellten Studie verwendet werden, sind in der Tabelle der Materialiendetailliert aufgeführt. Wenn für die Studie andere als in der Materialtabelle vorgesehene Antikörper verwendet werden, achten Sie darauf, die menschliche Spezifität zu überprüfen.
Der optimale Zustand wäre die Transplantation von syngenischen Zellen; dies ist jedoch technisch schwierig zu erreichen. Wo immer möglich, sollten HSPCs und Hepatozyten von Spendern mit teilweise abgestimmten humanen Leukozyten-Klasse-1-Antigenen (wie HLA-A2) gepoolt werden.
Um Mäuse auf HIV-Studien zu untersuchen, wird Blut an mehreren Zeitpunkten entnommen, um die optimale Immun- und Leberrekonstitution zu bestimmen; Durchflusszytometrie und ELISA werden bevorzugt, da sie mit nur wenig Blut durchgeführt werden können. Blutzellen und Serum aus derselben Probe könnten für die Durchflusszytometrie bzw. ELISA verwendet werden. Es ist wichtig, an jedem Zeitpunkt (1.000 - 40.000 Bereich) richtige Verdünnungen von Serum herzustellen, um ALB-Werte zu bewerten, damit die unbekannten Konzentrationen in den Bereich der Standardkonzentrationen gebracht werden können (Kit-Bereich: 6,25 - 400 ng/ml).
Proinflammatorische Zytokine als Reaktion auf eine HIV-1-Infektion in Gegenwart des menschlichen Immunsystems können auch bei der Interaktion von Hepatozyten und Immunzellen nützlich sein. Das Modell ist nützlich für die Darstellung der Immunopathogenese von HIV-1-induzierten Lebererkrankungen, da es Leberschäden auf die gleiche Weise wie beim Menschen rekapituliert, was durch ein niedriges Verhältnis von CD4:CD8, eine Abnahme des ALB-Spiegels, den Tod von Humanhepatozyten und das Immunsystem der Leber belegt wird. Aktivierung. Das Modell hat auch einige Einschränkungen, wie eine niedrige Cytotoxische T-Zellen-Aktivität und beeinträchtigte Immunglobulin-Klasse-Switching. Aufgrund der Anwesenheit des menschlichen Immunsystems und der Leber ist das hier vorgestellte Modell vielversprechend für Studi-Koinfektionen von HIV-1- und Hepatitis-Viren, chronische Hepatitis-Infektionen (zur Klärung der Mechanismen der Anti-Hepatitis-Immunantwort) und als Zirrhose modell.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grant R24OD018546 (an L.Y.P. und S.G.) unterstützt. Die Autoren danken Weizhe Li, Ph.D., für die Hilfe bei chirurgischen Eingriffen, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng für Immunhistologie, UNMC Flow Cytometry Forschungseinrichtung Mitglieder Direktor Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., und Samantha Wall, B.S., UNMC Advanced Microscopy Core Facility Mitglieder Janice A. Taylor, B.S., und James R. Talaska, B.S., für den technischen Support. Die Autoren würdigen Drs. Mamoru Ito und Hiroshi Suemizu von CIEA für die Bereitstellung von TK-NOG-Mäusen und Dr. Joachim Baumgart für die Bereitstellung von Treosulfan. Die Autoren danken Dr. Adrian Koesters, UNMC, für ihren redaktionellen Beitrag zum Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30 G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 mm x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
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