प्लेटलेट आधारित वीएएसपी फास्फारिलीकरण को मापने के द्वारा रक्त में नाइट्रिक ऑक्साइड का पता लगाने
Summary
यहां, हम रक्त में एक अति संवेदनशील नाइट्रिक ऑक्साइड संवेदक के रूप में प्लेटलेट्स के संभावित उपयोग को संबोधित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह प्रारंभिक प्लेटलेट तैयारी और नाइट्रिक ऑक्साइड जनरेटर के रूप में नाइट्राइट और deoxygenated लाल रक्त कोशिकाओं के उपयोग का वर्णन है ।
Abstract
प्लेटलेट्स उचित रक्त के थक्के के लिए जिंमेदार रक्त अवयव हैं । उनके समारोह में अत्यधिक विभिन्न मार्ग द्वारा विनियमित है । सबसे शक्तिशाली vasoactive एजेंटों में से एक, नाइट्रिक ऑक्साइड (सं), भी प्लेटलेट एकत्रीकरण के एक शक्तिशाली अवरोधक के रूप में कार्य कर सकते हैं । प्रत्यक्ष रक्त में कोई पता लगाने बहुत सेल मुक्त हीमोग्लोबिन कि सीमा नहीं आधा जीवन मिलीसेकंड रेंज के साथ अपनी उच्च जेट के कारण चुनौतीपूर्ण है । वर्तमान में, हस्तक्षेप के बाद कोई परिवर्तन केवल नाइट्राइट और नाइट्रेट (नाइट्रेट के सदस्यों-नाइट्राइट-कोई चयापचय मार्ग) के मापा परिवर्तन के आधार पर अनुमान कर रहे हैं । लेकिन सटीक, इन माप बल्कि तुलना में एक तुलना वास्तविक कोई परिवर्तन की व्याख्या करने के लिए मुश्किल हैं, स्वाभाविक रूप से उच्च आधारभूत नाइट्राइट और नाइट्रेट के स्तर के कारण है कि परिमाण के कई आदेश नहीं खुद की उंमीद परिवर्तन से अधिक कर रहे हैं । इसलिए, प्रत्यक्ष और सरल तरीकों कि एक का पता लगाने के लिए कोई सीधे की अनुमति होगी के विकास के लंबे समय से अपेक्षित है । यह प्रोटोकॉल रक्त में अत्यधिक संवेदनशील कोई संवेदक के रूप में प्लेटलेट्स के संभावित उपयोग को संबोधित करता है । यह प्रारंभिक प्लेटलेट रिच प्लाज्मा (पीआरपी) और धोया प्लेटलेट की तैयारी का वर्णन करता है और कोई जनरेटर के रूप में नाइट्राइट और deoxygenated लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग करें । फास्फारिलीकरण में वीएएसपी की serine २३९ (पी-वीएएसपीSer239) की उपस्थिति का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । तथ्य यह है कि वीएएसपी प्रोटीन अत्यधिक प्लेटलेट्स में व्यक्त की है और है कि यह तेजी से phosphorylated है जब कोई मौजूद है इस मार्ग का उपयोग करने के लिए सीधे रक्त में कोई उपस्थिति का पता लगाने के लिए एक अनूठा अवसर की ओर जाता है ।
Introduction
प्लेटलेट्स megakaryocytes से व्युत्पन्न छोटे डिस्क के आकार के कोशिका के टुकड़े होते हैं जो रक्त के थक्के के लिए महत्वपूर्ण होते हैं । थक्के झरना विभिन्न (जैसे कोलेजन या ADP के रूप में) सक्रिय अणुओं, संवहनी दीवार की चोट के बाद जारी द्वारा शुरू की है । नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) द्वारा विभिन्न प्रभावों के बीच रक्त के थक्के प्रक्रिया को संशोधित किया जा सकता है । नहीं, स्वाभाविक रूप से स्तनधारी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित, सबसे बहुमुखी शारीरिक संकेतों में से एक है । यह एक शक्तिशाली vasodilator, न्यूरोट्रांसमीटर और प्रतिरक्षा संग्राहक के रूप में कार्य करता है, इसके कई कार्यों के कुछ नाम है । खून में, कोई भी प्लेटलेट एकत्रीकरण बाधा द्वारा रक्त के थक्के की सीमा को विनियमित करने में मदद करता है. खून में नहीं की सबसे अधिक संभावना स्रोतों में से एक नाइट्राइट, एक अकार्बनिक आयन है कि नहीं के एक अग्रदूत के रूप में सेवा दिखाया गया है । लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) के साथ प्रतिक्रिया, नाइट्राइट नहीं करने के लिए कम है और deoxyHb methemoglobin (metHb)1के लिए ऑक्सीकरण हो जाता है । कोई RBCs से जारी vasoactive है और2vasorelaxation कारणों । इस नाइट्राइट कमी मार्ग एक वैकल्पिक कोई पीढ़ी मार्ग, के साथ अभिनय और hypoxic शर्तों पर endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस द्वारा शास्त्रीय कोई पीढ़ी पथ पूरक है ।
प्लेटलेट्स अपने आप में नाइट्राइट कम नहीं कर पा रहे हैं, लेकिन अपनी उपस्थिति के प्रति बहुत संवेदनशील हैं । बरकरार प्लेटलेट्स में, नहीं nanomolar रेंज में cGMP बढ़ जाती है (चुनाव आयोग५० = 10 एनएम) और वीएएसपी के फास्फारिलीकरण (ईसी५० = ०.५ एनएम)3। इसलिए, प्लेटलेट्स RBCs और रक्त में कोई रिलीज द्वारा नाइट्राइट कमी के एक उत्कृष्ट संवेदक के रूप में सेवा कर सकते हैं । वहां कई तरीके है कि सीधे प्लेटलेट सक्रियकरण की हद तक उपाय कर सकते है-जैसे aggregometry और thromboelastography (TEG)4,5। हालांकि, इन तरीकों महंगा विशेष उपकरण और सामग्री की जगह बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । यह भी घटनाओं बहाव पर नजर रखने के लिए संभव है, के बाद कोई RBCs से जारी है, प्लेटलेट की सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का उपयोग कर-जैसे पी-selectin6। कोई भी प्लेटलेट्स7में cGMP की मात्रा बढ़ाने के लिए जाना जाता है । पहले, हम deoxygenated आरबीसी8द्वारा नाइट्राइट कमी के बाद रक्त में कोई रिलीज की निगरानी करने के लिए cGMP का इस्तेमाल किया । यह एक बहुत ही संवेदनशील पद्धति साबित हुई; हालांकि, cGMP एक लघु अणु रहता है और इसका पता लगाने के व्यापक परिश्रम शामिल है । एक और संभावना है, प्रस्तुत प्रोटोकॉल में वर्णित है, vasodilator के फास्फारिलीकरण-उत्तेजित phospho (वीएएसपी) का उपयोग करता है-प्रोटीन रक्त में नहीं की उपस्थिति का पता लगाने के लिए । वीएएसपी प्रोटीन कळेनासे जी सक्रियण, जो sGC/cGMP मार्ग9के माध्यम से नहीं के साथ बातचीत पर phosphorylated है की एक सब्सट्रेट है । detectable वीएएसपी फास्फारिलीकरण बहुत कम नहीं सांद्रता पर होता है, जो प्लेटलेट्स रक्त में कोई उपस्थिति की एक बहुत ही संवेदनशील डिटेक्टर बना सकता है । वीएएसपी प्लेटलेट्स में अत्यधिक व्यक्त की है, लेकिन अन्य रक्त कोशिकाओं में नहीं है, जो चुनिंदा प्लेटलेट्स10शामिल घटनाओं का पालन करने की अनुमति देता है.
इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य वीएएसपी फास्फारिलीकरण11,12की निगरानी के द्वारा प्लेटलेट्स के साथ अपनी बातचीत का उपयोग कर पूरे रक्त में कोई रिलीज का पता लगाने के लिए विस्तार से विधि का वर्णन है । वर्णित विधि कम नहीं सांद्रता का जल्दी पता लगाने की अनुमति देता है-सैद्धांतिक रूप से nanomolar रेंज में जो वर्तमान प्रोटोकॉल cGMP निर्धारण से अधिक संवेदनशील बनाता है, मानक पश्चिमी दाग सबसे प्रयोगशाला में प्राप्त तकनीक के उपयोग की वजह से सेटिंग्स.
Protocol
Representative Results
Discussion
चूंकि प्लेटलेट्स आसानी से सक्रिय हो जाते हैं, प्लेटलेट युक्त नमूनों की कोमल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है । तेज pipetting और जोरदार झटकों से बचना चाहिए । प्लेटलेट अवरोधकों जैसे prostacyclin (पीजीआई2) प्लेटलेट सक्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम डॉ एलन एन Schechter को NIH अंदर अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
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