VASP 인 산화를 측정 하 여 혈액에 산화 질소의 혈소판 기반 탐지
Summary
여기, 우리 혈액에 산화 질소 매우 민감한 센서로 혈소판의 잠재적인 사용을 해결 하기 위해 프로토콜을 제시. 그것은 산화 질소 생성기로 초기 혈소판 준비 및 아 질산염 및 deoxygenated 붉은 혈액 세포를 사용 하 여 설명합니다.
Abstract
혈소판은 혈액 구성 요소를 적절 한 혈액 응고에 대 한 책임. 그들의 기능은 매우 다양 한 경로 의해 통제 된다. 하나는 가장 강력한 vasoactive 에이전트, 산화 질소 (NO), 또한 혈소판의 강력한 억제제로 작동할 수 있다. 직접 혈액에서 감지 되지 않습니다 아무 반감기 밀리초 범위를 제한 하는 셀 무료 헤모글로빈으로 그것의 높은 반응성 때문에 매우 도전 이다. 현재, 변경 개입 추정만 후 아 질산염과 질산염 (질 산-아 질산염-아니 신진 대사 통로의 구성원)의 측정된 변화 기반. 그러나 정확한이 측정은 해석 대 실제 변경, 때문에 자연스럽 게 높은 기준선 아 질산염 및 질 산 몇 배나 더 자체의 변화를 예상된 보다 높은 수준에 오히려 어렵다. 따라서, 아니오를 직접 검출 할 수 것이 직접적이 고 간단한 방법의 개발은 오래전. 이 프로토콜 주소 혈액에 아무 센서로 매우 민감한 혈소판의 잠재적인 사용 합니다. 그것은 아무 생성기로 초기 혈소판 풍부 혈장 (PRP)와 씻어 혈소판 준비 및 아 질산염 및 deoxygenated 붉은 혈액 세포를 사용 하 여 설명합니다. VASP의 인 산화는 떠들고 239 (P-VASPSer239)에서 번호의 존재를 감지 하는 사실 VASP 단백질 높은 혈소판 표현 된 존재 하는 때 아니 그것 빠르게 phosphorylated이 통로 사용 하 여 직접 혈액에 아무 존재를 감지 하는 독특한 기회에 지도 한다.
Introduction
혈소판은 혈액 응고에 대 한 중요 한 없으며에서 파생 된 작은 디스크 모양의 세포 조각. 응고 폭포는 혈관 벽의 부상 이후에 출시 된 (콜라겐 또는 ADP) 등 다양 한 생리 활성 분자에 의해 시작 됩니다. 혈액 응고 과정 중 산화 질소 (NO)에 의해 다양 한 이펙터, 수정할 수 있습니다. 아니, 자연스럽 게 포유류 세포에 의해 생산, 가장 다재 다능 한 생리 신호 중 하나입니다. 그것은 강력한 vasodilator, 신경 전달 물질 및 많은 기능 몇 가지 이름을 면역 변조기 역할. 혈 류에서 더 또한 혈소판을 억제 함으로써 혈액 응고의 정도 조절 하기 위해 도움이 됩니다. 혈 류에서의 가장 가능성이 소스 중 하나입니다 아 질산염, 무기 이온의 선구자 역할을 표시 되었습니다. 적혈구 (Rbc)와 반응, 아 질산염 NO로 감소 되 고 deoxyHb 산화 methemoglobin (metHb)1. Rbc에서 발표 없음 vasoactive 이며 원인 vasorelaxation2. 이 아 질산염 감소 통로 이며 대체 아무 세대 통로와 함께 행동 내 피 산화 질소 synthase hypoxic 조건에 의해 생성 경로가 고아 한 보완.
스스로 혈소판 없음에 아 질산염을 줄일 수 있지만 그것의 존재에 매우 민감합니다. 그대로 혈소판에서 더는 nanomolar 범위 증가 cGMP (EC50 = 10 nM)와 VASP의 인 산화 (EC50 = 0.5 nM)3. 따라서, 혈소판 Rbc와 혈액으로 없음 릴리스 아 질산염 감소의 우수한 센서 역할을 수 있습니다. 직접 혈소판 활성화-aggregometry 및 thromboelastography (TEG) 등의 정도 측정할 수 있는 여러 방법이 있다4,5. 그러나, 이러한 방법은 고가의 전문된 계측 및 오히려 많은 양의 자료 필요합니다. 그것은 또한 이벤트를 모니터링할 수 다운스트림, 아니 후 출시 Rbc, 혈소판 표면 단백질 표정-P selectin6등의 변화를 사용 하 여에서. 아니 혈소판7에서 cGMP의 양을 증가 알려져 있다. 이전에 우리는 deoxygenated RBC8아 질산염 감소 후 혈액으로 없음 릴리스를 모니터링 하려면 cGMP를 사용. 이 매우 민감한 방법; 판명 그러나, cGMP 짧은 분자 이며 그 탐지 포함 광범위 한 노동. 제시 프로토콜에서 설명 하는 또 다른 가능성, vasodilator 자극 인 (VASP)의 인 산화를 사용 하 여-단백질 혈액에의 존재를 감지. VASP은 sGC/cGMP 통로9없이 상호 작용에 phosphorylated 단백질 키 니 아 제 G 활성화의 기판입니다. 매우 낮은 전혀 감지 VASP 인 산화 발생 농도, 혈액에서 혈소판 없음 존재의 매우 민감한 검출기 만들 수 있는. VASP는 높은 혈소판, 표현 하지만 하지 다른 혈액 세포에서는 선택적으로 혈소판10를 포함 하는 이벤트에 따라 있습니다.
이 프로토콜의 주요 목표는 VASP 인 산화11,12를 모니터링 하 여 혈소판와의 상호 작용을 사용 하 여 전체 혈액에 없는 자료의 검색에 대 한 세부 사항에 있는 메서드를 설명 하는. 설명된 메서드를 수 있습니다 낮은의 조기 발견 아무 농도를-이론적으로 현재 프로토콜 기술의 표준 서쪽 오 점 달성 대부분 실험실에서 사용 cGMP 결정 보다 더 민감한 nanomolar 범위에 설정.
Protocol
Representative Results
Discussion
혈소판은 쉽게 활성화 하 고, 이후 부드러운 처리 포함 하는 혈소판의 샘플은 필요. 빠른 pipetting 및 활기찬 동요는 피해 야 한다. Prostacyclin (PGI2) 같은 혈소판 억제제는 혈소판 활성화;을 방지 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나,이 혈소판 내의 일부 신호 경로 영향을 수 있습니다. 혈소판 펠 릿의 준비에 대 한 우리 혈소판 정지에 ACD를 추가 하 고 낮은 속도 원심 분리를 사용 하 여.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 교내 그랜트 박사 앨런 북 아 Schechter에 의해 투자 되었다.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
References
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