Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

الكشف على أساس الصفائح الدموية من أكسيد النيتريك في الدم عن طريق قياس الفسفرة بسب

doi: 10.3791/58647 Published: January 7, 2019

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول لمعالجة الاستخدام المحتمل للصفائح الدموية كجهاز استشعار حساسة للغاية من أكسيد النيتريك في الدم. ويصف إعداد الصفائح الدموية الأولية واستخدام النيتريت وخلايا الدم الحمراء deoxygenated كمولدات أكسيد النيتريك.

Abstract

الصفائح الدموية هي مكونات الدم المسؤولة عن تخثر الدم السليم. وينظم وظيفتها عالية مسارات مختلفة. واحد من أقوى وكلاء فعال في الأوعية، أكسيد النيتريك (لا)، يمكن أن تعمل أيضا كمثبط قوي لتجميع الصفائح الدموية. مباشرة لا الكشف في الدم صعبة للغاية نتيجة لها مفاعليه عال مع الهيموغلوبين الخلية الحرة التي تحد من لا فترة نصف العمر للنطاق ميلي ثانية. حاليا، أي تغييرات بعد تدخلات وتقدر فقط استناداً إلى التغييرات المقاسة والنتريت والنترات (أعضاء المسار الأيضي النترات والنتريت-لا). دقيقة، هذه القياسات يتم بدلاً من ذلك من الصعب تفسير لا تغييرات، بسبب نتريت الأساس الطبيعي عالية مقارنة النسبة الفعلية والنترات مستويات عدة أوامر من حجم أكبر من التغيرات المتوقعة ليس في حد ذاته. ولذلك، تطوير أساليب بسيطة وغير المباشرة التي سوف تسمح بالكشف عن أي مباشرة أمر طال انتظاره. ويعالج هذا البروتوكول استخدام محتمل للصفائح الدموية كدرجة عالية من الحساسية لا جهاز استشعار في الدم. فهو يصف الصفيحات الأولية الغنية البلازما (PRP) والاستعدادات الصفيحات غسلها واستخدام النيتريت وخلايا الدم الحمراء deoxygenated لا المولدات. يستخدم للكشف عن وجود رقم الفسفرة بسب في سيرين 239 (فبسبSer239) حقيقة أن عالية يتم التعبير عن البروتين بسب في الصفائح الدموية وأنه هو فوسفوريلاتيد سريعاً عندما لا يتم هذا يؤدي إلى فرصة فريدة من نوعها لاستخدام هذا المسار للكشف عن وجود لا مباشرة في الدم.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الصفائح الدموية هي شظايا خلية صغيرة على شكل قرص المستمدة من ميجاكاريوسيتيس التي حاسمة بالنسبة تخثر الدم. تتالي التخثر هو بدأها مختلف الجزيئات النشطة بيولوجيا (مثل الكولاجين أو ADP)، أفرج عنه بعد إصابة جدار الأوعية الدموية. يمكن تعديل عملية تخثر الدم، بين مختلف المستجيبة بأكسيد النيتريك (لا). لا، بطبيعة الحال التي تنتجها خلايا الثدييات، واحدة من الإشارات الفيزيولوجية الأكثر تنوعاً. أنها بمثابة وعائي قوية والعصبي والمغير المناعي، غيض من فيض مهامها العديدة. في مجرى الدم، كما لا يساعد على تنظيم مدى تخثر الدم عن طريق تثبيط الصفيحات التجميع. أحد المصادر الأكثر احتمالاً لا في مجرى الدم هو النترات، أيون غير عضوية التي ثبت ليكون بمثابة مقدمة لرقم التفاعل مع خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء)، يتم تقليل النيتريت إلى لا وهو تتأكسد ديوكسيهب ميثيموجلوبين (ميثب)1. أي إصدار من كرات الدم الحمراء هو فعال في الأوعية ويسبب فاسوريلاكسيشن2. هذا المسار الحد النتريت بديل لا مسار الجيل، تعمل جنبا إلى جنب مع وتكميل الكلاسيكية لا يوجد مسار جيل ببطانية أكسيد النيتريك synthase في ظروف التاكسج.

الصفائح الدموية نفسها ليست قادرة على تقليل النيتريت في لا ولكن حساسة جداً لوجودها. في الصفائح الدموية سليمة، لا في نانومولار نطاق يزيد المركب (المفوضية الأوروبية50 = 10 نانومتر) والفسفره بسب (المفوضية الأوروبية50 = 0.5 nM)3. ولذلك، قد الصفائح الدموية بمثابة جهاز استشعار ممتازة تخفيض النترات بكرات الدم الحمراء ولا إطلاقها في الدم. وهناك العديد من الأساليب التي يمكن أن تقيس مباشرة مدى تنشيط الصفائح الدموية--مثل أجريجوميتري وثرومبولاستوجرافي (الأرقام)4،5. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق كميات كبيرة بدلاً من المواد والأجهزة المتخصصة باهظة الثمن. وأيضا الممكنة لمراقبة أحداث المصب، بعد لا يتم تحريرها من كرات الدم الحمراء، استخدام التغييرات في التعبير البروتين سطح الصفيحات – مثل سيليكتين ف6. لا كما هو معروف إلى زيادة كمية المركب في الصفائح الدموية7. سابقا، استخدمنا المركب لرصد لا الإفراج في الدم بعد التخفيض نتريت deoxygenated ربك8. وهذا يثبت بطريقة حساسة للغاية؛ ومع ذلك، المركب جزيء لم تدم طويلاً والكشف عنها ينطوي على عمالة مكثفة. هناك إمكانية أخرى، المبينة في البروتوكول المقدم، يستخدم الفسفرة والرمات حفزت وعائي (بسب)-البروتين الكشف عن وجود أي في الدم. بسب هو ركيزة للبروتين كيناز ز التنشيط، الذي هو فوسفوريلاتيد على التفاعل مع أي من خلال المسار المركب sGC/9. يحدث الاكتشاف VASP الفسفرة منخفضة جداً دون أي تركيزات، التي يمكن أن تجعل جهاز كشف حساس جداً لعدم وجود الصفائح الدموية في الدم. وأعرب عن بسب عالية في الصفائح الدموية، ولكن ليس في خلايا الدم الأخرى، مما يسمح لمتابعة الأحداث التي تضم10من الصفائح الدموية بشكل انتقائي.

والهدف الرئيسي من هذا البروتوكول وصف الطريقة بالتفصيل للكشف عن لا الإفراج في الدم كله استخدام تفاعله مع الصفائح الدموية برصد VASP الفسفرة11،12. وصف الأسلوب يسمح الاكتشاف المبكر لانخفاض لا تركيزات-نظرياً في نطاق nanomolar مما يجعل هذا البروتوكول أكثر حساسية من تصميم المركب، نتيجة لاستخدام التقنيات القياسية لطخة غربية يمكن تحقيقها في معظم المختبرات إعدادات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: وتم الحصول على عينات دم من بنك الدم المعاهد الوطنية للصحة (الاتحاد الدولي للرجبى اعتمد البروتوكول: 99-CC-0168).

1-الدم عينة إعداد

ملاحظة: لتفادي تنشيط الصفائح الدموية وسحب الدم ببطء وتخلط برفق مع سترات بعكس الأنبوبة عدة مرات.

  1. إعداد البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP)
    1. رسم 30-50 مل دم استخدام ز 20 أو أكبر قطر الإبرة، وإضافة إلى أنبوب يحتوي على سترات الصوديوم (3.8 في المائة) في نسبة 1:9 أو حمض سترات الدكستروز (ACD) (سترات صوديوم 85 ملم، وحمض الستريك 66.6 مم، الجلوكوز 111 مم، الرقم الهيدروجيني 4.5) بنسبة 1:6.
    2. الكوة 5 مل من الدم كله الطازجة التي تم جمعها في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل فارغة. الطرد المركزي الدم كله في 120 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. بعناية جمع المادة طافية المحتوية على الصفائح الدموية (البلازما الغنية بالصفائح الدموية، الحزب الثوري) من الجزء العلوي ماصة بلاستيكية نقل.
      ملاحظة: الحزب الثوري الشعبي من الخطوة 1-1-3 جاهز للاستخدام في التجارب أو غسلها لمزيد من المعالجة لإعداد الصفائح الدموية. بيليه الناعمة التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي (الخطوة 1.1.2) يحتوي على خلايا الدم الحمراء والخلايا البيضاء ويمكن أن تكون مواصلة تنقية للحصول على غسلها من خلايا الدم الحمراء (RBC) – انظر الخطوة 1.3. التجربة يحتاج إلى أن يتم الانتهاء من داخل ح 2 بعد رسم الدم. عند جمع الحزب الثوري (طافية)، تجنب جمع بافي الكريات البيضاء التي تحتوي على شعار المتراكمة على الواجهة PRP/ربك.
  2. إعداد الصفائح الدموية غسلها (اختياري)
    1. وتجمع أجهزة الطرد المركزي الحزب الثوري في 400 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية وإبقاء الكريات الصفائح الدموية.
    2. بلطف تغسل الكريات بإضافة 5 مل من المخزن المؤقت لكلية الدراسات العليا (120 مم كلوريد الصوديوم، الجلوكوز 30 ملم وسترات صوديوم 12.9 مم، الرقم الهيدروجيني 6.5) وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. ريسوسبيند الكريات الصفيحات مع 3 مل من تعديل تيرودي العازلة (مم كلوريد الصوديوم، مم 0.34 نة2بو4، 2.9 مم بوكل، 12 مم ناكو3، 20 مم حبيس، 1 مم مجكل2, 2 مم كاكل2، 10 مم الجلوكوز الأس الهيدروجيني 7.4 من 134).
    4. تمييع الصفائح الدموية (1: 100 – كمثال، 10 ميليلتر من الصفائح الدموية في ميليلتر 990 من حل ريس-إيكر) مع الحل إيكر ريس والعدد حسب هيموسيتوميتير.
    5. ضبط كثافة الصفائح الدموية إلى 3 × 108 خلايا/مل بإضافة تيرودي المخزن المؤقت.
    6. احتضان تعليق الصفائح الدموية في 37 درجة مئوية ح 1 قبل البدء في التجربة.
      ملاحظة: الصفائح الدموية غسلها مستقرة ح 5 – 8 عند 37 درجة مئوية.
  3. إعداد غسلها من خلايا الدم الحمراء (RBC)
    1. وبعد جمع والطرد المركزي بيليه الناعمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.1.3 في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه ربك مع 5 مل من برنامج تلفزيوني بالطرد المركزي في س 2,500 ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة من أجل 3 مرات.
    3. تجاهل برنامج تلفزيوني واستخدام كرات الدم الحمراء غسلها لإجراء مزيد من التجارب.

2-ديوكسيجينيشن

  1. أضف 1 مل الخليط من الحزب الثوري (أعد الخطوة 1.1.4. أو 1.2.4.) وكرات الدم الحمراء (إعداد في "الخطوة 1-3".) في الهيماتوكريت المرجوة في زجاجة البولي بروبلين مغلقة بسداده مطاطية. على سبيل المثال، في الهيماتوكريت 20%، إضافة 200 ميليلتر من كرات الدم الحمراء إلى 800 ميليلتر من الحزب الثوري الشعبي.
    ملاحظة: واقترح هيماتوكريتس من 0% تصل إلى 40%. لا تستخدم زجاجة زجاجية أو قارورة كما تتقيد الصفائح الدموية على سطح الزجاج.
  2. أدخل إبرة متصلة بخزان غاز الهليوم في زجاجة مغلقة وجعل منفذ الغاز عن طريق إدخال إبرة ز 26 (الشكل 1).
  3. ببطء عباب الزجاجة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: لا تسمح للغاز أنه إلى فقاعة من خلال إعداد الدم. تدفق الغاز بطيئة الأفضل لهذا الإجراء، وسرعة مفرطة تدفق الغاز أنه يؤدي إلى زيادة انحلال الدم. يحتاج تدفق الغاز الأكثر كفاءة يتحدد بالمحاكمة، كما أنه يعتمد إلى حد كبير على هندسة الإعداد التجريبية.
  4. متابعة عملية ديوكسيجينيشن دورياً بقياس ضغط الأكسجين الجزئي (ص2) استخدام التاكسج المشارك.
    ملاحظة: في أيدينا، 10 دقيقة من ديوكسيجينيشن نقصان ص2 إلى 25 مم زئبق هو مطلوب للحد من النترات باستمرار ديوكسيجينيشن كرات الدم الحمراء. زيادة خفض بو2 إلى 10 مم زئبق؛ ومع ذلك، فإنه أدى إلى زيادة انحلال الدم والزيادات في الخلية الحرة الهيموغلوبين (الشكل 2).

3-خلايا الدم الحمراء نتريت الحد

  1. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) إلى مجموعة 0.0345 نانو2 لجعل الحل الأسهم 500 مم من النترات. تمييع مم 500 نانو2 إلى 250 ميكرومتر نانو2 (25 س) بتمييع المسلسل في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4).
  2. استخدام ميكروسيرينجي، حقن النتريت (40 ميكروليتر) عبر الحاجز في العينة deoxygenated الحزب الثوري وكرات الدم الحمراء لتحقيق تركيزات نهائية من 10 ميكرون في المجموع 1 مل من عينة.
    ملاحظة: في هذه التجربة، هو نهائي تركيزات النترات المستخدمة 10 ميكرون.
  3. احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو أطول.
    ملاحظة: ضبط مدة الحضانة ربك الدقيق مع النيتريت اللازمة لتخفيض نتريت القصوى لنوع مختلف من التجارب.
  4. إزالة سداده وماصة 1 مل العينة في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
  5. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. "الماصة؛" ميليلتر 300 تعليق الصفائح الدموية من الجزء العلوي من المادة طافية وخلط مع حوار التعاون الآسيوي (الرقم الهيدروجيني 6.5) بنسبة 1:9. تجاهل بيليه ربك.
  7. الطرد المركزي بتعليق الصفائح الدموية في 500 x ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. إضافة ميليلتر 80 من تحلل المثلج المخزن المؤقت (150 مم كلوريد الصوديوم، 50 مم تريس، 0.5% NP-40، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على مثبطات البروتياز الكريات ثالثا كوكتيل (1: 500) إلى الصفائح الدموية.

4-غرب النشاف من بسب

  1. تحميل 15 ميكروغرام من البروتين من كل عينة إلى 10% منفصلة 2 الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية.
    ملاحظة: المخزن المؤقت تجريد القاسية، التي تحتوي على ب-mercaptoethanol، يتعذر إزالة الأجسام المضادة فاسب فSer239 وفاسب من الغشاء؛ ولذلك، فبسب Ser239 وبسب يجب تشغيل بشكل منفصل.
  2. تشغيل المواد الهلامية في 120 V 1.30 ح ونقل للغشاء النيتروسليلوز.
  3. كتلة غير محددة ملزمة مع اللبن المجفف الخالي من الدسم 5%.
  4. احتضان الغشاء مع فبسبSer239 (1: 500)، بسب (1:1، 000) وجابده (1:1، 000) للمبيت في 4 درجات مئوية.
  5. احتضان الفجل البيروكسيديز (HRP) الجسم المضاد الثانوي مع الغشاء لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. كشف الغشاء مع جهاز تصوير وقياس كثافة الفرقة باستخدام إيماجيج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

عينات الدم الوريدي يكون بو2 القيم بين 50-80 مم زئبق. ديوكسيجينيشن بالهيليوم يقلل من سرعة بو2 إلى 25 مم زئبق داخل 10 دقيقة زيادة ديوكسيجينيشن مرة أخرى قليلاً النقصان بو2. ومع ذلك، زيادة الوقت من ديوكسيجينيشن يؤدي أيضا إلى ارتفاع كبير في مستويات الهيموغلوبين الخلية الحرة (يحدده التاكسج المشارك، يعتبر الأحمر يزداد التلون للبلازما بصريا في الشكل 2 ) (الشكل 2 أ). زيادة انحلال الدم لا يرتبط مع التحريك لأن إثارة دون ديوكسيجينيشن الحث على عدم انحلال الدم (الشكل 2).

ووجدنا أن يقلل وجود كرات الدم الحمراء في تفكيك عينات فبسبSer239 وبسب التي تم الكشف عنها بواسطة غربي النشاف (الشكل 3). ولذلك، علينا فصل أولاً الصفائح الدموية وكرات الدم الحمراء قبل تشغيل البقع الغربية للكشف عن بسب فSer239 في الصفائح الدموية.

لإظهار أن هناك ما يكفي من الوقت لفصل كرات الدم الحمراء من الصفائح الدموية دون التأثير على الفسفرة بسب، استخدمنا الجهات المانحة لم لم تدم طويلاً. نونواتي برولي (لا الجهات المانحة مع نصف العمر 1.8 s في ج 37 درجة الحموضة 7.4)، وسرعة زيادة فبسبSer239 في الصفائح الدموية (داخل 10 s الحضانة). تم الكشف عن بسب فSer239 الناجمة عن "برولي نونواتي" لمدة 10 دقائق بعد الحضانة مع الحزب الثوري (الشكل 4).

نتريت يزيد ففاسبSer239 في الصفائح الدموية حضور deoxygenated كرات الدم الحمراء (pO2 25 مم زئبق). نتريت ريدكتيز نشاط كرات الدم الحمراء deoxygenated يعتمد على الهيماتوكريت ويحتفل أكبر قدر من التأثير في الهيماتوكريت 20% (الشكل 5).

Figure 1
رقم 1: قاعة ديوكسيجينيشن- يتم إضافة خليط من الحزب الثوري وكرات الدم الحمراء في زجاجة بلاستيكية مغلقة مع الغشاء المطاطي. زجاجة مغلقة متصل بخط الهليوم (أنه) باستخدام إبرة. الأكسجين هو يخرجوا بإبرة حقنه صغيرة (26 ز) بمثابة منفذ لبيع غاز.

Figure 2
الشكل 2: ضغط الأكسجين الجزئي (ص2) والهيموغلوبين خالية من الخلية بعد ديوكسيجينيشن- عينات (A) الحزب الثوري وكرات الدم الحمراء كانت deoxygenated قيست 3، 5، 10، 15، 30 و 50 دقيقة بو2 من عينات من الدم محلل الغاز (n = 3). أشرطة الخطأ صور الممثل sem. من المادة طافية عينات PRP + كرات الدم الحمراء أثارت مع (ب) أو بدون الهيليوم (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: عصابات وصمة عار الغربية VASP الممثل في عينات من PRP/كرات الدم الحمراء أعدت في الهيماتوكريت مختلف. كرات الدم الحمراء وأضيفت إلى الحزب الثوري إلى 1، 5، 10، 15، 20، 40% الهيماتوكريت. مخاليط من الحزب الثوري الشعبي + كرات الدم الحمراء تثفيل في 500 x ز لمدة 5 دقائق وتفكيك مع تحلل المخزن المؤقت.

Figure 4
الشكل 4: عصابات وصمة عار الغربية الممثل فبسبSer239 وبسب في الحزب الثوري بعد التعرض للا الجهات المانحة "نونواتي برولي"- كان برولي نونواتي (10 م) إضافة إلى الحزب الثوري والمحتضنة في 37 درجة مئوية ل s 10 و 30 و 1، 2، 5، 10 و 20 و 40 دقيقة.

Figure 5
الشكل 5: الفسفرة بسبSer239 يعتمد على المستويين2 والهيماتوكريت بو. الحزب الثوري (A) + كرات الدم الحمراء (20% الهيماتوكريت) كانت deoxygenated إلى مستويين2 بو مختلفة، 40 و 25 مم زئبق. وقيست ففاسبSer239 وفاسب بعد الحضانة لعينات deoxygenated مع نتريت 10 أمتار على 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10 (ب) والنتريت (10 م) أضيفت إلى deoxygenated الحزب الثوري الشعبي + كرات الدم الحمراء في الهيماتوكريت 0, 10 و 20 و 40 في المائة (ص2 = 25 مم زئبق). تم حساب إضعاف زيادة (فبسبSer239) بالنسبة لعنصر التحكم (الحزب الثوري الشعبي + كرات الدم الحمراء دون نتريت) لكل قيمة الهيماتوكريت. أشرطة الخطأ = sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

حيث يتم تنشيط الصفائح الدموية بسهولة، لطيف معالجة الصفائح الدموية التي تحتوي على عينات مطلوب. وينبغي تجنب بيبيتينج سريعة وقوية تهتز. يمكن استخدام مثبطات الصفائح الدموية مثل بروستاسيكلين (PGI2) لمنع تنشيط الصفائح الدموية؛ ومع ذلك، قد يؤثر هذا على بعض مسارات الإشارات داخل الصفائح الدموية. لإعداد الصفيحات الكريات، ونحن إضافة حوار التعاون الآسيوي إلى أن الإيقاف الصفائح الدموية واستخدام الطرد المركزي سرعة منخفضة.

صفيحات طازجة في الحزب الثوري بحياة محدودة تمتد، يصل إلى 2 حاء. لتحقيق إمكانية تكرار نتائج عالية، جميع التجارب التي ينبغي أن يتم فقط مع صفيحات طازجة وضمن ح 2 بعد جمع الدم. تم الحصول على البيانات المقدمة مع الصفائح الدموية في الحزب الثوري، الذي يعتبر الفسيولوجية أكثر من الصفائح الدموية غسلها. على الرغم من أن زيادة مدى الحياة والنقاء للصفائح الدموية غسلها، يمكن أن يؤدي الطرد المركزي المتكررة أثناء إعداد الصفائح الدموية غسلها للتنشيط عفوية وقد يؤدي هذا إلى نوعية غير متناسقة من الاستعدادات الصفائح الدموية. الحزب الثوري المفضل على الصفائح الدموية غسلها منذ الإجراء الذي أسرع ومواصلة معالجة يمكن تنشيط الصفائح الدموية. ومع ذلك، في حالات محددة، عندما تدخل بلازما الدم تخثر الدم عوامل يمكن أن تتداخل مع برنامج الإعداد التجريبية، غسل الصفائح الدموية يمثل الحل لتجنب هذه المشاكل.

تلوث الأكسجين في عينات deoxygenated هو أهم خطوة حاسمة لهذا التحليل. كرات الدم الحمراء ويمكن تجميعها و deoxygenated قبل إضافتها إلى الحزب الثوري الشعبي. ومع ذلك، نقل deoxygenated كرات الدم الحمراء يزيد من خطر التلوث بالأكسجين. وبالإضافة إلى ذلك، ديوكسيجينيشن من كرات الدم الحمراء المركزة يتطلب وقتاً أكثر من ديوكسيجينيشن إعداد كامل في الهيماتوكريت المرجوة، ويعد التعرض للغاز أنه يؤدي إلى زيادة مستويات الهيموغلوبين خالية من الخلية. على الرغم من أن يمكن غسلها الهيموغلوبين الخلية خالية من أصل deoxygenated كرات الدم الحمراء، يجب أن تكون المياه المالحة العازلة الفوسفات أو المخازن المؤقتة الأخرى المستخدمة للغسيل deoxygenated بعناية للحيلولة دون تلوث الأكسجين أثناء الطرد المركزي. لتقصير في عملية إعداد وتجنب تلوث الأكسجين لا لزوم لها، كل عينة الحزب الثوري الشعبي + كرات الدم الحمراء وأعد في الهيماتوكريت المرجوة أولاً وثم deoxygenated قبل إضافة النتريت.

لقياس بسب فSer239 بوصمة عار الغربية، يجب فصل كرات الدم الحمراء من الصفائح الدموية. وأعرب عن بسب في كرات الدم الحمراء13، ولكن المستويات المساحات عند مقارنتها الهيموغلوبين، وأقل بكثير مما في الصفائح الدموية. حيث يتم استخدام تركيز البروتين الكلي لتحميل عناصر التحكم في البقع الغربية، وجود كرات الدم الحمراء في عينات ليساتي يتداخل مع ففاسب وقياس فاسب من النشاف الغربية. سبب بمعدل بطيء dephosphorylation بانزيمات الفوسفاتيز في الصفائح الدموية14، بسب ف هو استمرار لمدة 10 دقائق (الشكل 4) ولذلك من الممكن فصل كرات الدم الحمراء بالطرد المركزي قبل جمع الصفيحات خلية ليساتيس.

المفوضية الأوروبية50 الفسفرة بسب تقريبا حجم أقل من المفوضية الأوروبية50 للمركب ذروة زيادة، 0.5 نانومتر و 9 نانومتر، على التوالي3، مما يجعل الفسفرة بسب أحد الأساليب الأكثر حساسية الكشف عن الوجود كميات قليلة من رقم ومع ذلك، منحنى الفسفرة بسب ردا على أي على شكل جرس؛ ولوحظ انخفاض الفسفرة بعد أن بلغ ذروته في شمال البحر الأبيض المتوسط 3-30 لا3. هذا الرد غير الخطية إلى زيادة تركيزات لا يجعل بسب غير مناسب لصرامة لا الكمي.

الصفائح الدموية في الحزب الثوري منذ فترة حياة قصيرة، يجب القيام الفحص في صفيحات طازجة داخل ح 2 بعد رسم الدم. يمكن الاطلاع على عدم الاتساق في بو2 مستويات بعد ديوكسيجينيشن منذ ديوكسيجينيشن العينات اعتماداً على معدل تدفق غاز الهليوم ومعدل يحوم الزجاجة. ولذا يلزم وقت ديوكسيجينيشن يتحدد بالمحاكمة. لقياس فاسب ف بالبقع الغربية، اختيار جسم حرجة، ويحتاج المرء استخدام مباشر لا الجهات المانحة كعنصر إيجابي للتحقق من الخصوصية. وبالإضافة إلى لا، P-بسبSer239 في الصفائح الدموية يمكن أن فوسفوريلاتيد بتثبيط الإنزيمات فوسفوديستيريسي وتفعيل البروتين كيناز طريقا.

قياس ففاسبSer239 له بعض المزايا على التحليل المركب. المركب في الصفائح الدموية لديه نصف عمر قصيرة جداً (أقل من 10 ق) وقياس المركب يتطلب إضافة المانع فوسفوديستريس3. كما أن القياس المركب يستخدم تقنية أليسا مكلفة نوعا ما. بسب يمكن قياسه ببساطة بوضع بروتوكول لطخة غربية داخلية، ولذلك تتوفر بسهولة أكبر.

زيادة ففاسبSer239 في الصفائح الدموية استخدمت بنجاح كجهاز استشعار للا جيل من نتريت المستنشقة في فيفو6. ولذلك، نحن أظهرت أنه من الممكن لاستخدام P-بسبSer239 في الصفائح الدموية كعلامة للا جيل في المختبر والمجراه في الدم، وربما في حالات أخرى مختلفة. المفوضية الأوروبية منخفضة غير معهودة50 يجعل هذا الأسلوب مرشح ممتاز للكشف عن وجود منخفضة جداً لا تركيزات في الدم. ولذلك، يوفر هذا البروتوكول إمكانية دراسة لا جيل في الدم في المنبهات الفسيولوجية المختلفة، كما هو الحال خلال تتالي تخثر الدم، ازداد الضغط الهائل أو زيادة التهاب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يتم سرد الدكتور ألن شيشتر اعتباره مخترع المشارك على العديد من براءات الاختراع الصادرة إلى "المعاهد الوطنية للصحة" لاستخدام أملاح النترات لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية. ويتلقى الإتاوات استناداً إلى المعاهد الوطنية للصحة الترخيص لبراءات الاختراع للتطوير السريري ولكن لا تعويضات أخرى.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل بمنحه داخلية المعاهد الوطنية للصحة للدكتور ألن أ. شيشتر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9, (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9, (3), e92435 (2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93, (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7, (1), e30380 (2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273, (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120, (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13, (3), e0193747 (2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370, (3), 184-188 (1995).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter