Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Обнаружение на основе тромбоцитов оксида азота в крови путем измерения VASP фосфорилирование

doi: 10.3791/58647 Published: January 7, 2019

Summary

Здесь мы представляем протокол для удовлетворения потенциального использования тромбоцитов как датчик высокочувствительный оксида азота в крови. Он описывает подготовку первоначальных тромбоцитов и использование нитрита и венозная красные кровяные клетки как оксид азота генераторов.

Abstract

Тромбоциты являются крови компонентов, отвечающих за надлежащее крови свертываясь. Их функция высоко регулируется различными путями. Один из самых мощных вазоактивных агентов, оксид азота (NO), также могут служить мощным ингибитором агрегации тромбоцитов. Прямые без обнаружения в крови является весьма сложной задачей из-за его высокую реакционную способность с свободной ячейки гемоглобина, который ограничивает не half-life в ряд миллисекунды. В настоящее время никаких изменений после вмешательства только оцениваются на основе измеренных изменений нитритов и нитратов (члены метаболический путь Нитрат нитрит нет). Однако, эти измерения точны достаточно сложно интерпретировать визави фактической никаких изменений, благодаря естественно высокий базовый нитритов и нитратов уровней, которые являются несколько порядков выше, чем ожидаемые изменения не сама по себе. Таким образом развитие прямых и простые методы, позволяющие определять NO непосредственно назрела давно. Этот протокол рассматриваются возможности использования тромбоцитов как высокочувствительный не датчик в крови. Он описывает первоначальный тромбоцитов богатой плазмы (PRP) и промывают тромбоцитов подготовка и использование нитрита и венозная красные кровяные клетки как нет генераторов. Фосфорилирование VASP на Серин 239 (Ser239P-VASP) используется для обнаружения присутствия № Тот факт, что белок VASP высоко выражается в тромбоцитах и что он быстро фосфорилированных когда NO присутствует приводит к уникальную возможность использовать этот путь непосредственно не обнаружение в крови.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Тромбоциты являются фрагменты небольшие дискообразный клеток, производный от megakaryocytes, которые имеют решающее значение для свертывания крови. Каскад свертывания инициируется различных биоактивных молекул (например, коллаген или ADP), выпущенные после повреждения сосудистой стенки. Процесс свертывания крови могут быть изменены, среди различных эффекторов, оксида азота (NO). НЕТ, естественным образом вырабатывается клетками млекопитающих, является одним из самых разносторонних физиологических сигналов. Он действует как мощным сосудорасширяющим, нейромедиаторов и иммунного модулятора, чтобы назвать несколько из его многочисленных функций. В кровь нет также помогает регулировать степень свертывания крови, препятствует агрегации тромбоцитов. Одним из наиболее вероятные источники NO в крови является нитрит, неорганических ионов, что было показано, чтобы служить в качестве прекурсора № Реагирующих с красных кровяных телец (эритроцитов), нитрит сводится к NO и deoxyHb окисляется до метгемоглобина (metHb)1. НЕТ, освобождены от RBCs вазоактивное и вызывает покровов2. Этот путь сокращения нитрит-альтернативный путь не поколения, действуя вместе с и дополнения классической путь не поколения синтаза эндотелиального оксида азота в гипоксических условиях.

Тромбоциты, сами не способны уменьшить нитритов в NO, но очень чувствительны к ее присутствию. В нетронутыми тромбоцитов, не в наномолярных диапазона увеличивает cGMP (EC50 = 10 Нм) и фосфорилирование VASP (EC50 = 0,5 Нм)3. Таким образом тромбоцитов может служить отличным датчик нитрита сокращения эритроцитов и не выброса в кровь. Существует несколько методов, которые могут непосредственно измерить степень активации тромбоцитов - как aggregometry и тромбоэластография (ГТЭ)4,5. Однако эти методы требуют дорогих специализированных приборов и довольно большое количество материала. Это также возможно для мониторинга событий вниз по течению, после не освобождается от RBCs, используя изменения экспрессии белка поверхности тромбоцитов – например P селектина6. НЕТ также известен для увеличения количества cGMP в тромбоцитов7. Ранее мы использовали cGMP для мониторинга без выброса в кровь после сокращения нитрита венозная РБК8. Это оказалось очень чувствительным методом; Однако цГМФ является молекула недолго и его обнаружение включает в себя обширные труда. Другая возможность, описано в протоколе представленных использует фосфорилирование сосудорасширяющим стимулирует фосфористой (VASP)-белок для обнаружения присутствия No в крови. VASP является субстрат протеин киназы протеина G активации, который фосфорилированных после взаимодействия с NO через sGC/cGMP путь9. Обнаружению VASP фосфорилирования происходит без каких-либо очень низкой концентрации, которые могут сделать очень чувствительной детектор не присутствие тромбоцитов в крови. VASP высоко выражается в тромбоцитах, но не в других клеток крови, который позволяет выборочно следить за событиями, с участием тромбоциты10.

Основная цель настоящего Протокола заключается в описания метод детально для обнаружения не выпуска в цельной крови, с помощью его взаимодействия с тромбоцитов, мониторинг VASP фосфорилирование11,12. Описан метод позволяет раннего обнаружения низкого не концентрации - теоретически в наномолярных диапазоне, что делает настоящий протокол более чувствительны, чем определение цГМФ за счет использования стандартной западной помарки методы достижимыми в большинстве лаборатории Параметры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Примечание: Образцы крови были получены из низ крови банка (СИБ утвердил протокол: 99-CC-0168).

1. кровь пробоподготовки

Примечание: Чтобы избежать активации тромбоцитов, нарисовать кровь медленно и осторожно перемешать с цитрат, инвертирование трубке несколько раз.

  1. Подготовка тромбоцитов богатые плазмы (PRP)
    1. Нарисуйте 30 – 50 мл крови с помощью 20 G или большего диаметра иглы и добавить в пробирку, содержащую цитрат натрия (3,8%) в соотношении 1:9 или кислоты цитрат декстрозы (ДСА) (85 мм тринатрия цитрат, 66,6 мм лимонной кислоты, 111 мм глюкозы, pH 4.5) в соотношении 1:6.
    2. Аликвота 5 мл свеже собранных цельной крови в пустой 15 мл конические трубы. Центрифуга цельной крови на 120 x g 10 мин при комнатной температуре.
    3. Тщательно Соберите супернатанта, содержащий тромбоцитов (тромбоцитов богатые плазмы, ОТР) от верхней части пипетки пластиковые передачи.
      Примечание: PRP от шага 1.1.3 готова к использованию в экспериментах или для дальнейшей обработки подготовить промывают тромбоцитов. Мягкие лепешки, полученные после центрифугирования (шаг 1.1.2) содержит красные кровяные клетки и лейкоциты и может быть далее очищенный для получения отмытых эритроцитов (РБК) — см. шаг 1.3. Эксперимент должен быть завершена в течение 2 ч после нанесения крови. При сборе ОТР (супернатант), Избегайте коллекции Баффи пальто содержащих лейкоцитов, накопленных на интерфейсе ОТР/РБК.
  2. Подготовка промывают тромбоцитов (опционально)
    1. Центрифуга собранные PRP на 400 x g 10 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и держать гранулы тромбоцитов.
    2. Осторожно промойте гранулы, добавив 5 мл CGS буфера (120 мм NaCl, 12,9 мм тринатрия цитрат и 30 мм глюкозы, рН 6,5) и центрифуги на 400 x g 10 мин при комнатной температуре.
    3. Ресуспензируйте гранулы тромбоцитов с 3 мл модифицированных Tyrode буфера (134 мм NaCl, 0,34 мм NaH2PO4, 2.9 KCl, 12 мм NaHCO3, 20 HEPES, 2 мм CaCl2, 10 мм глюкозы рН 7,4 мм MgCl2, 1).
    4. Разбавить тромбоцитов (1: 100 — как пример, 10 мкл тромбоцитов в 990 мкл раствора Риз-Экер) с раствором Rees Экер и подсчета Горяева.
    5. Отрегулируйте плотность тромбоцитов до 3 x 108 кл/мл, добавив Tyrode буфера.
    6. Инкубируйте подвеска тромбоцитов при 37 ° C за 1 ч до начала эксперимента.
      Примечание: Промывают тромбоцитов стабильны для 5 – 8 ч при 37 ° C.
  3. Подготовка отмытых эритроцитов (РБК)
    1. После сбора центрифуга мягкие лепешки, полученного на шаге 1.1.3 в 2500 x g 10 мин при комнатной температуре.
    2. Отменить супернатант и помыть лепешка РБК с 5 мл PBS центрифугированием на 2500 x g 10 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг для 3 раза.
    3. Отменить PBS и использовать отмытых эритроцитов для дальнейших экспериментов.

2. обескислороживания

  1. Добавить 1 мл смеси ОТР (подготовлен на шаге 1.1.4. или 1.2.4.) и эритроцитов (подготовлен в шаге 1.3.) в желаемой гематокрит в бутылку полипропилен, закрыт с резиновой пробкой. Например на 20% уровень гематокрита, добавьте 200 мкл RBCs 800 мкл ОТР.
    Примечание: Предлагаемые hematocrits от 0% до 40%. Не использовать стеклянные бутылки или настой как тромбоциты придерживаться поверхности стекла.
  2. Вставьте иглу, подключенных к бак газа гелия в закрытой бутылке и сделать выход газа, вставляя иглу 26 G (рис. 1).
  3. Медленно вихрем бутылку при комнатной температуре.
    Примечание: Не позволяют он газа пузырь через кровь подготовки. Медленно газового потока является предпочтительным для выполнения этой процедуры, и чрезмерно быстрый поток газа он приводит к увеличению гемолиза. Наиболее эффективный поток газа необходимо быть определены судом, как это сильно зависит от геометрии экспериментальной установки.
  4. Периодически следить за процессом обескислороживания, измеряя парциальное давление кислорода (по2) с помощью со-оксиметра.
    Примечание: В наших руках 10 мин обескислороживания уменьшается Ро2 в 25 мм рт.ст, который необходим для сокращения нитрита RBCs. Продолжая обескислороживания дальнейшему сокращению Ро2 в 10 мм ртутного столба; Однако это привело к увеличению гемолиза и увеличение клеток свободный гемоглобин (рис. 2).

3. красных кровяных клеток нитрита сокращение

  1. Добавьте 1 mL PBS (рН 7,4) в 0.0345 g NaNO2 сделать 500 мм раствор нитрита. Разбавьте 500 мм NaNO2 250 мкм NaNO2 (25 x) путем последовательного растворения в PBS (рН 7,4).
  2. С помощью microsyringe, inject нитритов (40 мкл) через перегородки в образце венозная PRP и БС для достижения окончательного концентрации 10 мкм в целом 1 мл образца.
    Примечание: В этом эксперименте окончательный концентрации нитрита используется — 10 мкм.
  3. Инкубируйте образца при 37 ° C в течение 10 минут или дольше.
    Примечание: Отрегулируйте точную продолжительность РБК инкубации с нитрит, необходимых для сокращения максимальной нитриты для различных типов экспериментов.
  4. Удалите пробку и Пипетка 1 мл образца в пробки microcentrifuge.
  5. Центрифуга на 200 x g 3 мин при комнатной температуре.
  6. Пипетка 300 мкл тромбоцитов подвески от верхней части супернатант и смешать с ACD (рН 6,5) в соотношении 1:9. Отказаться от РБК Пелле.
  7. Центрифуга тромбоцитов подвеска на 500 x g 4 мин при комнатной температуре.
  8. 80 мкл буфера lysis ледяной (150 мм NaCl, 50 мм трис, 0,5% NP-40, рН 7,4) содержащий ингибитор протеазы гранулы коктейль III (1: 500) тромбоцитов.

4. западный Blotting VASP

  1. Загрузите 15 мкг белка из каждого образца 2 отдельных гелях SDS-PAGE 10%.
    Примечание: Суровые зачистки буфер, который содержит b меркаптоэтанол, нельзя удалить P-VASPSer239 и VASP антитела от мембраны; Таким образом P-VASP Ser239 и VASP следует запускать отдельно.
  2. Запустите гели на 120 V 1.30 ч и передачи на нитроцеллюлозную мембрану.
  3. Блок-неспецифический привязка с 5% обезжиренное сухое молоко.
  4. Проинкубируйте мембрану с P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000) и GAPDH (1:1, 000) на ночь при 4 ° C.
  5. Инкубируйте хрен пероксидазы (ПХ) вторичные антитела с мембраной для 45 мин при комнатной температуре.
  6. Разоблачить мембраны с машиной тепловизор и количественно определить плотность группы с помощью ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Пробы венозной крови имеют Ро2 значения между 50-80 мм рт.ст.. Обескислороживания, гелий быстро уменьшается Ро2 в 25 мм рт.ст, в течение 10 мин увеличение обескислороживания время чуть дальше уменьшается по2. Однако, увеличение времени обескислороживания также приводит к значительно повысить уровень свободных клеток гемоглобина (определяется оксиметрического, визуально видно на рисунке 2 как все чаще красную окраску плазмы) (Рис. 2A-B). Увеличение гемолиза связан не с помешивая, потому что перемешивание без обескислороживания не вызвать гемолиз (рис. 2 c).

Мы обнаружили, что присутствие эритроцитов в лизированных образцов уменьшается P-VASPSer239 и VASP, обнаруживаемых западных blotting (рис. 3). Таким образом мы сначала отделить тромбоцитов и эритроцитов перед запуском западных помарках обнаружить P-VASPSer239 в тромбоцитах.

Чтобы показать, что есть достаточно времени, чтобы отделить эритроцитов из тромбоцитов, не затрагивая VASP фосфорилирование, мы использовали недолго доноров. PROLI NONOate (не доноров с периодом полураспада 1.8 s на 37 C рН 7,4), быстро увеличилосьSer239 P-VASP в тромбоцитов (в течение 10 s инкубации). P-VASPSer239 индуцированных PROLI NONOate обнаружено 10 мин после инкубации с ОТР (рис. 4).

Нитриты увеличиваетSer239 P-VASP в тромбоцитах присутствии венозная эритроцитов (pO2 25 mmHg). Нитриты редуктазы деятельность венозная БС зависит гематокрит и максимальный эффект наблюдается при 20% гематокрит (рис. 5).

Figure 1
Рисунок 1: Палата обескислороживания. Смесь PRP и RBCs добавляется в пластиковую бутылку, закрыт с резиновой перегородки. Закрытая бутылка подключен к линии гелия (он), с помощью иглы. Кислород является промыть маленький шприц иглой (26 G), выступающей в качестве газа на выходе.

Figure 2
Рисунок 2: Парциальное давление кислорода (по2) и клеток свободный гемоглобин после обескислороживания. ОТР (A) и RBCs образцы были венозная на 3, 5, 10, 15, 30 и 50 минут по2 образцов были измерены анализатор газов крови (n = 3). Планки погрешностей являются SEM. Представитель фотографии супернатант образцов ОТР + RBCs, перемешивают с (B) или без гелия (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: представитель VASP Западной блот полос в образцах ОТР/RBCs, подготовленные на различных гематокрит. БС были добавлены в ОТР в 1, 5, 10, 15, 20, 40% гематокрита. Смеси ОТР + RBCs были центрифугируется на 500 x g 5 мин и анализироваться с буфера lysis.

Figure 4
Рисунок 4: представитель западной помарке полос P-VASPSer239 и VASP в ОТР после воздействия не доноров PROLI NONOate. PROLI NONOate (10 М) был добавлен в ПРП и инкубировали при 37 ° C на 10 и 30 сек и 1, 2, 5, 10, 20 и 40 мин.

Figure 5
Рисунок 5: VASPSer239 фосфорилирования зависит от уровней2 и гематокрит pO. ОТР (A) + эритроциты (20% гематокрита) были венозная для двух разных Ро2 уровнях, 40 и 25 мм рт.ст.. P-VASPSer239 и VASP были измерены после инкубации венозная образцов с 10 М нитритов в 37 C 10 мин (B) нитриты (10 М) была добавлена в венозная PRP + БС на 0, 10, 20 и 40% гематокрит (pO2 = 25 мм рт.ст.). Раза увеличилась (Ser239P-VASP) была рассчитана относительно управления (ОТР + БС без нитрита) для каждого значения гематокрита. Планки погрешностей = SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Так как тромбоциты активируются легко, щадящая обработка тромбоцитов, содержащего образцы не требуется. Следует избегать быстро закупорить и энергичные встряхивания. Тромбоцитов ингибиторы, такие как простациклин (PGI2) может использоваться для предотвращения активации тромбоцитов; Однако это может повлиять на некоторые сигнальные пути внутри тромбоцитов. Для подготовки гранулы тромбоцитов мы добавить ACD тромбоцитов суспензий и использовать низкая скорость центрифугирования.

Свежеприготовленные тромбоцитов в ОТР имеют ограниченный срок диапазона, до 2 ч. Для достижения высокой воспроизводимости, все эксперименты должно быть сделано только с свежими тромбоцитов и в течение 2 ч после забора крови. Представленные данные были получены с тромбоцитов в НРП, который считается более физиологических, чем мыть тромбоцитов. Хотя продолжительность жизни и чистоту увеличивают промывают тромбоцитов, неоднократные центрифугированием при подготовке промывают тромбоцитов может привести к их спонтанной активации и это может привести к несовместимым качество препаратов тромбоцитов. PRP предпочтительнее промывают тромбоцитов так как процедура быстре и дальнейшей обработки может активировать тромбоцитов. Однако в отдельных случаях, когда вмешательство плазмы крови свертываясь факторы могут помешать с экспериментальной установки, мытье тромбоцитов представляет решение, чтобы избежать этих проблем.

Самый важный критический шаг для этот assay является загрязнение кислорода в венозная образцов. Эритроциты могут быть объединены и венозная перед добавлением к НРП. Однако передача венозная RBCs увеличивает риск загрязнения кислорода. Кроме того обескислороживания концентрированной RBCs требует больше времени, чем обескислороживания полной подготовки на желаемый уровень гематокрита, и больше воздействия газа он приводит к повышению уровня гемоглобина, клетки бесплатно. Хотя клеток свободный гемоглобин может быть вымываются из венозная RBCs, фосфатный буфер или другие буферов, используемых для промывки должно быть тщательно венозная для предотвращения загрязнения кислорода во время центрифугирования. Чтобы сократить процесс подготовки и избежать ненужных кислорода загрязнения, каждый образец PRP + RBCs был подготовлен на желаемый уровень гематокрита сначала и затем венозная перед добавлением нитрита.

Для количественного определения P-VASPSer239 , Западная помарка, БС должны быть разделены из тромбоцитов. VASP выражается в БС-13, но уровни незначимые по сравнению с гемоглобина и намного ниже, чем в тромбоцитах. Поскольку концентрация общего белка используется для загрузки элементов управления в западной помарки, наличие эритроцитов в lysate образцах вмешивается VASP измерения и P-VASP, Западный blotting. Из-за медленных темпов дефосфорилирование ферментами фосфатазы в тромбоциты14P-VASP поддерживается в течение 10 мин (рис. 4), и поэтому это можно отделить RBCs центрифугированием перед сбором lysates клетки тромбоцитов.

EC50 для VASP фосфорилирование является почти на порядок ниже, чем в ЕС50 увеличить пик цГМФ, 0,5 Нм и 9 Нм, соответственно3, что делает VASP фосфорилирование, одним из наиболее чувствительных методов для обнаружения присутствия низкое количество № Однако VASP фосфорилирование кривой в ответ NO колоколообразной; после пика в 3-30 Нм не3наблюдается снижение фосфорилирования. Это нелинейных ответ на повышение концентрации не делает VASP непригодными для строгого не количественная оценка.

Так как тромбоцитов в ОТР имеют короткий период жизни, assay должно быть сделано в свежих тромбоцитов в течение 2 ч после нанесения крови. Несоответствие уровней2 pO после обескислороживания можно найти так как обескислороживания образцов зависит от скорости потока газа гелия и скорость закрученного бутылку. Таким образом время для обескислороживания должен определяться судом. Для измерения P-VASP, западной помарки выбор антитела является важным, и необходимо использовать прямой доноров как позитивный элемент управления для проверки специфику. В дополнение кSer239 нет, P-VASP в тромбоцитах может быть фосфорилированных ингибирование ферментов phosphodiesterease и активации протеинкиназы путь.

Измерение P-VASPSer239 имеет некоторые преимущества над пробирного cGMP. цГМФ в тромбоцитах имеет очень короткий период полураспада (менее 10 s) и измерение cGMP требует добавления фосфодиэстеразы ингибитор3. Кроме того измерения cGMP использует довольно дорогим ELISA технику. VASP просто может измеряться доме иммуноблоттинга протокола и поэтому является более доступной.

Увеличение P-VASPSer239 в тромбоцитах успешно использовалось как датчик для не поколения ингаляционных нитритов в vivo6. Таким образом мы показали, что это можно использовать как маркер не поколения в vitro и in vivo, в крови и, возможно, в различных ситуациях P-VASPSer239 тромбоцитов. Необычно низкий ЕС50 делает этот метод является отличным кандидатом для обнаружения присутствия очень низкой не концентрации в крови. Таким образом этот протокол обеспечивает возможность учиться не поколения в крови в различных физиологических раздражителей, таких как во время каскад свертывания крови, увеличение чистой стресса или увеличилась воспаление.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Д-р Алан Schechter указан как соизобретателем на несколько патентов, выданных в национальных институтов здравоохранения для использования Нитриты соли для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Он получает роялти, основанные на низ лицензирования этих патентов для развития клинической, но не другие компенсации.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась интрамуральных гранта NIH д-р Алан н. Шехтер.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tri-sodium citrate Supply by NIH blood bank
Citric acid Supply by NIH blood bank
Glucose Sigma G7528-250G
NaCl; sodium chloride Sigma S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate Mallinckrodt Chemical 7892-04
KCl; potassium chloride Mallinckrodt Chemical 6858
NaHCO3; sodium bicarbonate Mallinckrodt Chemical 7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] Sigma H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride Quality Biology 351-033-721
CaCl2; calcium chloride Sigma C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles Nalgene 2089-0001
Red septum stopper NO.29 Fisherbrand FB57877
NaNO2-; sodium nitrite Sigma S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane Sigma T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody Cell signaling technology 3114
VASP antibody Cell signaling technology 3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signaling technology 2118
2-mercaptoethanol Sigma M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Research Laboratories 111-035-003
Clarity Western ECL Substrate BIO-RAD 1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex) Radiometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280, (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9, (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9, (3), e92435 (2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93, (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7, (1), e30380 (2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273, (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120, (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13, (3), e0193747 (2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370, (3), 184-188 (1995).
Обнаружение на основе тромбоцитов оксида азота в крови путем измерения VASP фосфорилирование
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).More

Srihirun, S., Schechter, A. N., Piknova, B. Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation. J. Vis. Exp. (143), e58647, doi:10.3791/58647 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter