Summary
Einrichtung von einem Mausmodell für Parkinson-Erkrankung mit MPTP und Verhaltensstörungen Bewertungen mit Zylinder und Freiland-Tests zur Messung der motorischen Funktion beschrieben. Wir verwenden dann l-Dopa als ein Beispiel zeigen, wie man dieses Modell in der Studie von PD Arzneimittel anwenden.
Abstract
Parkinson-Krankheit (PD) ist eine häufige Neurodegenerative Erkrankung Erkrankung, verursacht das Phänomen von Zittern, Steifheit, Langsamkeit der Bewegung und Demenz. 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) kann zu einige Parkinson-ähnlichen Symptomen führen, durch die Zerstörung von dopaminergen Neuronen in der Substantia Nigra des Gehirns. So wurde es zur PD-Modelle in verschiedenen tierexperimentellen Studien zu etablieren. Hier werden Mäuse MPTP Injektionen (20 mg/kg/Tag) für sieben Tage und die verhaltensbezogene Tests werden am achten Tag durchgeführt. Dieses Modell wird in der Studie von PD effizient angepasst. Die Verhaltensstörungen Tests hier gehören die Zylinder-Test und der Freiland-Test. Das Zylinder-Experiment wird verwendet, um die Tiere Fähigkeit, heben Sie ihre Vorderpfoten, wenn Sie in einer anderen Umgebung setzen zu erkennen. Als der PD-Mäusen zeigen wölbte — die Maus wölbt den Rücken – die Anzahl der Pfote Liftings Abnahme. Dieser Test ist einfach auszuführen. Die Freiland-Test wird verwendet, um den Betrag der Zeit verbringen die Mäuse über das laufen, gehen und bleiben unbeweglich zu erkennen. Wir analysieren Bewegungen der Tiere im Freiland mit Software und Daten erhalten. Schließlich verwenden wir l-Dopa, einer der am meisten gebräuchlich PD Drogen, als ein Beispiel zeigen, wie man dieses Modell für die Untersuchung von PD Medikamente anwenden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass MPTP Neurotoxizität motorischen Defizit induziert, die durch l-Dopa abgemildert werden können.
Introduction
Parkinson-Krankheit (PD), eine der häufigsten Erkrankungen bei älteren Menschen, ist eine langfristige Neurodegenerative Erkrankung1. Patienten zeigen immer das Phänomen der Zittern, Steifheit, Langsamkeit der Bewegung und Demenz, die im Laufe der Zeit2verschlechtern. Andere Symptome, einschließlich der sensorischen, sind Schlaf und emotionale Probleme auch allgemein2beobachtet. Die Ursache von Morbus Parkinson ist noch unklar, aber es wird allgemein angenommen, genetische und umweltbedingten Faktoren einzubeziehen, Verlust der dopaminergen Neuronen in der Substantia Nigra3und Entwicklung von Lewy-Körper und Lewy Neuriten in verschiedenen Regionen veranlassen die Gehirn4.
Unter den Studien der PD ist 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)5 weit in einige PD Symptome in experimentellen Modellen neu angepasst. Im Jahr 1984 Langston Et Al. zuerst gefunden, dass Injektionen von MPTP in Totenkopfäffchen Parkinsonismus6geführt. Obwohl das MPTP Nagetiere Modell nicht das Vorhandensein von Lewy-Körper, das Biomarker des PD ist zeigt, verursacht MPTP Parkinson-ähnliche Symptome durch die Zerstörung von dopaminergen Neuronen in der Substantia Nigra des Gehirns7. Im Vergleich zu anderen Drogen-Modell für PD wie induziert durch 6-Hydroxydopamine (6-OHDA)8 und 1-Methyl-4-Phenylpyridinium (MPP +)9, Injektion von MPTP ist einfach auszuführen und das MPTP-Modell nimmt weniger Zeit. Mäuse erhalten MPTP Injektionen (20-30 mg/kg/Tag) für sieben Tage und die verhaltensbezogene Tests auf dem achten Tag10durchgeführt werden.
Die Freiland-Test11 wurde zuerst von Calvin S. Hall, einer amerikanischen12entwickelt. In verschiedenen Studien untersuchen wir verschiedene Arten von Verhaltensweisen. In der Forschung die auf Parkinson Erkrankungen konzentriert, Verhaltensweisen wie Fortbewegung Aktivitäten und die Geschwindigkeit der Fortbewegung werden getestet, um festzustellen, ob das Tier bewegen beeinträchtigt ist. Im Vergleich mit anderen Methoden verwendet, um die Einrichtung von PD Tieren testen, Freiland Test ist einfach durchzuführen, weil die benötigte Ausrüstung einfach ist, und Prototyping und Daten-Analyse-Software (z.B. MATLAB, Excel) lässt sich leicht sammeln und grafische Darstellung der Daten. Der Variationskoeffizient ist auch relativ kleine13, was bedeutet, dass das Ergebnis der Freiland-Test zuverlässig ist. Ein weiterer Vorteil gegenüber anderen Methoden ist, dass die Verhaltensweisen, die in diesem Experiment enthalten leicht zu unterscheiden sind; die Mäuse kann entweder laufen, Walken oder still zu stehen. In der Regel kann der Freiland-Test auf Nagetiere verwendet werden, wenn der Forscher braucht, um das Thema Mobilität zu bewerten.
Die Zylinder-Test nennt man auch den Test der asymmetrischen Nutzung der Vorderbeine. Wenn dieser Test zuerst entwickelt wurde, diente es den asymmetrischen Einsatz der Ratte Vorderbeine14zu testen. Hier verwenden wir diesen Test zur Analyse des Tieres Fähigkeit zum ausstrecken und benutze beide seine Vorderbeine um neue Umgebung zu erkunden. Wenn der Substantia Nigra und Corpus Striatum von MPTP im Gehirn beschädigt sind, wird das Tier neigt dazu, den Rücken zu wölben und wird seltener ausstrecken und die unbekannte Umgebung zu erkunden. Dieser Test ist einfach durchzuführen und ein vorläufiges Ergebnis geben kann. Dieser Test hat jedoch hohe interne Variabilität, so ist es in der Regel mit zusammen mit anderen Verhalten Experimente verwendet.
Einnahme von l-Dopa, die auch bekannt als Levodopa oder L-3,4-Dihydroxyphenylalanine ist, ist eine gängige Methode, Parkinson-Erkrankung zu behandeln, da eine Ursache von Morbus Parkinson der Rückgang von Dopamin in ist der. L-Dopa ist die Vorstufe zum Dopamin. Aber im Gegensatz zu Dopamin, kann es die Blut - Hirn-Schranke, was bedeutet, dass es bei Erhöhung der Konzentration von Dopamin im Gehirnbereich effizienter zu überqueren. Nachdem es die Blut - Hirn-Schranke kreuzt, wird durch L-amino Acid Decarboxylase15l-Dopa in Dopamin umgewandelt.
Hier beschreiben wir die Messung und Analyse der motorischen Funktion im MPTP-induzierte-PD-Mäusen mit einem Zylinder Test14 und eine modifizierte Freiland-Test. Wir verwalten l-Dopa als ein Beispiel zeigen, wie man dieses Modell in der Studie von PD Arzneimittel anwenden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass MPTP motorischen Defizit induziert, die durch l-Dopa entschärft werden können.
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Protocol
Diese Studie wurde nach den internationalen, nationalen und institutionellen Regeln unter Berücksichtigung Tierversuche durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde von den tierischen Ethik-Kommission der Nankai-Universität zugelassen.
1. MPTP und l-Dopa-Verwaltung
Hinweis: Die zehn Wochen alten weibliche BALB/c Mäusen wurden durch das Institut für Zoologie, chinesische Akademie der Wissenschaften zur Verfügung gestellt. Mäuse waren untergebracht sechs pro Käfig unter einem 12 h hell/dunkel-Zyklus (Leuchten bei 08:00-20:00), eine konstante Temperatur von 21-22 ° C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 55 % ± 5 %. Alle Tiere erhielten autoklaviert standard Mäuse Chow von der gleichen Formulierung und Wasser Ad Libitum .
- Teilen Sie nach einer Woche der Akklimatisation sich die Tiere in drei Gruppen von sechs Mäusen.
- Zur Gruppe 1 verwalten intraperitoneale Injektionen (siehe Punkt 1.5) von 250 µL/Maus/Tag der Saline von Tag 1 bis Tag 7 und führen Sie dann eines-Verwaltung (siehe Schritt 1.6) 250 µL/Maus von Kochsalzlösung am 8. Tag.
- Gruppe 2, verwalten intraperitoneale Injektion von 20 mg/kg/Tag von MPTP jeden Tag von Tag 1 bis Tag 7 und führen Sie dann eines-Verwaltung von 250 µL/Maus von Kochsalzlösung am 8. Tag.
- Gruppe 3, verwalten intraperitoneale Injektion von 20 mg/kg/Tag von MPTP von Tag 1 bis Tag 7 und führen Sie dann eines-Applikation von 5 mg/kg von l-Dopa am 8. Tag.
- Führen Sie folgendermaßen die intraperitoneale Injektion.
- Laden Sie das Medikament in eine sterile 1 mL Spritze mit einer Nadel 26 G. Entfernen Sie Luft aus der Spritze.
- SCRUFF die Maus mit dem Bauch nach oben. Halten Sie den Kopf, Hals und Körper der Maus in einer geraden Linie sowie mit dem Kopf fixiert.
- Winkel der Nadel, das Peritoneum zu durchdringen. Schieben Sie die Nadel für eine ordnungsgemäße Entfernung bis gibt es wenig Widerstand, und dann injizieren Sie das Medikament. Ziehen Sie die Nadel reibungslos.
- Führen Sie die eines-Verwaltung wie folgt.
- Bereiten Sie das Medikament in einer sterilen 1 mL Spritze mit einer Oral-Magensonde-Nadel. Entfernen Sie Luft aus der Spritze.
- Halten Sie die Maus mit dem Bauch nach oben. Halten Sie den Kopf, Hals und Körper der Maus in einer geraden Linie mit dem Kopf fixiert.
- Halten Sie die Nadel parallel zum Körper der Maus, und aus die Maus Mundwinkel, die Zunge drücken und schieben nach innen gegen den Oberkiefer einfügen.
- Mit wenig Widerstand, was zeigt, dass die Nadel ist die Eingabe der Speiseröhre reibungslos, drücken Sie vorsichtig die Nadel in der entsprechenden Entfernung. Bevor die Spitze der Nadel den Unterteil der Brust erreicht, die Medikamente zu injizieren.
- Ziehen Sie die Nadel reibungslos.
2. Zylinder-test
Hinweis: Die verhaltensbasierte Tests wurden am 8. Tag durchgeführt. L-Dopa injiziert wurde, die dritte Gruppe von Mäusen 40 min vor den Verhaltensstörungen Tests. Geschieht die Verhaltensstörungen Prüfung nicht im selben Raum wo die Tiere untergebracht sind, müssen Tiere in den neuen Raum für 30-60 Minuten vor dem Test eingewöhnt werden.
- Führen Sie den Test 24 h nach der letzten Dosis von MPTP.
- Legen Sie einen transparente Glaszylinder (Höhe = 19,5 cm, Durchmesser = 15 cm, Gewicht ≥1 kg) in der Mitte des Tisches. Umgeben Sie den Zylinder auf drei Seiten mit schwarzem Karton, die Wirkung der Umgebungslicht zu reduzieren. Lassen Sie eine Seite des Zylinders vor der Kamera für video-Aufnahme.
Hinweis: Der Abstand zwischen der Pappe und der Zylinder sollte etwa 4 bis 8 cm. - Befestigen Sie eine Kamera (> 1 Million Pixel Auflösung) bei ~ 40-60 cm Abstand des Zylinders um sicherzustellen, dass der volle Zylinder sichtbar ist.
Hinweis: Dies ist weder zu weit noch zu nah um die Maus nicht zu stören, während der Videoaufnahme ihrer Bewegung. - Eine Maus in den Zylinder zu einem Zeitpunkt und beginnen Sie auf einmal Dreharbeiten. Nach 3 min Dreharbeiten zu stoppen.
Hinweis: Während dieses Vorgangs versuchen, um Lärm zu vermeiden oder leichte Änderungen in der Reihenfolge vermeiden, die Maus Verhalten zu beeinflussen. - Platzieren Sie den Mauszeiger wieder in der Heimat Käfig nach der Prüfung.
- Reinigen Sie den Zylinder mit Wasser und dann sprühen Sie 70 % V/V Ethanol über die innere Mauer, um es zu desinfizieren und Maus Düfte zu entfernen. Wischen Sie den Zylinder trocken, bevor eine andere Maus in gelegt wird.
- Spielen Sie das Video mit einer Rate von 0,5 x die normale Geschwindigkeit und die Anzahl der Pfote Aufzüge gegen die Wand des jede Maus.
Hinweis: Pfote Aufzüge auftreten, wenn die Maus sich auf seine Hinterbeine erhebt hebt beide Arme über Schulterhöhe und Ländereien. Ein Vorderbein Aufzug wird nicht gezählt. In der Regel wirft eine Maus seine Vorderbeine der Zylinderwand zu berühren. Wenn die Maus seine Vorderbeine über Schulterhöhe mehrmals kontinuierlich ohne Landung erhöht, sollte es nur als einmal gezählt werden.
3. offene Feldtest
- Durchführen Sie die Freiland-Test 24 h nach der Verabreichung von MPTP.
Hinweis: Es kann gleichzeitig die Zylinder-Test durchgeführt werden. - Bereiten Sie eine transparente offene Feld Reaktion (45 cm L x 45 cm W x 25 cm H) mit einer Holzplatte Abdeckung an der Unterseite mit einem schwarzen Tuch. Eine Kamera zu beheben (> 1 Million Pixel Auflösung) über das Feld in einer Höhe von 1 m.
Hinweis: Die Farbe der Freiland-Box unten sollte sich von den getesteten Maus darauf Farbkontrast im Video. - Stellen Sie die Kamera um sicherzustellen, dass die Freiland-Reaktion-Box direkt in der Mitte des Videos ist.
- Eine Test-Maus in das Feld ein, und lassen Sie die Maus selbst vertraut machen, die Umwelt für ca. 1 min.
- Rekord eine 5 min. Video mit der Kamera an den Computer angeschlossen.
- Analysieren Sie das Video mit Software-Tools (z. B. MATLAB), um die Bewegung Spur Figur, die Verteilung von statischen zu bekommen (Geschwindigkeit < 1 cm/s), walking (Geschwindigkeit 1-20 cm/s) und laufen (Geschwindigkeit > 20 cm/s) Zeit, die Total reiste Abstand und Durchschnitt Geschwindigkeit der einzelnen getesteten Maus.
Hinweis: Wenn Sie das Video analysieren, verfolgen wir den ganzen Körper der Maus. Die durchschnittliche Geschwindigkeit eines Körpers bedeutet die Gesamtlänge des Pfads bedeckt, geteilt durch die verstrichene Zeit. Daher, wenn eine Maus nicht bewegt wird, würde seine momentane Geschwindigkeit als Null betrachtet werden. - Bereinigen Sie jedem Kot im offenen Feld Reaktion. Sprühen Sie 70 % igem Ethanol auf Feld und wischen Sie es.
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Representative Results
In die Zylinder-Test wurde die Abnahme der Hinterreifen gegen die Wand beobachtet bei Mäusen (Gruppe 2) mit MPTP von Tag 1 bis Tag 7 und am 8. Tag verglichen mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen (Gruppe 1), Kochsalzlösung behandelt, während eine Erhöhung der Hinterreifen in den Mäusen (Gruppe 3) behandelt mit MP beobachtet wurde TP von Tag 1 bis Tag 7 und l-Dopa am 8. Tag im Vergleich zu den Mäusen (Gruppe 2) mit MPTP von Tag 1 bis Tag 7 und saline am Tag 8 (Abbildung 1) behandelt.
Abbildung 2 zeigt die repräsentative Spuren und Verteilung von statischen Zeit, Gehzeit und Laufzeit der drei Gruppen von Mäusen. (A) wurden Mäuse mit Kochsalzlösung behandelt. (B) Mäusen mit MPTP von Tag 1 bis Tag 7 und saline am Tag 8 behandelt. (C) Mäusen mit MPTP von Tag 1 bis Tag 7 und l-Dopa am Tag 8 behandelt. Wenn eine Maus in der Freiland-Arena mit Geschwindigkeit bewegte < 1 cm/s, 1-20 cm/s, oder > 20 cm/s, wurde es als statische, gehen oder laufen bzw. beurteilt. Mäuse behandelt mit nur MPTP zeigten eine geringere Geschwindigkeit, eine kürzere Distanz Bewegung, statische länger und eine kürzere Laufzeit als Kochsalzlösung behandelten Mäusen, gekennzeichnet das motorische Defizit induziert durch MPTP. Mit MPTP und l-Dopa behandelten Mäuse zeigten eine höhere Geschwindigkeit, eine längere Strecke der Bewegung, eine statische kürzer und mehr Laufzeit als die Mäuse mit nur MPTP (Abbildung 2, Abbildung 3), die zeigten, dass l-Dopa gemildert die MPTP-induzierte motorische Defizit.
Abb. 1: Auswirkungen von MPTP auf Motorleistung in Zylinder-Test Dies zeigt die Auswertung der Zahlen der Aufzucht am 8. Tag. * stellt p < 0,05, ** stellt p < 0,01 für einen One-Way ANOVA-Test. Alle Werte repräsentieren Mittelwert ± SD (n = 6). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Bewegung weg von Mäusen und die Verteilung der Zeit, die Mäuse bleiben, gehen und laufen während der 5 min im Freiland Test. (A) unbehandelte Mäuse. (B) Mäuse behandelt mit MPTP. (C) PD-Mäusen von l-Dopa gerettet. Laufen: die Maus bewegte sich mit einer Geschwindigkeit von mehr als 20 cm/s. zu Fuß: die Maus wurde bewegt in das freie Feld und mit einer Geschwindigkeit von 1-20 cm/s. statisch: die Maus war stationär (Geschwindigkeit < 1 cm/s) im Freiland (n = 6). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: das motorische Defizit induziert durch MPTP und die therapeutische Wirkung von l-Dopa auf die motorische Leistung im Freiland-Test. (A) Analyse der statischen, walking und Laufzeit. (B) Analyse der durchschnittlichen Bewegung entfernt. (C) Analyse der durchschnittlichen Geschwindigkeit. stellt p < 0,001 *** stellt p < 0,0001 für einen One-Way ANOVA-Test. Alle Werte repräsentieren Mittelwert ± SD (n = 6). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Aufgrund der Zerstörung von dopaminergen Neuronen in der Substantia Nigra des Gehirns verursacht MPTP Parkinson-ähnliche Symptome in Mäusen7. L-Dopa ist das am meisten bevorzugte Medikament für PD seit seiner klinischen Verwendung, weil es hilft bei der Aufrechterhaltung der normaler täglicher Aktivitäten bei Patienten mit Parkinson, mit wirksamen Unterdrückung der motorischen Auffälligkeiten einschließlich Bewegungsarmut und Steifheit15. Die Mäuse behandelt mit MPTP zeigte Beeinträchtigungen in der Verhaltenstherapie Tests wie Zylinder und Freiland-Test, die genutzt werden könnten, um das MPTP-Modell zu studieren. Zylinder und Freiland-Test sind in der Regel verwendet, um spontane Aktion messen. Hier haben wir diese beiden Verhaltens Tests zur Anwendung in der Studie von PD geändert. Wie in unseren Ergebnissen gezeigt, kann l-Dopa die Beeinträchtigungen im Verhalten mildern, durch die Verbesserung der motorischen Fähigkeiten der Tiere.
In der Regel erkunden Mäuse ihre Umgebung, wenn sie eingeführt, um eine neue Umgebung aufbewahrt. So erforschen, wenn in einem transparenten Zylinder gehalten, sie innerhalb des Zylinders zu bewegen und ihre Körper berühren die Zylinderwände mit ihrer Vorderbeine zu erhöhen. Mäuse mit neurotoxischen Substanzen wie MPTP, berauscht reduzieren diese Aktion. Dies ermöglicht es uns, den Zylinder-Test in der PD-Studie anzuwenden. Pfote Aufzüge Mengen zeigen Vordergliedmaße Verwendung für Körperunterstützung und dienen somit zur Bewertung der Wirkung der neuen chemischen Einheiten auf "motor"-Leistung16. Zylinder-Test bietet auch ein Maß für die Vordergliedmaße Motorik17 bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen, die mit motorischen Kortex Läsionen, wie Amyotrophe Lateralsklerose und Spinozerebellare Atrophie18.
Die Freiland-Test ist ein experimenteller Test konventionell zur Testdurchführung allgemeine lokomotorische Aktivität und die Bereitschaft der Nagetiere in Bezug auf die Zeit, die sie in der Mitte des Feldes zu bleiben. Messung der Bewegungsbahn, Geschwindigkeit und Zeit Mäuse bleiben, gehen und laufen bzw. auf dem gesamten Gebiet eher als bestimmten Bereich im Freiland Motorik in PD19auswerten kann. Einfach und leicht zugänglich ist Codierung Software nutzt (siehe die Tabelle der Materialien), können wir erhalten und die Daten im Zusammenhang mit der motorischen Funktion effizient analysieren.
Der Zylinder-Test und die Freiland-Test wurden ausgewählt, um spontane Lokomotive Funktion in PD-Mäusen aus den folgenden Gründen zu messen. Die Mäuse müssen nicht vor den Verhaltensstörungen Tests geschult werden. Nur wenige Minuten sind erforderlich für die Antwort, die die Effizienz gewährleistet. Die Kosten für die Ausrüstung benötigt, um die Durchführung der Tests ist gering. Ein großer Nachteil dieser Maßnahme ist jedoch, dass die Tiere Aktivität aufgrund von Veränderungen im Umfeld und individuelle Unterschiede erheblich variieren können. Um den Grad der Abweichung in den Ergebnisdaten zu verringern, sollte Vorsicht eingenommen werden. Erstens sollten Tiere des gleichen Alters, Geschlechts und genetischen Hintergrund20,21,22 gleichzeitig geprüft werden. Zweitens, Ausrüstung, Zylinder und Freiland, vor und nach der Prüfung jede Maus gereinigt werden müssen. Schließlich halten Sie die Umgebung ruhig und ungestört während des Tests.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Unsere Arbeit wird von Tianjin Undergraduate Trainingsprogramme für Innovation und Entrepreneurship (Grant Nr. 63183004) finanziert. Dieses Projekt wurde in der State Key Labor Arzneimittel chemische Biologie an der Nankai Universität initiiert. Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Ruiboxing Company | RBX-64175 | |
| Camera | BASLER | acA645-100gm | |
| Cylinder test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Levodopa | Sigma-Aldrich | 72816 | |
| Matalb 2017a | Mathworks | N/A | |
| Mice | Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences | Balb/c | Adult female mice(10 weeks) |
| MPTP | Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai | S31504-500mg | |
| Open field test | Made in-house at Nankai University | N/A | |
| Syringe | Solelybio | S-xsgwz-w | Irrigation |
| Syringe | Jiangxi Fenglin Medical Application Co. | hc3824 | Intraperitoneal injection |
References
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