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Summary
Murine 조직 처리에 대 한 표준화의 부족 인간의 표본에 비해 murine histopathological 분석의 품질을 줄일 수 있습니다. 여기, 선물이 murine 염증 및 uninflamed 저 승 조직 처리 및 인간의 샘플을 포함에 대 한 정기적으로 사용 하는 로봇 시스템의 타당성을 보여의 histopathological 검사를 수행 하는 프로토콜.
Abstract
인간의 질병의 이해 동물 모델의 연구 덕분에 크게 확장 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 실험 모델의 histopathological 평가 인간의 샘플에 대 한 적용으로 엄격한 될 필요가 있다. 실제로, 안정적이 고 정확한 결론 비판적으로 조직 섹션 준비의 품질에 의해 좌우 된다. 여기, 우리 histopathological 분석 murine 조직 절차 동안, murine 샘플의 파라핀 포함에 초기 준비에서 몇 가지 자동화 된 단계를 구현 하는 프로토콜을 설명 합니다. 자동화 된 절차에서 엄격한 프로토콜 표준화를 통한 방법론 변수 감소 murine 병 적인 분석의 향상 된 전반적인 안정성에 기여 한다. 특히,이 프로토콜 자동된 처리의 활용에 설명 합니다 하 고 조직 처리 및 파라핀 인간의 샘플의 포함 murine 표본 장 염증의 처리를 정기적으로 사용 로봇 시스템을 포함. 우리는 murine 조직의 histopathological 검사의 신뢰성 표준화 하 고 자동화 된 기법의 도입에 따라 크게 증가 결론.
Introduction
마지막 십 년간에서 인간의 질병1,2를 선도 하는 병원 성 메커니즘을 해 부를 몇 가지 실험 모델 개발 되었습니다. 질병의 심각도 평가, 연구원은 처리의 효과 평가 하 고 cytological 및 조직학 건축 변화 또는 염증3양의 공부 해야 합니다. 그 실험 모델을 사용 하 여 수행 하려면 자세한 histopathological 분석 murine 인간과 샘플4,5종종 비교 필요 하다.
또한, 인간의 샘플 일반적으로 처리 되 고 histopathology 핵심 시설에 의해 득점 하 고 경험이 인간의 병리학을 통해 표준화 histopathological 기준 및 방법. 반대로, murine 조직은 보통 고정, 임베디드 및 histopathological 프로토콜의 제한 된 경험을 가진 연구원에 의해 분석. 품질 및 histopathological 검사의 신뢰성 높은 품질 조직 단면도의 준비로 시작 합니다. 여러 가지 요인을 비판적으로 증가 또는 감소 등 고정, 거시적인 최종 분석의 품질 구분, 처리, 파라핀, 포함 및 샘플6,7의 포함에 기여.
샘플의 조작 관련 된 이러한 모든 구절 수동 샘플의 포함을 포함 하 여 수동 오류 및 낮은 범위, 단면 및 얼룩 수동 톰 대상이 됩니다. 현재, 조직학 평가 murine 조직 준비의 모든 과정은 다양 한 연구소에서 실험실 프로토콜 및 수동 프로토콜 의존 합니다. 이 연구의 목표 오류와 murine histopathological 시험에 다양성을 줄이기 위해 표준화 자동화 프로토콜을 구현 하는 것입니다.
우리의 지식, 여기 완전 자동된 조직 처리 및 murine 조직;의 조직학 평가 대 한 포함에 대 한 첫 번째 프로토콜 설명 이러한 인간의 표본 분석에 대 한 병 리 단위에서 정기적으로 사용 됩니다. 방법의 타당성의 실용적인 예를 들어, 창 자 염증의 murine 모델 분석 된, 즉, , 만성 대 장 염 모델으로 인 한 식 수8 에서에서 dextran 나트륨 황산 염 (DSS)의 반복된 관리 9. DSS 처리 동물 예를 들면, 체중 감소, 느슨한 대변 또는 설사, 및 섬유 증 뿐만 아니라 콜론의 단축 창 자 염증의 표시를 전시 하기 때문에 인간의 선 동적인 장 질병 (IBD)10 유사한 밀접 하 게이 실험 설정 8,,911. 인간의 IBD 환자에 대 한 관찰, DSS 처리는 복잡 한 질병 과정을 생성 합니다. 이러한 맥락에서 정교한 조직학 평가 조직 아키텍처의 심오한 변화를 이해 해야 합니다. 따라서, 샘플 준비 품질을 높이기 위한 기술된 프로토콜의 구현 조직학의 해석에 의존 하는 연구자를 유익할 수 있습니다 고 immunohistochemical murine 실험 설정에 대 한 분석. 조직 구조의 변경에 관련 된 인간 질병의 murine 실험 모델, 세포 조직 침투 또는 다른 조직 및 장기 (내장, 뇌, 간, 피부)에 염증의 존재의 증가 품질 사용할 수 있는 histopathological 검사를 위한 샘플 준비입니다.
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Protocol
동물 건강 (Auth. 127/15, 27/13)의 이탈리아 정부에 의해 승인 과정과 종양학 IACUC (기관 동물 관리 및 사용 위원회)의 유럽 연구소의 동물 보호 지침을 따라
1. 만성 대 장 염 유도 반복 DSS 관리
- 별도 연령과 성별 쥐 2 그룹 (치료 DSS 제어 H2O 대, 실험적인 그룹 당 적어도 5 쥐 littermates)에 일치합니다.
- 2.5% 관리 DSS (40 kDa) 치료 그룹에 7 일 및 물 컨트롤 그룹에 대 한 식용 수에서.
참고: 이 모델은 과거 만성 장 염증9을 유도합니다. - 7 일 후, DSS 치료를 중지 하 고 14 일에 대 한 두 그룹에 게 물. 3 번이이 프로세스를 반복 합니다.
참고: DSS의 반복적인 관리 밀접 하 게 닮은 인간 IBD, 즉, 섬유 증9장 점 막의 변경을 유도 합니다. - CO2 흡입에 의해, 즉 제도적 IACUC에 의해 승인 절차에 따라 쥐를 희생.
- 메스와 마우스 복 부와 복을 엽니다.
참고: 불 임은 좋지만 엄격 하 게 필요한. - 집게, 핀셋으로 작은 창 자에서 콜론을 구분 합니다. 족집게와 집게 콜론 삭제하시오
참고: 콜론 길이 측정 (그림 1A) colitis DSS 처리 쥐에서 발생 하는 경우 확인 하는 방법입니다. - 린스 차가운 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x의 10 mL를 페 트리 접시에 콜론 누르고 부드럽게 찌 재료를 제거 하.
2. murine 조직 고정
- 10%의 10 mL에 각 murine 콜론 견본을 담가 중립 버퍼링 포 르 말린 (NBF) RT (실내 온도)에.
참고: 불 임은 좋지만 엄격 하 게 필요한. - 실시간에서 18-24 h에 대 한 조직 수정
3. 콜론 구분 및 조직 준비
- 작은 핀셋으로 고정된 조직 NBF 컨테이너에서 제거 하 고 배양 접시에 넣어. 작은 핀셋으로 단면 작업 접시에 콜론을 넣어.
- 살 균 메스와 파편 (0.3 c m 길이 0.2 c m)에서 콜론을 잘라. 이 조각 길이 카세트의 두께 초과 하기에 최적입니다.
- 작은 핀셋 (그림 2A)으로 한 콜론 세그먼트를 선택 합니다. 작은 핀셋 (그림 2B)와 카세트를 포함 하는 방향의 파라핀의 끝을 돌출 하는 플라스틱 중 하나에 하나의 콜론 세그먼트를 삽입 합니다.
- 카세트 당 추가 3 콜론 세그먼트 (3.2-3.3) 작업을 반복 합니다. 직물의 중복을 최소화 하기 위해 인접 튀어나온 팁에 세그먼트를 삽입 하지 마십시오
- 신중 하 게 4 개의 가장자리 (그림 2C)을 추진 하 여 카세트를 단단히 닫습니다. 조직 손상을 방지 하기 위해 조직을 압박 하지 마십시오.
- 플라스틱 지원 프레임에 표를 삽입 합니다. 샘플을 식별 하기 위해 지원 프레임 레이블을 지정 합니다. 각 생물 학적 샘플에 대 한 반복 합니다.
4. 조직 처리
- (그림 3A, 3B) 전원 버튼을 누르면 자동된 프로세서를 켭니다.
- 파라핀 왁 스 용 해 되도록 1 시간 워밍업. 악기는 파라핀은 완전히 녹아, 전용된 아이콘 (그림 3C)의 존재를 관찰 하 여 확인 될 때까지 기다립니다.
- 자동화 된 프로세서 (그림 3D)에서 제공 하는 금속 바구니에 각 방향된 카세트 (조직 표본 포함) 수동으로 삽입 합니다. 바구니 인 최적화를 서로 가까이 줄 카세트를 세로로 배치 합니다.
- 금속 바구니 (그림 3E)를 닫습니다.
- 말 대 꾸 (그림 3 층)의 뚜껑을 엽니다. 쌈 바구니 기계를 삽입 하는 곳입니다. (그림 3) 프로세서의 전용된 주택에 바구니를 삽입 합니다. 말 대 꾸 (그림 3 H)의 뚜껑을 닫습니다.
- 악기 컴퓨터에 터치 스크린을 사용 하 여 (그림 3I) 작업 프로토콜 정의. 솔루션, 타이밍 및 표 1에 제공 된 스키마에 따라 구현할 온도 시퀀스를 선택 합니다.
- 전용된 컴퓨터 아이콘 (그림 3J)를 클릭 하 여 바구니를 포함 하는 통 렬 한 반박에서 실행 될 프로토콜을 지정 합니다. 시작 버튼 (그림 3 L)를 클릭 하 여 프로토콜을 시작 합니다.
- 악기는 프로토콜의 끝을 확인 하는 전용된 아이콘의 존재 여부를 관찰 하 여 고 기계에서 나오는 경보 음색을 듣고 여 때까지 기다립니다.
- 말 대 꾸 뚜껑을 엽니다. (그림 3 M) 프로세서에서 바구니를 제거 합니다.
5. 조직 포함
- (그림 4A) 전원 버튼을 누르면 자동된 embedder를 켭니다.
- 파라핀 왁 스 용 해 되도록 1 시간 워밍업. 악기는 파라핀 악기의 내부 온도계에 표시 된 파라핀 욕조의 온도 관찰 하 여 녹아 완전히 확인 될 때까지 기다립니다.
- Embedder 선반에 모든 처리 카세트 프로세서 바구니에서 수동으로 전송. 각 랙 최대 32 카세트를 포함할 수 있습니다. (그림 4B, 4c).
- (그림 4C, 4d, 4E) 주요 embedder 뚜껑을 엽니다.
- 악기 컴퓨터에 터치 스크린을 사용 하 여 신호는 로봇 시스템 랙 되는 삽입 (그림 4 층).
- 입구 주택 뚜껑 (그림 4G)를 엽니다. 랙 입구 주택에 삽입 합니다. 각 embedder는 동시에 최대 4 선반을 포함할 수 있습니다 (그림 4 H, 4I). (그림 4J) 입구 주택 뚜껑을 닫습니다.
- 표 2 (그림 4 K)에 따라 포함 절차를 시작 하려면 악기 컴퓨터에서 터치 스크린을 사용 합니다.
참고: 32 카세트의 각 랙 포함 45 분 걸립니다. - 악기 전용된 아이콘 (그림 4 L)의 존재를 관찰 하 여 프로토콜의 끝을 확인 될 때까지 기다립니다.
- 콘센트 랙 (그림 4 M)를 제거 합니다. 주요 embedder 뚜껑을 닫습니다.
- 선반에서 포함 된 블록 (방향 격자 포함)를 제거 합니다. 스토리지 골 판지 상자에 포함 된 블록을 전송 합니다.
6. 마이크로미터 단면
- 톰의 냉각 접시를 켭니다. -8 사이의 온도 설정-10 ° c
- 증류수 2 L를 포함 하는 톰의 서 모스 탯 물 목욕을 켭니다. 42-45 ° c.에 사이 물 목욕의 온도 설정
- 장소는 파라핀 블록 냉각 플레이트에 포함. 블록을 수 있도록 적어도 5 분 기다립니다.
- 냉각 접시에서 한 블록을가지고 고 톰 블록 홀더에 배치.
- 10 µ m 두께 6 번을 절단 하 여 두께 10 µ m. 트림 블록을 절단 하는 톰을 설정 합니다.
- 10 µ m에서 3 µ m. 컷 한 3 µ m에 대 한 섹션 Hematoxylin과 오신 (H & E)에 얼룩이 지는 톰의 두께 설정을 변경 합니다.
-
작은 브러시로 3 µ m 섹션을 수집 합니다. 3 µ m 섹션 조직 주름을 줄이기 위해 물 표면에 그것을 신중 하 게 누워 물 욕조에 넣어. 단일 유리 슬라이드에 온도 조절 장치로 통제 물 탕에서 조직 단면도 수집 합니다.
- 필요한 경우 추가 섹션을 잘라.
- 샘플 id를 작성 하 여 유리 슬라이드를 레이블을 지정 합니다.
- 적어도 10 분 동안 37 ° C 오븐에 슬라이드를 넣어.
- 유리 슬라이드 랙 즉각적인 분석 또는 스토리지 박스에 넣어.
7. hematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩
- 전원 버튼을 누르면 자동된 염색기에 전환 합니다. 악기 모니터에 로딩 바의 변화를 관찰 하 여 로봇 팔의 초기화를 허용 합니다.
- 염색기 랙, 세로 최대 30 슬라이드 삽입으로 유리 슬라이드를 삽입 합니다.
- 적절 한 무선 주파수 식별 (RFID) 플라스틱 태그와 랙 라벨. RFID 태그 제조 인 컴퓨터에 로드 된 올바른 얼룩 프로토콜을 식별 하는 시스템입니다.
- 랙을 염색기에 넣습니다. 자동으로 로드 하 고 RFID 태그의 인식에 따라 얼룩 프로토콜을 시작 하려면 컴퓨터를 허용 합니다.
참고: H & E 염색에 대 한 프로토콜에서 설명 하는 표 3.
8. Immunohistochemical 얼룩
- Immunohistochemical Mallory trichrome 앞에서 설명한7얼룩을 수행 합니다.
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Representative Results
식 수에 DSS의 반복 된 관리에 의해 유도 된 실험 만성 대 장 염은 밀접 하 게 닮은 인간 IBD8,9장 염증의 murine 모델. 그림 1 은 콜론 단축 (그림 1A), DSS 유도 된 염증의 존재와 저 승 식 프로-염증 성 유전자 CXCL10 등의 점수를 널리 사용 매개 변수를 포함 한 DSS 치료의 효과를 설명 합니다. , tnf 와 mcp-1 (그림 1B). 염증 세포의 침투 cytofluorimetry (그림 1C)에 의해 분석 장 lamina propria에 면역 반응의 모집을 보여주는 DSS 처리에 의해 크게 향상 되었습니다.
그림 2 묘사 어떻게 저 승 조직 구분 되 고 지향된 카세트에 삽입. 이 카세트는 exteriorly 압출 팁을 수 있도록 조직의 삽입 수직으로 하 고 적절 한 방향 즉,, 루멘 안쪽에 벽과 그리드를 포함 하도록 설계 되었습니다 (그림 2A, 2B, 2 C ). 카세트 닫으면 조직 방향 일어나는 전통적인 조직학 카세트 (그림 2B)와 반대로 격자에 의해 유지 됩니다.
조직 처리 자동화 된 프로세서 (그림 3A-3 M , 표 1), 포함 하는 동안 수행 됩니다 절차는 자동화 된 embedder (그림 4A-4 M , 표 2) 하 여 수행 됩니다. 후자의 악기에서 로봇 카세트를 수집 하 고 파라핀의 정확한 금액을 dispenses. 마지막으로 톰을 사용 하 여 섹션 각 파라핀 블록에서 절단 됩니다. 슬라이드는 다음 추가 분석을 위해 준비 됩니다.
그림 5 는 자동 H & E 염색 (그림 5A-5E 와 표 3)의 주요 구절 설명 및 H & E 염색 (그림 5 층) 후 슬라이드를 표시 하는 방법. 그림 6 및 7 어떻게 자동된 처리 및 포함 프로토콜의 구현 강하게 murine 저 승 표본의 histopathological 분석의 품질을 증가 표시 합니다. 샘플 자동 프로토콜 치료 쥐 (그림 6A)에서 파생 된 준비의 H & E stainings DSS 취급 생쥐 (그림 6B)의 그들에 비교 되었다. Histopathological 점수 평가 침투, 상피 변경 및 변경에 설명 된 대로 점 막 구조의 세포 등 염증 성 창 자 점 막에서 발생 하는 다른 매개 변수를 수정 하 여 평가 했다 표 4. 그림 6 c H 대표 & 저 승 조직 수동으로 처리 하 고 전통적인 카세트에 포함의 전자 얼룩을 묘사 한다. 그림 7에서 murine 조직 준비 및 자동된 악기를 통해 수행 포함의 품질 또한 IHC에 의해 확인 되었다 CD20 그리고 Mallory trichrome 얼룩8,9 저 승에서 얼룩 치료 (그림 7A, 7c) 및 DSS 처리 (그림 7B, 7d)의 쥐.
그림 8 이 방법의 실제적인 관련성을 설명합니다. 같은 콜론 샘플 처리 하 고 수동 또는 자동 방법을 통해 포함 했다. 각 샘플 (어느 컨트롤 또는 DSS 처리) 2 등분으로 자르고는 수동 또는 자동 방법을 병렬로 처리 했다. H & E 염색 되었고 수행 후 완전 한 현미경 평가 관한 해결 모든 병 적인 매개 변수 변경 점 막 구조, 세분성, 면역 세포에 침투, 막 두께, 선의 진공 일반적으로 장 염증 동안 관찰, 매뉴얼에 대 한 모두는 각 샘플에 대 한 평가 했다 및 자동화 프로토콜 (그림 8A 와 표 4). 자동화 프로토콜 샘플의 준비는 일관 되 게 수동 방법 보다 조직학 매개 변수의 더 높은 비율의 평가 허용. 또한, 다른 조직학 매개 변수에 대 한 별도 분석을 수행한 (그림 8B). 아키텍처 및 기저 침투 평가 했다 긍정적으로 영향을, 치료 쥐에 특히 자동화 된 방법으로 샘플 준비.
처리 및 현재 인간 histopathological 분석에 대 한 사용을 포함 하는 샘플에 대 한 자동화 된 방법 murine 표본 분석을 위해 성공적으로 적용할 수 있습니다. 높은 품질 표본 murine 저 승 조직의 기저 면역 침투 및 아키텍처 평가에 수동 방법을 통해 우수성을 보여 주는 자동화 된 방법으로 생성 됩니다.
그림 1: 만성 장 염증 평가. (A) 콜론 길이 측정. DSS 처리에서 프로-염증 성 유전자 (cxcl10, tnf, mcp-1)의 (B) 저 승 식 (블랙 바, n = 12) 쥐를 치료 (화이트 바, n = 6). 저 승 lamina propria의 (C) Immunophenotyping DSS 치료 세포 (폐쇄 기호, n = 12) 쥐를 치료 (기호, n 열 = 6). CD11b + Ly6G + CD11b + f 4 호 중구 / 80 + 세포 (왼쪽된 패널), CD4 + 및 CD8 + T 세포 (오른쪽 패널) 침투 컨트롤에서 (기호, n 열 = 10) 및 DSS 처리 마우스 (폐쇄 기호, n = 10). 통계적 의미 순위 t 테스트 서명 Wilcoxon 대응 쌍을 사용 하 여 계산 됩니다. p ≤ 0.05 * * p ≤ 0.01. 의미 값 ± SEM 보고 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 샘플 준비 설명. (A)는 외부 카세트 (흰색)에 의해 구성 조직 준비 및 방향의 카세트의 그림에 필요한 악기 및 내부 그리드 압출 방향 팁. (B, C) (B) 전에 카세트의 내부 격자에서 murine 콜론의 삽입 및 격자의 (C) 폐쇄 후. 패널에서 B 표시 됩니다 (왼쪽) 방향의 카세트 또는 전통적인 카세트 (오른쪽)에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 자동화 된 처리의 설명. (A, B) 프로세서를 자동화합니다. (C) 아이콘 올바른 파라핀 왁 스 용 해 온도 설명 합니다. (D, E) (D) 금속 바구니 및 폐쇄 (E)에 카세트 삽입 (F, G, H) 말 대 꾸에 금속 바구니 삽입 (I, J, K) 처리 프로토콜의 선택입니다. (L) 프로토콜의 실행. (M) 바구니 형태는 토르의 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 자동 포함의 설명 . 자동화 된 embedder의 (A) 그림. (B, C) 랙에서 카세트 삽입 (D, E) 개막식 (D)과 뚜껑의 폐쇄 (E) 랙의 존재의 기계에 (F) 신호. (G, H) 랙 입구 주택에 삽입 (I, J)는 뚜껑의 폐쇄. 포함 프로토콜의 (K) 시작. (L) 콘센트 주택 뚜껑의 오프닝. 랙 형태의 콘센트 주택 (M) 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 자동된 H & E 염색기의 설명. 슬라이드 홀더 (A) 그림. (B, C) 기계에서 슬라이드 홀더 삽입 컴퓨터의 (D) 폐쇄. 얼룩 프로토콜의 (E) 시작. (F) 톰 절단 및 H & E 염색 후 슬라이드의 Exemplificative 그림. 오른쪽 패널, H & E 샘플 방향을 묘사 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 저 승의 H & E stainings 형성 치료 및 DSS 처리 쥐. 준비 H & E 치료 (A) 및 DSS 처리 (B) 샘플의 얼룩 (처리, 임베디드, 스테인드)와 (A, B)를 자동 또는 수동 (C) 방법. 눈금 막대 = 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: Mallory trichrome (A, B)와 IHC stainings CD20 + 셀 (C, D)의 침투의 치료 (A-C) 및 DSS 처리 (B, D) 마우스. Mallory 얼룩: 블루, 콜라겐, 다크 핑크, 핵, 진한 빨강색, 세포질. 눈금 막대 = 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 수동 및 자동 프로토콜 조직 분석 비교. (A) 총 histopathological 매개 변수 평가할 수동 (흰색 막대) 또는 자동화 된 방법 (자주색 막대)으로 준비 하는 모든 섹션에서. (B) 비율 (흰색 막대) 수동 또는 치료 (일반) 또는 DSS 취급 생쥐 (점선된 바)에 자동화 된 방법 (자주색 막대)으로 준비 하는 샘플에 표시 된 매개 변수입니다. 통계적 의미 순위 t 테스트 서명 Wilcoxon 대응 쌍을 사용 하 여 계산 됩니다. p < 0.05; p < 0.005입니다. 의미 값 ± SEM 보고 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 | 시간 (분) | 온도 (° C) | 압력 |
| NBF | 1 | RT | 주변 |
| 에탄올 95% | 1 | RT | 주변 |
| 에탄올 95% | 1 | RT | 주변 |
| 에탄올 95% | 1 | RT | 주변 |
| 절대 에타 놀 | 1 | 45 | 주변 |
| 절대 에타 놀 | 11 | 45 | 주변 |
| 절대 에타 놀 | 30 | RT | 주변 |
| 크 실 렌 | 1 | RT | 주변 |
| 크 실 렌 | 1 | 45 | 주변 |
| 크 실 렌 | 28 | 45 | 주변 |
| 파라핀 왁 스 | 5 | 65 | 진공 |
표 1: 자동 조직 처리 프로토콜.
| 각 카세트에 대 한 로봇에 의해 액션 perfomed |
| 랙에서 한 카세트를 제거 |
| 카세트를 식별 |
| 전 열 형 |
| 장소에 미리가 열된 형 카세트 |
| 파라핀은 카세트에 대 한 금액을 분배 |
| 금형 냉각 |
| 강화 하기 위해 파라핀을 허용 |
| 형에서 응고 파라핀 블록 제거 |
| 현재 품질 센서 블록 |
| 파라핀 블록을 출력 문에 놓으십시오 |
표 2: 자동화 프로토콜을 포함 합니다.
| 카테고리 | 기준 | 정의 | 점수 값 |
| 선 동적인 세포 침투 | 심각도 (백혈구에 침투 lamina propria 영역의 밀도 평가 hpf) | 아니 침투 | 0 |
| 최소한의 급성 (< 10%) | 0.25 | ||
| 온화한 만성 (10-25%, 흩어져 호 중구) | 0.5 | ||
| 보통 만성 (26-50%) | 0.75 | ||
| 답변으로 표시 (> 51%, 조밀한 침투) | 1 | ||
| 범위 (백혈구 침투의 확장) | 점 막 | 0.5 | |
| 점 막과 submucosal | 0.75 | ||
| 상피 변화 | 증식 (경도 지하실, 토 굴 신장으로 볼 수 있는 상피 세포 수 증가) | 아니 증식 | 0 |
| 최소 (< 25%) | 0.25 | ||
| 가벼운 (26-35%) | 0.5 | ||
| 보통 (36-50%, mitoses 크립 상피의 위 세 번째에서) | 0.75 | ||
| 답변으로 표시 (> 51%, 기본 토 굴에서 먼 토 굴 상피에 있는 mitoses) | 1 | ||
| 잔 셀 손실 (토 굴 당 초기 잔 셀 번호를 기준으로 잔 셀 숫자의 감소) | 손실 없음 | 0 | |
| 최소 (< 25%) | 0.25 | ||
| 가벼운 (26-35%) | 0.5 | ||
| 보통 (36-50%) | 0.75 | ||
| 답변으로 표시 (> 51%) | 1 | ||
| 점 막 구조 | 궤 (muscolaris 거칠어 넘어 도달 하는 상피 결함) | 아니 궤 양 | 0 |
| 궤 양 | 0.25 | ||
| 알갱이 만듦 조직 (셀, 침투 둘러싸인 새로운 모세 혈관과 결합 조직 수리 hypertrophied 영역) | 알갱이 만듦 조직 없음 | 0 | |
| 알갱이 만듦 조직 | 0.25 | ||
| 점 막 두께 토 굴 깊이 | 아니 두껍게 | 0 | |
| 두껍게 | 0.5 | ||
| 선 진공 | 아니 희박 | 0 | |
| 진공 | 0.5 | ||
| 발육 이상 | 아니 발육 이상 | 0 | |
| 발육 이상 | 0.5 | ||
| 최대 점수 | 6 |
표 3: 자동화 프로토콜을 얼룩이 지기.
| 각 슬라이드에 대 한 제조 인에 의해 액션 perfomed | 시 약 | 시간 (s) | 온도 (° C) |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Deparaffinize | 크 실 렌 | 120 | RT |
| Deparaffinize | 크 실 렌 | 120 | RT |
| 수 화 | 에탄올 96% | 120 | RT |
| 수 화 | 에탄올 96% | 120 | RT |
| 워시 | 소 주 wtaer | 240 | RT |
| 얼룩 되며 | Carazzi의 되며 | 540 | RT |
| 린스 | 수도 물 | 360 | RT |
| 얼룩 오신 | 오신 Y 1 %aqueos 솔루션 | 60 | RT |
| 린스 | 수도 물 | 120 | RT |
| 탈수 | 에탄올 96% | 20 | RT |
| 탈수 | 에탄올 96% | 20 | RT |
| 탈수 | 절대 에타 놀 | 15 | RT |
| 탈수 | 절대 에타 놀 | 15 | RT |
| 지우기 | 크 실 렌 | 30 | RT |
| 지우기 | 크 실 렌 | 30 | RT |
표 4: 창 자 염증의 평가 대 한 제도 점수.
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Discussion
우리 조직 분석 murine 조직의 준비 하는 동안 다른 자동화 된 단계를 사용합니다. 이 프로토콜 기술 힌트 재현성 및 따라서 최종 histopathological 평가의 전반적인 품질을 향상 하는 전체 과정의 표준화를 제공 하는 것을 목표로. 우리는 자동된 계기와 준비 및 조직, 정기적으로 인간의 표본 연구에 대 한 병 리 핵심 시설에 사용의 포함에 대 한 메서드 구현.
이 방법의 잠재적인 적용 가능성을 보여 장 염증, 만성 직장 염 DSS 유도 모델의 만성 murine 실험 설정을 선택 했습니다. 이 설정은 정교한 조직학 평가 만성 장 염증 시 발생 하는 조직 아키텍처의 심오한 변경 조사를 요구 하는 IBD 환자에서 관찰 하는 복잡 한 질병 과정을 유사 합니다. 이러한 프로세스의 조직학 평가 증가 샘플 준비 품질에서 크게 유익할 수 있습니다. 참고로,이 프로토콜 적용할 수 있습니다 다른 murine 조직 (즉, spleens, 림프절, 간, 뇌), 유일한 차이 지향된 카세트는 루멘 없이 조직에 대 한 필요 하지 않습니다.
가장 중요 한 관찰 수동 오류 감소 했다 (즉,, 샘플의 방향) 격자와 카세트를 사용 하 여 및 카세트 포함 (단계 매뉴얼 중 일반적으로 수행에 대 한 재개의 제거 프로토콜), 강하게 분석의 전반적인 재현성 향상. 실험에 의하여 동쪽을 향한 카세트 조직을 삽입 때 여기에 설명 된 프로토콜, 샘플 준비의 시작 부분에만 조작 됩니다. 일단 폐쇄, 카세트는 다시 열, 따라서 올바른 방향의 유지 보수를 보장 하 고 수동 오류3,11을 감소 하지 않습니다. 이러한 두 가지 중요 한 단계 표준화 이후 분석의 전체 품질을 향상 및 손실 또는 하지 평가할 샘플, 문제 모두 카세트의 재개 또는3 샘플의 잘못 된 방향에 링크의 수를 감소 ,11.
우리는 또한 섬유 증 (그림 7), 자동화 프로토콜의 구현으로 과소 평가 실험 창 자 염증의 murine 모델에 매우 자주 그와 같은 복잡 한 생물 학적 이벤트 평가에 성공 했다. 프로토콜의 설정 하는 동안 우리는 엄격 하 게 우리가 조직 변경 피하기 위해 24 시간을 초과 해서는 안 실현 고정 시간 등 기술적인 세부 사항 표준화. 이렇게 함으로써, 우리 후속 immunohistochemical 분석의 품질을 유지할 수 있습니다.
자동화 된 방법 개선 치료 쥐에 (서) 특히 조직 구조의 변경에 관련 된 이러한 매개 변수 평가. 실제로, 건강 한 대응으로 병 적인 조직의 올바른 비교 실험 모델3의 최종 평가 대 한 비판적으로 중요 하다.
조직 처리에 관하여 다른 프로토콜 연구실에서 사용할 수 있는 자동화 된 프로세서에서 실행 되도록 테스트 했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 소리와 매우 일관 된 결과 주었다. 우리는 또한 시간 길이 프로토콜에 대 한 구현. 짧은 프로토콜 처리 murine (장,이 경우) 충분 했다 murine 샘플 크기에 인간의 작은 biopsic 견본에 비교 했기 때문에, 조직. 마지막으로, 전체 자동화 된 절차 총 실험 시간 감소. 톰 절단 및 조각 준비 처리의 시작 부분에서 우리는 총 소요시간 5 h는 계산. 그와 반대로, 연산자의 기술 능력에 따라 같은 프로토콜의 완성 수동으로 요청할 수 있습니다 시간의 금액을 두 번 이상 처리 및 포함 하는 동안 특히. 기술에의 한 제한 자동된 프로세서와 실험실에서 수행 하는 embedder 요구 한다 이다.
결론적으로, 우리는 이러한 자동화 프로토콜의 구현 murine 실험 모델 인간의 질병을 다루는 변환 연구자의 작품을 ameliorate 크게 수 믿습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
IRCCS 폴 병원, 기술 지원에 대 한 밀라노와 IEO 동물 시설 지원에 대 한의 병 리의 부를 축산에는 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10x | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1x | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
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면역학 그리고 감염 문제점 143 histopathological 분석 murine 모델 자동화 시스템 표준화 murine 장 표본 포함Erratum
Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. An author affiliation was updated.
The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS
