Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

באמצעות מערכות רובוטיות כדי לעבד ולהטביע דגימות מאתר חוקן עבור ניתוחים היסטולוגית

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58654
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 3,4, 1, 2
1Pathology Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, 3Gastroenterology and Endoscopy Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 4Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

היעדר סטנדרטיזציה לעיבוד רקמות מאתר מפחית את האיכות של ניתוח histopathological מאתר לעומת דגימות אנושי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע בדיקה histopathological מאתר מודלק, uninflamed הגס רקמות כדי להראות את הכדאיות של מערכות רובוטיות בשימוש שגרתי עבור עיבוד והטבעה דגימות אנושי.

Abstract

ההבנה של מחלות האדם הורחבה במידה רבה בזכות המחקר בבעלי חיים כמודלים. למרות זאת, הערכת histopathological ניסיוניות צריך להיות קפדני ביותר כמו להחיל עבור דגימות אנושי. אכן, הסקת מסקנות אמין ומדויק באופן ביקורתי מושפעת האיכות של רקמות סעיף הכנה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לניתוח histopathological של רקמות מאתר המיישמת מספר פעולות אוטומטיות במהלך ההליך, משלב הכנת הראשונית ועד פרפין הדגימות מאתר. ההפחתה של משתני מתודולוגי באמצעות פרוטוקול קפדני סטנדרטיזציה של שגרות אוטומטיות תורמת האמינות הכוללת של מאתר ניתוח פתולוגי. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר את הניצול של עיבוד ממוכן, הטמעת מערכות רובוטיות, בשימוש שגרתי עבור עיבוד רקמות ופרפין הטבעה של דגימות אנושי, לעבד מאתר דגימות של דלקת מעיים. . נסיים המהימנות של histopathological בחינת רקמות מאתר זה גדל באופן משמעותי עם הקדמה של טכניקות מתוקננת ואוטומטיים.

Introduction

בעשרות השנים האחרונות, פותחו מספר גרסאות ניסיוניות לנתח את המנגנונים פתוגניים שמוביל מחלות אנושיות1,2. כדי להעריך את חומרת המחלה, החוקרים חייבים להעריך את ההשפעה של טיפול וללמוד את הווריאציות אדריכלי cytological, היסטולוגית או הסכום של דלקת3. כדי לבצע על אלה גרסאות ניסיוניות, ניתוח histopathological מפורט נדרשים, לעיתים קרובות השוואה בין דגימות מאתר האנושי4,5.

בנוסף, דגימות האנושית בדרך כלל מעובדים שבוים על ידי מתקני histopathology, מנוסה פתולוגים האנושית דרך סטנדרטית ושיטות histopathological. לעומת זאת, רקמות מאתר בדרך כלל קבוע, מוטבע, נותחו על ידי החוקרים עם ניסיון מוגבל של פרוטוקולים histopathological. האיכות והאמינות של בדיקה histopathological מתחיל עם הכנת קטעי רקמה באיכות גבוהה. מספר גורמים תורמים באופן ביקורתי הגדל או הקטן האיכות של הניתוח הסופי, כולל קיבוע, מאקרוסקופית חלוקתה, עיבוד, שעוות פרפין הטבעה, והטבעה של דגימות6,7.

כל הקטעים מעורבים מניפולציה של המדגם נחשפים שגיאות, כולל שיבוץ ידני של הדגימות ובמידה פחותה יותר, ידני מיקרוטום חלוקתה, מכתים. כיום, התהליך כולו של רקמות מאתר לקראת הערכה היסטולוגית מסתמך על פרוטוקולים של משתנים מעבדה מעבדה ופרוטוקולים ידנית. מטרת מחקר זה היא ליישם מתוקננת פרוטוקולים אוטומטיים כדי להפחית שגיאות ולשינויים בבדיקה histopathological מאתר.

לידע שלנו, נתאר כאן את הפרוטוקולים הראשון בשביל לרקמות אוטומטית לחלוטין עיבוד והטבעה על הערכה היסטולוגית של רקמות מאתר; אלה משמשים באופן שגרתי ביחידות פתולוגיה עבור הבדיקות דגימות תאים של בני. דוגמה מעשית של הכדאיות של השיטה, מודל מאתר של דלקת מעיים נותחה, קרי, המודל קוליטיס כיבית כרונית הנגרמת על ידי הממשל חוזרות ונשנות של לתוספי סודיום סולפט (DSS) מי השתייה8 ,9. ההגדרה ניסיוני מקרוב דומה האדם מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי) מחלות10 מאז שטופלו DSS בעלי חיים מגלים סימנים של דלקת מעיים, למשל, ירידה במשקל, צואה רופף או שלשול ו לקיצור של המעי הגס, כמו גם פיברוזיס 89,,11. כפי שנצפו בחולים אנושיים מחלת המעי הדלקתי, טיפול DSS יוצר קורס מחלה מורכבת. בהקשר זה, הערכות היסטולוגית משוכלל נדרשים להבין את שינוי מעמיק של הארכיטקטורה רקמות. לכן, היישום של הפרוטוקולים שתואר להגברת איכות הכנה מדגם יועיל חוקרים להסתמך על הפרשנות של היסטולוגית וניתוחים immunohistochemical עבור הגדרות ניסיוני מאתר. מאתר ניסיוניות של מחלות האדם המערבים שינויים של האדריכלות רקמות, הנוכחות של רקמת הסלולר לחדור או דלקת ברקמות שונות ואיברים (המעי, המוח, הכבד, העור) יכול להשתמש איכות מוגברת הכנת הדוגמא לבדיקה histopathological.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליכים בבעלי חיים אושרו על-ידי משרד הבריאות (אימות 127/15, 27/13) איטלקית ועקבתי אחר ההנחיות טיפול בבעלי חיים במכון האירופי לאונקולוגיה IACUC (טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה שימוש)

1. קוליטיס כיבית כרונית אינדוקציה על ידי המינהל DSS חוזרות

  1. ומין נפרד התאימה עכברים 2 קבוצות (טיפול DSS לעומת שליטה H2O, לפחות 5 הארנבונים מאותה עכברים לכל קבוצה ניסיונית).
  2. לנהל 2.5% DSS (40 kDa) במי השתייה 7 ימים לקבוצה טיפול ומים לקבוצת הבקרה.
    הערה: מודל זה גורם דלקת מעיים כרונית transmural9.
  3. לאחר 7 ימים, הפסק הטיפול DSS ולתת מים בשתי הקבוצות למשך 14 ימים. חזור על תהליך זה 3 פעמים.
    הערה: ניהול חוזרות של DSS גורם שינויים של רירית המעי הגס מקרוב הדומה מחלת המעי הדלקתי האנושי, קרי, פיברוזיס9.
  4. להקריב עכברים בהתאם לנוהל הסמיכו את IACUC מוסדיים, קרי, על ידי שאיפת2 CO.
  5. פתח צפק והבטן העכבר עם איזמל.
    הערה: עקרות מומלץ אך לא הנדרשת.
  6. להפריד את המעי הגס המעי הדק עם מלקחיים, פינצטה. בלו המעי הגס עם פינצטה וחדים.
    הערה: מדידת אורך המעי הגס (איור 1 א') היא שיטה כדי לקבוע אם קוליטיס בעכברים שטופלו DSS.
  7. לשטוף את המעי הגס בצלוחית עם 10 מ"ל של קר 1 x פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) והקש בעדינות כדי להסיר את החומר הצואתי.

2. מאתר רקמות קיבוע

  1. לטבול כל הדגימה המעי הגס מאתר ב 10 מ"ל של 10% נייטרלי Buffered פורמלין (NBF) ב RT (טמפרטורת החדר).
    הערה: עקרות מומלץ אך לא הנדרשת.
  2. לתקן את הרקמה עבור 18 – 24 h-RT.

3. המעי הגס חלוקתה והכנות רקמות

  1. להסיר רקמות קבוע של המכולה NBF עם פינצטה קטנה, לשים אותם בצלחת פטרי. לשים את המעי הגס על צלחת עבודה אופטים עם פינצטה קטנה.
  2. חותכים נקודתיים קטעים (0.2 ס"מ ל 0.3 ס מ אורך) עם איזמל סטרילי. אורך קטע זה הוא אופטימלי כדי לא לחרוג העובי בקלטת.
  3. להרים קטע המעי הגס אחת עם מלקחיים קטנים (איור 2 א). הוסף מקטע המעי הגס אחד לאחד הפלסטיק קצוות של פרפין orientated הטבעה קלטת עם פינצטה קטנה (איור 2B) בולטות.
  4. חזור על פעולת (3.2 – 3.3) מקטעים הגס 3 נוספים לכל קלטת. למנוע החדרת המקטעים לתוך טיפים בולטות סמוכים, כדי למזער חפיפה של רקמות
  5. סגור בחוזקה את הקלטת על ידי דחיפת בקפידה ארבעת הקצוות (איור 2C). הימנע לסחוט את הרקמה כדי למנוע נזק לרקמות.
  6. הכנס את הרשת לתוך מסגרת תומכת פלסטיק. תווית המסגרת התומכת כדי לזהות את הדגימה. חזור על כל דגימה ביולוגית.

4. ברקמה

  1. הפעל את המעבד אוטומטית על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה (איור 3A, 3B).
  2. לחמם 1 h כדי להבטיח פרפין שעווה נמסה. המתן עד המכשיר מאשרת שהפרפין הוא נמס לגמרי, על ידי התבוננות הנוכחות של הסמל ייעודי (איור 3C).
  3. הכנס כל אוריינטציה קלטת (מכיל דגימות רקמה) ידנית לתוך הסל מתכת שסופקו על-ידי המעבד אוטומטיות (דמות תלת-ממד). במקום הקלטות אנכית על ידי רירית אותם קרוב אחד לשני כדי למטב את תפוסת סל.
  4. סגור את סל מתכת (איור 3E).
  5. פתח את המכסה של התשובה (איור 3F). התשובה היא המקום שבו הסל מוכנס לתוך המכונה. הכנס את הסל הדיור ייעודי של המעבד (איור 3G). . סגור את המכסה של התשובה (איור 3 H)
  6. השתמש במסך המגע במחשב כלי כדי להגדיר פרוטוקול עבודה (איור 3עכשיו). בחר את הרצף של פתרונות, תזמון, טמפרטורה יש ליישם על פי התכנית המפורטת טבלה 1.
  7. להקצות פרוטוקול לפי התשובה המכילה הסל על-ידי לחיצה על סמל מחשב ייעודי (איור 3J). התחל את הפרוטוקול על ידי לחיצה על לחצן ' התחל ' (איור 3 L).
  8. המתן עד המכשיר מאשרת הסוף לפרוטוקול, על ידי התבוננות הנוכחות של הסמל ייעודי על ידי שמיעת הצליל מעורר מגיע מהמכונה.
  9. פתח את המכסה אביק. הסר את הסל המעבד (איור 3 מ').

5. רקמות הטבעה

  1. הפעל את embedder אוטומטית על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה (איור 4A).
  2. לחמם 1 h כדי להבטיח פרפין שעווה נמסה. המתן עד המכשיר מאשרת שהפרפין הוא נמס לגמרי על ידי התבוננות הטמפרטורה של האמבטיה פרפין שמציין את המדחום הפנימי של המכשיר.
  3. העברה ידנית כל הקלטות מעובד מן הסל מעבד אל המדף embedder. כל ארון תקשורת יכול להכיל עד 32 קלטות. (איור 4B, 4 C).
  4. פתח את המכסה embedder הראשי (איור 4C, 4 D, 4E).
  5. השתמש במסך המגע במחשב כלי כדי לאותת לדרג רובוטית מערכת מתלה זה להיות מוכנס (איור 4F).
  6. פתח את המכסה דיור כניסת (איור 4G). הכנס ארון התקשורת הדיור מפרץ צר. כל embedder יכולים להכיל עד 4 ארונות תקשורת בו זמנית (איור 4 H, 4I). . סגור את המכסה דיור כניסת (איור 4J)
  7. השתמש במסך המגע במחשב כלי כדי להתחיל את ההליך ההטבעה, לפי טבלה 2 (איור 4 K).
    הערה: כל מדף קלטות 32 לוקח 45 דקות שיהיה מוטבע.
  8. המתן עד המכשיר מאשרת את הסוף של הפרוטוקול, על ידי התבוננות הנוכחות של הסמל ייעודי (איור 4 L).
  9. הסר את המדף אאוטלט (איור 4 מ'). . סגור את המכסה embedder הראשי
  10. הסר את אבני מוטבע (המכיל את רשתות התמצאות) ארון התקשורת. להעביר בלוקים מוטבע בתוך קופסת קרטון אחסון.

6. מיקרומטר חלוקתה

  1. להפוך על צלחת קירור האזמל הקטן. הגדר את הטמפרטורה בין -8 ו-10 ° C.
  2. הפעל את האמבט במים תרמוסטטי האזמל הקטן, המכיל 2 ל' מים מזוקקים. הגדר את הטמפרטורה של האמבטיה מים בין 42-45 מעלות צלזיוס.
  3. המקום הפרפין מוטבע בלוקים על לוח הקירור. המתן לפחות 5 דקות כדי לאפשר את אבני להתקרר.
  4. לוקחים גוש בניינים אחד מהצלחת קירור ולמקם אותו לתוך המחזיק בלוק מיקרוטום.
  5. הגדר את האזמל הקטן לחתוך עובי 10 מיקרומטר לקצץ גוש על ידי חיתוך זה פי 6-10 מיקרומטר עובי.
  6. לשנות את הגדרת עובי האזמל הקטן מ- 10 מיקרומטר לסעיף 3 מיקרומטר. חתך אחד 3 מיקרומטר עבור Hematoxylin ואאוזין (H & E) מכתים.
  7. לאסוף את סעיף 3 מיקרומטר עם מברשת קטנה. לשים את המקטע מיקרומטר 3 באמבט מים, הנחת אותה בזהירות על פני המים כדי להפחית קמטים רקמות. לאסוף בסעיף רקמות לאמבט מים מבוקרת thermostatically על משטח זכוכית בודד.
    1. אם יש צורך, לחתוך קטעים נוספים.
  8. תווית השקופית זכוכית על-ידי כתיבת זיהוי הדגימה.
  9. הכניסו את השקופיות תנור 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.
  10. מכניסים שקופיות זכוכית ארונות תקשורת עבור ניתוח מיידי או בקופסאות אחסון.

7. hematoxylin והוא מכתים אאוזין (H & E)

  1. . הפעילי את הוספת גוון לסמלים אוטומטית על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה לאפשר האתחול בזרוע רובוטית, על ידי התבוננות השינוי של הבר העמסה על צג המכשיר.
  2. הכנס את השקופיות זכוכית המדף הוספת גוון לסמלים, אנכית הוספת שקופיות עד 30.
  3. תווית המדף עם תג פלסטיק זיהוי (RFID) המתאים תדר רדיו. RFID תיוג היא מערכת זיהוי הנוהל מכתימים נטען לתוך המחשב הוספת גוון לסמלים.
  4. הכנס המתלה הוספת גוון לסמלים. לאפשר את המחשב כדי לטעון באופן אוטומטי ולהתחיל את פרוטוקול מכתימים לפי ההכרה של תג RFID.
    הערה: הפרוטוקול עבור צביעת המטוקסילין מתואר ב- טבלה 3-

8. נוגדן

  1. לבצע immunohistochemical ומלורי trichrome מכתים כפי שתואר לעיל7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניסיוני קוליטיס כיבית כרונית הנגרמת על ידי הממשל חוזרות ונשנות של DSS במי השתייה הוא מודל מאתר של דלקת מעיים מקרוב הדומה מחלת המעי הדלקתי האנושי8,9. איור 1 מתאר את השפעת הטיפול DSS, כולל קולון קיצור (איור 1 א'), שימוש נרחב פרמטר ציון הנוכחות של דלקת הנגרמת DSS, וביטוי חוקן של גנים פרו דלקתיים כולל CXCL10 , tnf ו- mcp-1 (איור 1B). חדירה של תאים דלקתיים היה שיפור משמעותי על ידי טיפול DSS, מראה גיוס של התגובה החיסונית המעי פרופריה. מוסקולריס כפי נותחו על ידי cytofluorimetry (איור 1C).

איור 2 מתארת איך חוקן רקמות למחלקה, יש להוסיף הקלטות מונחה. קלטות אלה עוצבו כך שיכילו רשת עם הבלטת טיפים, המאפשר את ההוספה של הרקמה אנכית עם הכיוון הנכון, קרי, עם לומן בתוך החלק הפנימי של הקיר מבחינה חיצונית וגם מבחינה (איור 2 א, 2 ב, 2 ג ). לאחר הקלטות יהיו סגורים, כיוון הרקמה נשמר על ידי הרשתות, בניגוד מה קורה עם קונבנציונאלי קלטות היסטולוגית (איור 2B).

עיבוד רקמה ביצוע עם מעבד אוטומטית (איור 3 א-3 מ' וטבלה 1), בעת הטבעה הליך זה מבוצע עם embedder אוטומטית (איור 4A-4 מ' ו לטבלה 2). הכלי האחרון, רובוט אוסף הקלטות, dispenses הכמות המדוייקת של פרפין. בסופו של דבר, על ידי שימוש של מיקרוטום, סעיפים נחתכים כל בבלוק פרפין. השקופיות מוכנים ואז ניתוח נוסף.

איור 5 מתאר את הקטעים העיקריים של אוטומטית H & E ההכתמה (איור 5A-5E ו לטבלה 3) איך השקופיות יופיעו לאחר H & E מכתים (איור 5F). איור 6 ו- 7 מראים כיצד היישום לעיבוד ממוכן ופרוטוקולים ההטבעה חריפה להגביר איכות הבדיקות histopathological של דגימות חוקן מאתר. Stainings H & E לדוגמאות שהוכנו עם הפרוטוקולים אוטומטיות נגזר שלא טופלו עכברים (איור 6A) הושוו לאלה של DSS מטופלים עכברים (איור 6B). Histopathological הציונים היו מוערך על ידי הערכת את השינויים של פרמטרים שונים המתרחשים רירית המעי, כולל דלקתיות התאים הסתננות, שינויים אפיתל ושינויים של האדריכלות הרירית כפי שמתואר בטבלה 4. איור 6C מתארת נציג H & E צביעה של רקמת מעי עיבוד ידני, הכלולות בקסטות מסורתיות. ב- איור 7, האיכות של הכנת הרקמה מאתר והטבעה לבצע באמצעות מכשירים אוטומטיים בנוסף אושר ע י IHC כתמים CD20 ומלורי trichrome מכתימים8,9 ב שטיפת המעי הגס קטעים של לא מטופל (איור 7 א, 7 C) ו שטופלו DSS (איור 7 ב, יח 7) עכברים.

איור 8 מתאר את רלוונטיות מעשית של שיטה זו. הדגימות המעי הגס אותו לעבד, מוטבע באופן ידני או דרך שיטות אוטומטיות. כל מדגם (או על הפקד או שטופלו DSS) היה חתוך לחלקים שווים 2 ומעובדים במקביל עם המדריך או עם השיטות אוטומטית. צביעת המטוקסילין היה ואז לבצע הערכה microscopical מלאה לגבי כל הפרמטרים פתולוגיים מיעון שינויים אדריכלות הרירית, צפיפות, תא החיסון לחדור, עובי הרירית, הבלוטות rarefaction בדרך כלל ציין במהלך דלקת מעיים, נאמד עבור כל דגימה, הן עבור המדריך האוטומטי פרוטוקול (איור 8A וטבלה 4). הכנת הדגימות עם פרוטוקול אוטומטיות מותר באופן עקבי הערכת שיעור גבוה יותר של פרמטרים היסטולוגית מאשר השיטה הידנית. בנוסף, בוצע ניתוח נפרד של פרמטרים שונים היסטולוגית (איור 8 ב'). את הארכיטקטורה ואת ההערכה הבזליים לחדור באופן חיובי הושפעו, בעיקר בעכברים אינו מטופל, הכנת הדוגמא עם השיטה האוטומטית.

השיטה אוטומטית עבור מדגם עיבוד והטבעה בשימוש כיום עבור ניתוחים histopathological האנושי יכול להיות מיושם בהצלחה לניתוח של דגימות מאתר. דגימות באיכות גבוהה נוצרים בשיטה אוטומטית המדגים את העליונות על פני השיטה ידנית את ההערכה של האדריכלות, לחדור המערכת החיסונית הבזליים של רקמות חוקן מאתר.

Figure 1
איור 1: דלקת מעיים כרונית הערכה. (א) מדידת אורך המעי הגס. (B) מעי ביטוי של גנים פרו-דלקתיים (cxcl10, tnf, mcp-1) ב שטופלו DSS (שחור ברים, n = 12) ואני מטופל עכברים (לבן ברים, n = 6). (ג) Immunophenotyping של המעי הגס פרופריה. מוסקולריס תאי שטופלו DSS (סגור סמלים, n = 12) ואני מטופל עכברים (פתח סמלים, n = 6). CD11b + Ly6G + נויטרופילים, CD11b + F4 / 80 + מקרופאגים (החלונית הימנית), CD4 + ו CD8 + T תאים (לוח נכון) בחדירת פקדים (פתח סמלים, n = 10) ועכברים שטופלו DSS (סגור סמלים, n = 10). מובהקות סטטיסטית מחושב באמצעות Wilcoxon מתאימים-זוגות חתם על מבחן t דרגה. p ≤ 0.05 * * p ≤ 0.01. זאת אומרת ± ערך SEM מדווחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תיאור של הכנת הדוגמא. (א) כלים הדרושים עבור רקמות והכנה צילמתי הקלטת orientated, לחן קלטת חיצוני (לבן), רשת פנימית עם extruded התמצאות טיפים. (ב, ג) החדרת נקודתיים מאתר ברשתות פנימיות של הקלטת לפני (B), לאחר סגירה (C) של הרשתות. בחלונית B מתואר הקלטת orientated (משמאל) או קלטת מסורתי (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תיאור של עיבוד ממוכן. (A, B) אוטומטי מעבד. (ג) סמל המתארת פרפין הנכון נמס בטמפרטורה. (D, E) החדרת בקלטת סל מתכת (D) ו הסגר שלה (E). (F, G, H) ההכנסה של סל מתכת בהתשובה. (אני, J, K) מבחר של פרוטוקול עיבוד. ריצה (L) של הפרוטוקול. (ז) הסרה של הטופס סל התשובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תיאור של הטבעה אוטומטיות . (א) לצלם embedder אוטומטי. (ב, ג) החדרת הקלטות בארון. (D, E) הפתיחה (D) ו- (E) סגירת המכסה. האיתות (F) אל המכונה נוכחות של ארון תקשורת. (G, H) ההכנסה של ארון התקשורת לתוך מפרץ צר הדיור. (אני, J) סגירת המכסה. התחלה (K) של הפרוטוקול ההטבעה. (L) פתיחת המכסה דיור עודפים. (ז) הסרה של הטופס מתלה הדיור עודפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: תיאור של הוספת גוון לסמלים H & E אוטומטית. (א) תמונה של בעל שקופיות. (ב, ג) ההכנסה של בעל שקופיות במכונה. (ד) הסגירה של המכונה. התחלה (E) של הפרוטוקול מוכתמים. (F) תמונה Exemplificative של שקופית אחרי חיתוך מיקרוטום ו H & E מכתים. לוח נכון, H & E מכתים המתארים את כיוון הדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: stainings H & E דוגמאות חוקן של יוצרים עכברים אינו מטופל ומטופל -DSS. צביעת המטוקסילין של לא מטופל (A) ודוגמאות שטופלו DSS (B) מוכן (מעובד, מוטבע, צבעונית) עם אוטומטי (A, B) או בשיטות ידניות (C). סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: מלורי trichrome (A, B) ו- IHC stainings של הסתננות CD20 + תאים (C, D) של מטופל (A-C) ומטופל DSS (B, D) עכברים. מלורי מכתים: כחול, קולגן, ורוד כהה, גרעינים, אדום כהה, הציטופלסמה. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: השוואה בין ניתוח histopathologic עם פרוטוקולים ידניים ואוטומטיים. (א) הכולל histopathological פרמטרים למהירים בכל המדורים מוכנים עם המדריך (ברים לבנים) או עם השיטה האוטומטית (ברים סגול). (B) אחוז הפרמטרים המצוינים הדגימות מוכן עם המדריך (ברים לבנים) או בשיטה אוטומטית (ברים סגול) ללא טיפול (ברים רגיל) או עכברים שטופלו DSS (ברים מנוקד). מובהקות סטטיסטית מחושב באמצעות Wilcoxon מתאימים-זוגות חתם על מבחן t דרגה. p < 0.05; p < 0.005. זאת אומרת ± ערך SEM מדווחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מגיב הזמן (דקות) טמפרטורה (° C) לחץ
NBF 1 RT אמביינט
אתנול 95% 1 RT אמביינט
אתנול 95% 1 RT אמביינט
אתנול 95% 1 RT אמביינט
אתנול מוחלטת 1 45 אמביינט
אתנול מוחלטת 11 45 אמביינט
אתנול מוחלטת 30 RT אמביינט
קסילן 1 RT אמביינט
קסילן 1 45 אמביינט
קסילן 28 45 אמביינט
פרפין 5 65 ואקום

טבלה 1: אוטומטי רקמות עיבוד פרוטוקול.

פעולה ורצונו על ידי הרובוט עבור כל קלטת
להסיר קלטת אחת מן המדף
לזהות את הקלטת
מראש בחום העובש
מניחים את הקלטת על העובש מחומם מראש
לוותר על כמות פרפין בקלטת
לצנן את התבנית
לאפשר פרפין לגבש
הסר את הבלוק פרפין הקרושה העובש
להציג את הבלוק כדי איכות חיישנים
המקום הפרפין לחסום את הדלת פלט

טבלה 2: אוטומטי הטבעה פרוטוקול.

קטגוריה קריטריון הגדרה ציון ערך
לחדור לתא דלקתי חומרת (צפיפות ליקוציט פרופריה. מוסקולריס באזור חדרה ב הערכה hpf) אין 0
מינימלי חריפה (< 10%) 0.25
קלה כרונית (10-25%, פזורים נויטרופילים) 0.5
בינוני כרונית (26 – 50%) 0.75
מסומן (> לחדור 51%, צפוף) 1
במידה (הרחבת ליקוציט חדירה) הרירית 0.5
הרירית ו submucosal 0.75
שינויים אפיתל היפרפלזיה (לודיג תא אפיתל מספרים באולמות האורך, כמו בקריפטה אלונגציה) היפרפלזיה אין 0
מינימלי (< 25%) 0.25
מתון (26 – 35%) 0.5
בינוני (36%-50%, mitoses בשליש העליון של האפיתל קריפטה) 0.75
מסומן (> 51%, mitoses בתוך האפיתל קריפטה רחוקים מן קריפטה הבסיס) 1
איבוד תאים בגביע (הפחתה של מספרי הטלפון הנייד גביע ביחס בסיסית מספרי הטלפון הנייד גביע לכל קריפטה) אין הפסד 0
מינימלי (< 25%) 0.25
מתון (26 – 35%) 0.5
בינוני (36-50%) 0.75
מסומן (> 51%) 1
אדריכלות הרירית כיבי (אפיתל פגם לכת מעבר muscolaris mucosae) אין כיבים 0
כיבים 0.25
רקמות פרור (תיקון רקמת חיבור עם נימים חדשים, מוקף הסתננות התאים, מתעצם אזורים) אין רקמות פרור 0
רקמות פרור 0.25
עומק עובי הרירית , קריפטה אין עיבוי 0
עיבוי 0.5
הבלוטות rarefaction אין rarefaction 0
Rarefaction 0.5
דיספלזיה ללא דיספלזיה 0
דיספלזיה 0.5
מקסימום הניקוד 6

טבלה 3: אוטומטי מכתים פרוטוקול.

פעולה ורצונו מאת הוספת גוון לסמלים עבור כל שקופית מגיב הזמן (s) טמפרטורה (° C)
Essicate 180 60
Essicate 180 60
Deparaffinize קסילן 120 RT
Deparaffinize קסילן 120 RT
מימה אתנול 96% 120 RT
מימה אתנול 96% 120 RT
לשטוף Wtaer מזוקקים 240 RT
כתם Hematoxylin Hematoxylin של Carazzi 540 RT
שטיפה מי ברז 360 RT
Eosin כתם אאוזין Y 1% פתרון aqueos 60 RT
שטיפה מי ברז 120 RT
מייבשים אתנול 96% 20 RT
מייבשים אתנול 96% 20 RT
מייבשים אתנול מוחלטת 15 RT
מייבשים אתנול מוחלטת 15 RT
ברור קסילן 30 RT
ברור קסילן 30 RT

טבלה 4: הניקוד הערכה על ההערכה של דלקת מעיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מנצלים את השלבים אוטומטיות שונות במהלך ההכנות של רקמות מאתר ניתוח histopathologic. פרוטוקול זה מכוון לספק רמזים טכני כדי להגדיל את הפארמצבטית ותקינה של התהליך כולו, ובכך שיפור האיכות הכוללת של הערכת histopathological הסופי. אנחנו ליישם כלים אוטומטיים ושיטות ההכנה והטבעה של רקמות, בשימוש שגרתי פתולוגיה במתקני הליבה לצורך המחקר דגימות תאים של בני.

כדי להדגים את הישימות פוטנציאלי של שיטה זו, בחרנו כרונית קביעה ניסויית מאתר של דלקת מעיים, הנקרא מודל DSS-induced קוליטיס כיבית כרונית. הגדרה זו דומה הקורס מחלה מורכבת נצפתה בחולים מחלת המעי הדלקתי, המחייב הערכה היסטולוגית משוכללת כדי לחקור את השינוי עמוקה של האדריכלות רקמות המתרחשות בעת דלקת מעיים כרונית. בסך הכל הערכה היסטולוגית של תהליכים אלה אולי נהנים מאוד באיכות ההכנה מדגם מוגברת. לציין, פרוטוקול זה ניתן להחיל לרקמות אחרות מאתר (קרי, טחולים, בלוטות הלימפה, כבד, מוח), כאשר ההבדל היחיד להיות כי בקלטת אוריינטציה נחוצה בשביל לרקמות ללא לומן.

התצפית הכי חשוב זה היה הירידה של שגיאות, (דהיינו, הכיוון של המדגם) לאור השימוש של קלטות עם רשתות חיסול של קלטת פתיחה מחדש להטבעת (שלב מתבצע בדרך כלל במהלך ידני פרוטוקולים), משופר בחריפות את הפארמצבטית הכוללת של הניתוח. עם הפרוטוקול המתואר כאן, המדגם מטופל רק בתחילת ההכנה, כאשר הנסיין מוסיף הרקמה הקלטות orientated. לאחר סגורים, הקלטות לעולם אינם נפתח מחדש, ובכך להבטיח שמירה על הכיוון הנכון והפחתת שגיאות3,11. סטנדרטיזציה של אלה שני שלבים קריטיים משופרת איכות כל הניתוחים הבאים וירידה במספר הדגימות שאבדו או לא למהירים, בעיות שניהם מקושרים כדי לפתוח מחדש בקלטת או בכיוון הלא נכון של המדגם3 ,11.

הצלחנו גם להערכת אירוע ביולוגי מורכבים כגון פיברוזיס (איור 7), כי היא לעיתים קרובות מאוד underestimated במודלים מאתר של דלקת מעיים ניסיוני, בעקבות יישום פרוטוקול אוטומטית. במהלך הסידור של הפרוטוקול, אנחנו לגמרי סטנדרטית פרטים טכניים כגון זמן קיבעון, שבו הבנו לא יעלה על 24 שעות כדי למנוע שינויים ברקמות. בעשותם כך, אנו לשמור על האיכות של ניתוחים immunohistochemical הבאים.

השיטה אוטומטית משופרת הערכת פרמטרים אלה קשור משינוי של האדריכלות רקמות, בעיקר בעכברים ללא טיפול. ואכן, ההשוואה הנכונה של רקמה פתולוגי עם להשלמה בריאה חשוב באופן ביקורתי ההערכה הסופית של דגם ניסיוני3.

בנוגע עיבוד רקמה, בדקנו פרוטוקולים שונים כדי להפעיל את המעבד אוטומטיות הזמינות במעבדה. הפרוטוקול המתואר כאן נתן קול ועקביים מאוד תוצאות. אנחנו גם מיושם לאורך זמן עבור הפרוטוקול. מאז דגימות מאתר היו המקבילה האנושית דגימות biopsic קטן בגודל, פרוטוקול קצר הספיק לעבד מאתר (מעיים, במקרה זה) ברקמות. בסופו של דבר, ההליך אוטומטית כל להפחית את הזמן ניסיוני הכולל. מההתחלה של עיבוד מיקרוטום חיתוך, הכנת פרוסות, אנחנו מחושב כי הזמן הכולל הנדרש הוא 5 שעות. להפך, בהתאם היכולת הטכנית של המפעיל, השלמת באותם הפרוטוקולים ידנית ניתן לדרוש יותר להכפיל את כמות הזמן, במיוחד במהלך העיבוד, את ההטמעה. מגבלה אחת של הטכניקה היא שזה דורש מעבדים אוטומטיות של embedder שיש לבצע כדי להיות במעבדה.

לסיכום, אנו מאמינים כי המימוש של פרוטוקולים אוטומטיים אלה יכול במידה רבה דהוא העבודה של חוקרים translational העוסקים מאתר ניסיוניות של מחלות האדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים המחלקה לפתולוגיה של החולים פוליקליניקו (policlinico) IRCCS, מילאנו לתמיכה טכנית, המתקן חיה IEO לסיוע בגידול בעלי חיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10x SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1x Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  6. Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. , New York, N.S.N.Y. (2010).
  7. Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 143 histopathological וניתוח מודלים מאתר אוטומציה הטמעת מערכת סטנדרטיזציה מאתר דגימות מעיים

Erratum

Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

באמצעות מערכות רובוטיות כדי לעבד ולהטביע דגימות מאתר חוקן עבור ניתוחים היסטולוגית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cribiù, F. M., Burrello, C.,… More

Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter