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Immunology and Infection

रोबोट प्रणालियों का उपयोग करने के लिए प्रक्रिया और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए बृहदांत्र Murine नमूने एंबेड

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58654
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 3,4, 1, 2
1Pathology Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology, 3Gastroenterology and Endoscopy Unit, Fondazione IRCCS Cà Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 4Department of Pathophysiology and Transplantation, Università degli Studi di Milano
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

murine ऊतक प्रसंस्करण के लिए मानकीकरण की कमी के रूप में मानव नमूनों की तुलना में murine histopathological विश्लेषण की गुणवत्ता कम कर देता है । यहां, हम murine सूजन और uninflamed बृहदांत्र ऊतकों की histopathological परीक्षा प्रदर्शन करने के लिए नियमित रूप से प्रसंस्करण और मानव नमूनों embedding के लिए इस्तेमाल किया रोबोट प्रणालियों की व्यवहार्यता दिखाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

मानव रोगों की समझ बहुत पशु मॉडलों के अध्ययन के लिए धंयवाद विस्तार किया गया है । बहरहाल, प्रयोगात्मक मॉडल के histopathological मूल्यांकन के रूप में कठोर है कि मानव नमूनों के लिए आवेदन के रूप में की जरूरत है । दरअसल, विश्वसनीय और सटीक निष्कर्ष ड्राइंग गंभीर रूप से ऊतक अनुभाग तैयारी की गुणवत्ता से प्रभावित है । यहां, हम murine ऊतकों के histopathological विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि प्रक्रिया के दौरान कई स्वचालित कदम लागू करता है, प्रारंभिक तैयारी से murine नमूनों की आयल embedding के लिए । स्वचालित प्रक्रियाओं से कठोर प्रोटोकॉल मानकीकरण के माध्यम से methodological चर की कमी murine रोग विश्लेषण की समग्र विश्वसनीयता में वृद्धि करने के लिए योगदान देता है । विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल स्वचालित प्रसंस्करण और एंबेडिंग रोबोट प्रणालियों के उपयोग का वर्णन, नियमित रूप से ऊतक प्रसंस्करण और मानव नमूनों की आयल embedding के लिए इस्तेमाल किया, आंतों की सूजन के murine नमूनों की प्रक्रिया । हम निष्कर्ष है कि murine ऊतकों की histopathological परीक्षा की विश्वसनीयता मानकीकृत और स्वचालित तकनीक की शुरूआत पर काफी बढ़ जाती है ।

Introduction

पिछले दशकों में, कई प्रयोगात्मक मॉडल मानव रोगों के लिए अग्रणी रोगजनक तंत्र काटना करने के लिए विकसित किया गया है1,2. आदेश में एक रोग की गंभीरता का आकलन करने के लिए, शोधकर्ताओं ने एक इलाज के प्रभाव का मूल्यांकन करना होगा और कोशिकाविज्ञान और ऊतकवैज्ञानिक स्थापत्य विविधताओं या सूजन की मात्रा3का अध्ययन । उन प्रयोगात्मक मॉडल पर प्रदर्शन करने के लिए, विस्तृत histopathological विश्लेषण की जरूरत है, अक्सर murine और मानव नमूने की तुलना4,5.

इसके अतिरिक्त, मानव नमूने सामांयतः संसाधित और मानकीकृत histopathological मानदंड और तरीकों के माध्यम से histopathology कोर सुविधाओं और अनुभवी मानव पैथोलॉजिस्ट द्वारा बनाए गए हैं । इसके विपरीत, murine ऊतकों आमतौर पर तय कर रहे हैं, एंबेडेड और histopathological प्रोटोकॉल के सीमित अनुभव के साथ शोधकर्ताओं ने विश्लेषण किया । गुणवत्ता और histopathological परीक्षा की विश्वसनीयता उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक वर्गों की तैयारी के साथ शुरू होता है । कई कारकों समीक्षकों को बढ़ाने या निर्धारण, macroscopic अनुभाग, प्रसंस्करण, आयल embedding, और6,7के embedding सहित अंतिम विश्लेषण की गुणवत्ता में कमी करने के लिए योगदान करते हैं ।

नमूने के हेरफेर को शामिल इन सभी अंश मैनुअल त्रुटियों के अधीन हैं, नमूनों की मैनुअल embedding सहित और, एक हद तक कम करने के लिए, मैनुअल microtome अनुभाग और धुंधला । वर्तमान में, ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन के लिए murine ऊतक तैयार करने की पूरी प्रक्रिया प्रोटोकॉल है कि प्रयोगशाला से प्रयोगशाला और मैनुअल प्रोटोकॉल के लिए बदलती है पर निर्भर करता है । इस अध्ययन का लक्ष्य murine histopathological परीक्षा में त्रुटियों और परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए मानकीकृत स्वचालित प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए है ।

हमारे ज्ञान के लिए, हम यहां पूरी तरह से स्वचालित ऊतक प्रसंस्करण और murine ऊतकों के ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन के लिए embedding के लिए पहली प्रोटोकॉल का वर्णन; मानव नमूनों के विश्लेषण के लिए इन पैथोलॉजी इकाइयों में नियमित रूप से उपयोग किया जाता है । विधि की व्यवहार्यता का एक व्यावहारिक उदाहरण के रूप में, आंतों की सूजन का एक murine मॉडल का विश्लेषण किया गया है, यानी, जीर्ण कोलाइटिस मॉडल पीने के पानी में dextran सोडियम सल्फेट (DSS) के दोहराया प्रशासन की वजह से8 ,9. इस प्रयोगात्मक सेटिंग बारीकी से मानव भड़काऊ आंत्र रोगों (आईबीडी)10 के बाद से जैसा दिखता है DSS-इलाज जानवरों आंतों की सूजन के लक्षण प्रदर्शन, जैसे, वजन घटाने, ढीला मल या दस्त, और बृहदांत्र के साथ ही फाइब्रोसिस का छोटा 8,9,11. के रूप में मानव आईबीडी रोगियों के लिए मनाया, DSS उपचार एक जटिल रोग पाठ्यक्रम उत्पन्न करता है । इस संदर्भ में, विस्तृत ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन ऊतक वास्तुकला के गहन परिवर्तन को समझने के लिए आवश्यक हैं । इस प्रकार, नमूना तैयारी की गुणवत्ता में वृद्धि के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का कार्यांवयन murine प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए ऊतकवैज्ञानिक और immunohistochemical विश्लेषण की व्याख्या पर निर्भर शोधकर्ताओं को लाभ हो सकता है । Murine मानव रोगों के प्रयोगात्मक मॉडल ऊतक वास्तुकला के परिवर्तन शामिल, सेलुलर ऊतक घुसपैठ या विभिन्न ऊतकों और अंगों में सूजन की उपस्थिति (आंत, मस्तिष्क, जिगर, त्वचा) की वृद्धि की गुणवत्ता का उपयोग कर सकते histopathological परीक्षा के लिए सैंपल तैयार ।

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Protocol

पशु प्रक्रियाओं इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा अनुमोदित (प्रमाणन. 127/15, 27/13) और ऑन्कोलॉजी IACUC के यूरोपीय संस्थान के पशु देखभाल दिशानिर्देश (संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति) के बाद किया गया

1. दोहराव DSS प्रशासन द्वारा क्रोनिक कोलाइटिस प्रेरण

  1. अलग आयु और सेक्स 2 समूहों में चूहों मिलान (उपचार DSS बनाम नियंत्रण एच2ओ, प्रयोगात्मक समूह के अनुसार कम से कम 5 चूहों littermates).
  2. प्रशासन ने पीने के पानी में २.५% DSS (४० केडीए) को ट्रीटमेंट ग्रुप और वॉटर को कंट्रोल ग्रुप को 7 दिनों के लिए.
    नोट: यह मॉडल एक पुरानी transmural आंत्र सूजन9लाती है ।
  3. 7 दिनों के बाद DSS ट्रीटमेंट रोकें और 14 दिनों तक दोनों समूहों को पानी दें । इस प्रक्रिया को 3 बार दोहराएं ।
    नोट: DSS के दोहराव प्रशासन कालोनी म्यूकोसा के परिवर्तन लाती है बारीकी से मानव आईबीडी, यानी, फाइब्रोसिस9जैसी ।
  4. चूहों को संस्थागत IACUC द्वारा प्राधिकृत प्रक्रियाओं के अनुसार बलिदान, यानी, सह द्वारा2 साँस लेना.
  5. एक स्केलपेल के साथ माउस पेट और आँख खोलो ।
    नोट: बांझपन की सिफारिश की लेकिन सख्ती की आवश्यकता नहीं है ।
  6. छोटी आंत से संदंश और चिमटी के साथ बृहदांत्र अलग । आंतों को चिमटी और संदंश के साथ एक्साइज करें ।
    नोट: बृहदांत्र लंबाई माप (1a आंकड़ा) DSS-इलाज चूहों में हुई अगर कोलाइटिस निर्धारित करने के लिए एक विधि है ।
  7. ठंडे 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर के साथ एक पेट्री डिश में बृहदांत्र कुल्ला और धीरे से मल सामग्री को हटाने के लिए प्रेस ।

2. Murine ऊतकों निर्धारण

  1. आरटी (कमरे के तापमान) में 10% तटस्थ buffered Formalin (NBF) के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक murine बृहदांत्र नमूना विसर्जित कर दिया ।
    नोट: बांझपन की सिफारिश की लेकिन सख्ती की आवश्यकता नहीं है ।
  2. के लिए ऊतक ठीक 18 – RT पर 24 ज.

3. बृहदांत्र अनुभाग और ऊतक तैयार

  1. छोटे चिमटी के साथ NBF कंटेनर से निश्चित ऊतकों को निकालें और एक पेट्री डिश में डाल दिया । छोटी चिमटी के साथ एक खोदी काम प्लेट पर बृहदांत्र रखो ।
  2. टुकड़ों में कटौती कालोनियों (०.२ cm to ०.३ cm लंबाई) एक बाँझ स्केलपेल के साथ. इस टुकड़े की लंबाई के लिए कैसेट की मोटाई से अधिक नहीं इष्टतम है ।
  3. छोटी चिमटी (चित्रा 2a) के साथ एक बृहदांत्र खंड उठाओ । छोटे चिमटी (चित्रा बी) के साथ केंद्रित आयल एंबेडिंग कैसेट के प्लास्टिक फैलाने युक्तियों में से एक में एक बृहदांत्र खंड डालें ।
  4. दोहराएं आपरेशन (3.2-3.3) एक अतिरिक्त 3 बृहदांत्र प्रति क्षेत्रों कैसेट के साथ । आसन्न फैलाई युक्तियों में सेगमेंट डालने से बचें, ऊतकों के अतिव्यापी को कम करने के लिए
  5. कसकर चार किनारों (चित्रा 2c) को ध्यान से धकेल कर कैसेट को बंद करें. ऊतक नुकसान को रोकने के ऊतकों निचोड़ से बचें ।
  6. एक प्लास्टिक समर्थन फ्रेम में ग्रिड डालें । नमूना पहचानने के लिए समर्थन फ़्रेम को लेबल करें । प्रत्येक जैविक नमूना के लिए दोहराएँ ।

4. ऊतक प्रसंस्करण

  1. पावर बटन (चित्रा 3, बी) धक्का द्वारा स्वचालित प्रोसेसर पर बारी ।
  2. 1 एच के लिए गर्म करने के लिए आयल मोम पिघलना सुनिश्चित करते हैं । साधन की पुष्टि करता है जब तक रुको आयल पूरी तरह से पिघला हुआ है, समर्पित आइकन की उपस्थिति को देख कर (चित्रा 3सी).
  3. डालें प्रत्येक उंमुख कैसेट (ऊतक नमूनों युक्त) मैंयुअल रूप से धातु टोकरी में स्वचालित प्रोसेसर (चित्रा 3 डी) द्वारा प्रदान की । एक दूसरे को टोकरी अधिभोग का अनुकूलन करने के लिए उंहें एक के करीब अस्तर द्वारा खड़ी कैसेट रखें ।
  4. मेटल की टोकरी (figure 3E) बंद करें ।
  5. (चित्रा 3F) प्रतिक्रिया के ढक्कन खोलो । इस पर नाराजगी उस जगह है जहां टोकरी मशीन में डाली गई है । प्रोसेसर के समर्पित आवास में टोकरी डालें (चित्रा 3 जी) । अपकार (फिगर 3H) का ढक्कन बंद कर दीजिये ।
  6. वर्किंग प्रोटोकॉल (figure 3I) को परिभाषित करने के लिए इंस्ट्रूमेंट कंप्यूटर पर टच स्क्रीन का प्रयोग करें । तालिका 1में दी गई योजना के अनुसार कार्यान्वित किए जाने वाले समाधानों, समय और तापमान के अनुक्रम का चयन करें.
  7. समर्पित कंप्यूटर चिह्न (चित्रा 3J) पर क्लिक करके टोकरी युक्त प्रतिक्रिया पर चलाने के लिए प्रोटोकॉल असाइन करें । स्टार्ट बटन (figure 3L) पर क्लिक करके प्रोटोकॉल को स्टार्ट करें ।
  8. साधन जब तक रुको प्रोटोकॉल के अंत की पुष्टि, समर्पित आइकन की उपस्थिति को देख कर और मशीन से आ रहा अलार्म टोन सुनने के द्वारा ।
  9. अपकार लिड खोलें । प्रोसेसर (चित्रा 3m) से टोकरी निकालें ।

5. ऊतक embedding

  1. पावर बटन (चित्र 4a) को धकेल कर स्वचालित एम्बेडर चालू करें.
  2. 1 एच के लिए गर्म करने के लिए आयल मोम पिघलना सुनिश्चित करते हैं । उपकरण की पुष्टि करता है जब तक इंतजार तेल पूरी तरह से साधन के आंतरिक थर्मामीटर द्वारा संकेत तेल स्नान के तापमान को देख कर पिघला है ।
  3. मैन्युअल रूप से सभी संसाधित कैसेट्स प्रोसेसर बास्केट से एम्बेडर रैक करने के लिए स्थानांतरण । प्रत्येक रैक ३२ कैसेट को शामिल कर सकते हैं । (चित्रा 4B, 4c) ।
  4. मुख्य embedder लिड (आरेख 4c, 4d, 4E) खोलें ।
  5. एक रैक डाला जा रहा है कि रोबोट प्रणाली के लिए संकेत करने के लिए साधन कंप्यूटर पर टच स्क्रीन का प्रयोग करें (चित्रा 4F).
  6. प्रवेश आवास ढक्कन (आंकड़ा 4g) खोलो । प्रवेश आवास में रैक डालें । प्रत्येक embedder में एक साथ 4 रैक होते हैं (फिगर 4H, 4i). प्रवेश आवास ढक्कन बंद (चित्रा 4J) ।
  7. 2 (चित्रा 4k) तालिका के अनुसार, embedding प्रक्रिया शुरू करने के लिए साधन कंप्यूटर पर टच स्क्रीन का प्रयोग करें ।
    नोट: ३२ कैसेट्स के प्रत्येक रैक ४५ मिनट लगते है एंबेडेड हो ।
  8. साधन जब तक रुको प्रोटोकॉल के अंत की पुष्टि, समर्पित आइकन (चित्रा 4L) की उपस्थिति देख कर ।
  9. आउटलेट रैक (चित्रा 4M) निकालें । मुख्य एम्बेडर लिड बंद करें ।
  10. एम्बेडेड ब्लॉक (ओरिएंटेशन ग्रिड युक्त) रैक से निकालें । एंबेडेड ब्लॉक एक भंडारण गत्ता बॉक्स में स्थानांतरण ।

6. माइक्रोमीटर खोदी

  1. microtome की कूलिंग प्लेट को चालू करें । -8 और-10 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान सेट करें ।
  2. microtome के थर्मोस्टेट पानी स्नान पर बारी, आसुत जल के 2 एल युक्त । 42-45 डिग्री सेल्सियस के बीच पानी के स्नान का तापमान निर्धारित करें ।
  3. शीतलक प्लेट पर आयल एंबेडेड ब्लॉक प्लेस । ब्लॉक शांत करने के लिए अनुमति देने के लिए कम से 5 मिनट रुको ।
  4. शीतलन प्लेट से एक ब्लॉक ले लो और यह microtome ब्लॉक धारक में जगह है ।
  5. microtome कट मोटाई को 10 µm पर सेट करें । यह 10 µm मोटाई में 6 बार काटने से ब्लॉक ट्रिम कर दीजिए ।
  6. microtome की मोटाई सेटिंग को 10 µm से 3 µm में बदलें । Hematoxylin और Eosin (एच & ई) धुंधला के लिए एक 3 µm अनुभाग में कटौती ।
  7. एक छोटे ब्रश के साथ 3 µm अनुभाग लीजिए । पानी के स्नान में 3 µm अनुभाग रखो, यह ध्यान से पानी की सतह पर बिछाने के लिए ऊतक झुर्रियों को कम । एक ही गिलास स्लाइड पर thermostatically नियंत्रित जल स्नान से ऊतक अनुभाग लीजिए ।
    1. यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त वर्गों में कटौती ।
  8. नमूना पहचान लिख कर कांच स्लाइड लेबल ।
  9. एक ३७ डिग्री सेल्सियस ओवन में स्लाइड रखो कम से कम 10 मिनट के लिए ।
  10. रैक में तुरंत विश्लेषण के लिए या भंडारण बक्से में ग्लास स्लाइड रखो ।

7. Hematoxylin और Eosin (एच & ई) धुंधला

  1. पावर बटन को पुश करके स्वचालित दाग पर स्विच करें । उपकरण मॉनिटर पर लोडिंग बार के परिवर्तन को देख कर, रोबोट हाथ के आरंभ करने की अनुमति दें ।
  2. कांच की स्लाइड्स को दाग वाले रैक में डालें, 30 स्लाइड तक अनुलंब रूप से संमिलित करें ।
  3. लेबल उपयुक्त रेडियो फ्रीक्वेंसी पहचान (आरएफआईडी) प्लास्टिक टैग के साथ रैक । आरएफआईडी टैगिंग एक सही दाग दाग कंप्यूटर में लोड प्रोटोकॉल की पहचान प्रणाली है ।
  4. दाग में रैक डालें । कंप्यूटर को स्वचालित रूप से लोड और आरएफआईडी टैग की मांयता के अनुसार धुंधला प्रोटोकॉल शुरू करने की अनुमति दें ।
    नोट: एच & ई धुंधला के लिए प्रोटोकॉल तालिका 3 में वर्णित है ।

8. Immunohistochemical धुंधलाना

  1. प्रदर्शन immunohistochemical और Mallory trichrome धुंधला के रूप में पहले वर्णित7।

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Representative Results

पीने के पानी में DSS के दोहराया प्रशासन द्वारा प्रेरित प्रयोगात्मक जीर्ण कोलाइटिस आंत्र सूजन बारीकी से मानव आईबीडी8,9जैसी की एक murine मॉडल है । चित्रा 1 , DSS-प्रेरित सूजन की उपस्थिति स्कोर करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया पैरामीटर, और CXCL10 सहित समर्थक भड़काऊ जीनों की बृहदांत्र अभिव्यक्ति, बृहदांत्र छोटा (आंकड़ा 1a) सहित DSS उपचार के प्रभाव का वर्णन , tnf और एमसीपी-1 (आंकड़ा 1b) । भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ बहुत DSS उपचार द्वारा बढ़ाया गया था, आंत्र लेमिना propria में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की भर्ती के रूप में cytofluorimetry द्वारा विश्लेषण (चित्रा 1C) दिखा ।

चित्रा 2 दर्शाया गया है कि कैसे बृहदांत्र ऊतकों को खोदी और उंमुख कैसेट में डाला जाता है । इन कैसेटों को बाहर निकाला युक्तियों के साथ एक ग्रिड को शामिल करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, अनुमति ऊतक के सम्मिलन के साथ खड़ी है और उचित अभिविन्यास के साथ, यानी, भीतरी भाग में लुमेन के साथ और दीवार बाहरी (चित्रा 2a, 2 बी, 2c ). एक बार कैसेट बंद कर रहे हैं, ऊतक उंमुखीकरण ग्रिड द्वारा संरक्षित है, क्या पारंपरिक ऊतकवैज्ञानिक कैसेट (चित्रा बी) के साथ होता है के विपरीत ।

ऊतक प्रसंस्करण एक स्वचालित प्रोसेसर के साथ किया जाता है (चित्रा 3ए-3m और तालिका 1), जबकि embedding प्रक्रिया एक स्वचालित embedder (चित्रा 4a-4M और 2 तालिका) के साथ किया जाता है । उत्तरार्द्ध साधन में, एक रोबोट कैसेट एकत्र करता है और आयल की सही मात्रा में तिरस्कृत करता है । अंत में, एक microtome का उपयोग करके, वर्गों प्रत्येक तेल ब्लॉक से काट रहे हैं । इसके बाद आगे के विश्लेषण के लिए स्लाइड तैयार की जाती है ।

चित्रा 5 स्वचालित एच & ई धुंधला (चित्रा धारा 5-5E और तालिका 3) के मुख्य अंश का वर्णन करता है और कैसे स्लाइड एच & ई धुंधला (चित्रा 5F) के बाद दिखाई देते हैं । चित्रा 6 और 7 शो कैसे स्वचालित प्रसंस्करण और embedding प्रोटोकॉल के कार्यांवयन दृढ़ता से murine बृहदांत्र नमूनों की histopathological विश्लेषण की गुणवत्ता में वृद्धि । एच & ई अनुपचारित चूहों से व्युत्पंन स्वचालित प्रोटोकॉल के साथ तैयार नमूनों के दाग (चित्रा 6A) DSS चूहों का इलाज किया (चित्रा घमण्ड) की तुलना में थे. Histopathological स्कोर आंत्र म्यूकोसा में होने वाले विभिन्न मापदंडों के संशोधनों का मूल्यांकन करके मूल्यांकन किया गया था, जिसमें भड़काऊ कोशिका घुसपैठ, उपकला परिवर्तन और श्लैष्मिक वास्तुकला के परिवर्तन शामिल हैं तालिका 4. चित्रा 6C एक प्रतिनिधि एच & एक बृहदांत्र ऊतक के धुंधला और मैंयुअल रूप से संसाधित पारंपरिक कैसेट में शामिल दर्शाया गया है । चित्रा 7में, murine ऊतक तैयार करने और स्वचालित उपकरणों के माध्यम से प्रदर्शन embedding की गुणवत्ता इसके अतिरिक्त CD20 और Mallory trichrome धुंधला8,9 में से आइएचसी के दाग की पुष्टि की थी अनुपचारित के वर्गों (चित्रा 7A, 7C) और DSS-इलाज (चित्रा 7B, 7d) चूहों ।

चित्रा 8 इस विधि की व्यावहारिक प्रासंगिकता का वर्णन करता है । एक ही बृहदांत्र नमूने संसाधित और या तो मैंयुअल रूप से या स्वचालित तरीकों के माध्यम से एंबेडेड थे । प्रत्येक नमूने (या तो नियंत्रण या DSS-इलाज) 2 बराबर भागों में काट दिया गया था और मैनुअल के साथ या स्वचालित तरीकों के साथ समानांतर में संसाधित । एच & ई धुंधला तो प्रदर्शन किया गया था और एक पूरा microscopical मूल्यांकन श्लैष्मिक वास्तुकला में परिवर्तन को संबोधित सभी रोग मापदंडों के विषय में, दानेदार, प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ, श्लैष्मिक मोटाई, ग्रंथियों rarefaction सामान्य रूप से आंतों की सूजन के दौरान मनाया, दोनों मैनुअल और स्वचालित प्रोटोकॉल (चित्रा 8A और तालिका 4) के लिए प्रत्येक नमूने के लिए मूल्यांकन किया गया था । स्वचालित प्रोटोकॉल के साथ नमूनों की तैयारी लगातार मैनुअल विधि से ऊतकवैज्ञानिक मापदंडों के एक उच्च अनुपात के मूल्यांकन की अनुमति दी । साथ ही, अलग ऊतकवैज्ञानिक पैरामीटर का एक अलग विश्लेषण किया गया (आरेख 8B) । वास्तुकला और बेसल घुसपैठ मूल्यांकन सकारात्मक, विशेष रूप से अनुपचारित चूहों में, स्वचालित विधि के साथ नमूना तैयारी से प्रभावित थे ।

नमूना प्रसंस्करण और वर्तमान में मानव histopathological विश्लेषण के लिए इस्तेमाल embedding के लिए स्वचालित विधि सफलतापूर्वक murine नमूनों के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है । उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों स्वचालित विधि है कि वास्तुकला के आकलन में मैनुअल विधि पर श्रेष्ठता को दर्शाता है और बेसल murine बृहदांत्र ऊतकों की प्रतिरक्षा घुसपैठ के साथ उत्पंन कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: जीर्ण आंत्र सूजन मूल्यांकन । (क) बृहदांत्र लंबाई माप । (ख) समर्थक भड़काऊ जीन के बृहदांत्र अभिव्यक्ति (cxcl10, tnf, एमसीपी-1) DSS में इलाज (काली सलाखों, n = 12) और अनुपचारित चूहों (सफेद सलाखों, n = 6) । (ग) DSS-स्वास्थ्यकर्मी (बंद प्रतीकों, n = 12) और अनुपचारित चूहों (खुले प्रतीकों, n = 6) में Immunophenotyping लेमिना propria कोशिकाओं का विसर्ग । CD11b + Ly6G + न्यूट्रोफिल, CD11b + F4/80 + मैक्रोफेज (बाएं पैनल), CD4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं (दाहिने पैनल) नियंत्रण में घुसपैठ (खुला प्रतीकों, n = 10) और DSS-इलाज चूहों (बंद प्रतीकों, एन = 10). सांख्यिकीय महत्व Wilcoxon मिलान-जोड़े हस्ताक्षरित रैंक टी परीक्षण का उपयोग कर गणना की गई थी । * p ≤ ०.०५ * * p ≤ ०.०१. मतलब मूल्य ± SEM सूचित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: नमूना तैयारी का विवरण । (एक) ऊतक तैयार करने और केंद्रित कैसेट, एक बाहरी कैसेट (सफेद) और बाहर निकाला अभिविंयास सुझावों के साथ आंतरिक ग्रिड द्वारा रचित की तस्वीर के लिए आवश्यक उपकरण । (ख, ग) पहले कैसेट के आंतरिक ग्रिड में murine कालोनियों की प्रविष्टि (ख) और उसके बाद (ग) ग्रिड के बंद । पैनल बी में केंद्रित कैसेट (बाएं) या एक पारंपरिक कैसेट (दाएं) में दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: स्वचालित प्रसंस्करण का विवरण । (A, B) स्वचालित प्रोसेसर । (ग) सही तेल मोम पिघलने तापमान का वर्णन चिह्न । (डी, ई) धातु की टोकरी में कैसेट की प्रविष्टि (डी) और उसके बंद (ई) । (एफ, जी, एच) प्रविष्टि धातु की टोकरी में प्रतिक्रिया । (I, J, K) प्रसंस्करण प्रोटोकॉल का चयन । (एल) प्रोटोकॉल का चल रहा है । (एम) टोकरी के हटाने के नाराजगी का फार्म । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: स्वचालित एंबेडिंग का विवरण . (क) स्वचालित embedder का चित्र. (ख, ग) रैक में कैसेट का सम्मिलन । (डी, ई) (घ) खोलने और ढक्कन के समापन (ङ) । (च) एक रैक की उपस्थिति की मशीन के लिए संकेत । (छ, ज) प्रवेश आवास में रैक के सम्मिलन । (I, J) ढक्कन का समापन । (K) एंबेडिंग प्रोटोकॉल का प्रारंभ । (एल) आउटलेट आवास ढक्कन खोलने । (एम) रैक फार्म आउटलेट आवास को हटाने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: स्वचालित एच & ई दाग का विवरण । (क) स्लाइड धारक का चित्र । (ख, ग) मशीन में स्लाइड धारक की प्रविष्टि । (घ) मशीन का समापन. (ङ) धुंधला प्रोटोकॉल की शुरुआत । (च) microtome काटने और H & E सना के बाद किसी स्लाइड का Exemplificative चित्र । दायां पैनल, एच & ई धुंधला नमूना अभिविंयास चित्रण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एच & बृहदांत्र नमूनों के ई दाग अनुपचारित और DSS-इलाज चूहों फार्म का । H & अनुपचारित का धुंधला होना (a) और DSS-इलाज (b) तैयार किए गए नमूने (संसाधित, एंबेडेड, सना हुआ) स्वचालित (a, B) या मैंयुअल (C) विधियों के साथ । स्केल बार = १०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: Mallory trichrome (a, b) और घुसपैठ के आइएचसी दाग CD20 + कोशिकाओं (सी, डी) के अनुपचारित (a-c) और DSS इलाज (B, d) चूहों. Mallory धुंधला: नीला, कोलेजन, डार्क पिंक, नाभिक, डार्क रेड, कोशिका द्रव्य । स्केल बार = १०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: मैनुअल और स्वचालित प्रोटोकॉल के साथ histopathologic विश्लेषण के बीच तुलना. (क) मैनुअल (सफेद पट्टियों) के साथ या स्वचालित विधि (बैंगनी पट्टियों) के साथ या तो तैयार किए गए सभी अनुभागों में कुल histopathological पैरामीटर assessable हैं. (ख) मैनुअल (सफेद सलाखों) के साथ या अनुपचारित (सादा सलाखों) या DSS-इलाज चूहों (बिंदीदार सलाखों) में स्वचालित विधि (बैंगनी सलाखों) के साथ तैयार नमूनों में संकेत मापदंडों का प्रतिशत । सांख्यिकीय महत्व Wilcoxon मिलान-जोड़े हस्ताक्षरित रैंक टी परीक्षण का उपयोग कर गणना की गई थी । * p < ०.०५; * *p < ०.००५. मतलब मूल्य ± SEM सूचित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मक समय (min) तापमान (° c) दबाव
NBF 1 आरटी परिवेश
इथेनॉल ९५% 1 आरटी परिवेश
इथेनॉल ९५% 1 आरटी परिवेश
इथेनॉल ९५% 1 आरटी परिवेश
निरपेक्ष इथेनॉल 1 ४५ परिवेश
निरपेक्ष इथेनॉल 11 ४५ परिवेश
निरपेक्ष इथेनॉल 30 आरटी परिवेश
Xylene 1 आरटी परिवेश
Xylene 1 ४५ परिवेश
Xylene 28 ४५ परिवेश
आयल वैक्स 5 ६५ वैक्यूम

तालिका 1: स्वचालित ऊतक प्रसंस्करण प्रोटोकॉल ।

प्रत्येक कैसेट के लिए रोबोट द्वारा कार्रवाई perfomed
रैक से एक कैसेट निकालें
पहचानें कैसेट
पूर्व हीट मोल्ड
पूर्व गर्म मोल्ड पर कैसेट प्लेस
कैसेट के लिए आयल की राशि वितरण
मोल्ड नीचे ठंडा
आयल को जमना की अनुमति
मोल्ड से जम गया आयल ब्लॉक हटा
गुणवत्ता सेंसर करने के लिए ब्लॉक प्रस्तुत
निर्गम द्वार में आयल ब्लॉक प्लेस

तालिका 2: स्वचालित एंबेडिंग प्रोटोकॉल ।

श्रेणी कसौटी परिभाषा स्कोर मूल्य
भड़काऊ सेल घुसपैठ गंभीरता (मूल्यांकित hpf में घुसपैठ कर लेमिना propria क्षेत्र का ल्युकोसैट घनत्व) घुसपैठ नहीं 0
न्यूनतम तीव्र (< 10%) ०.२५
हल्के जीर्ण (10-25%, न्यूट्रोफिल बिखरे हुए) ०.५
मध्यम जीर्ण (26 – 50%) ०.७५
चिह्नित (> 51%, घने घुसपैठ) 1
हद (ल्युकोसैट घुसपैठ का विस्तार) श्लैष्मिक ०.५
श्लैष्मिक और सबम्यूकोसल ०.७५
उपकला परिवर्तन हाइपरप्लासिया (अनुदैर्ध्य तहखाने में उपकला कोशिका संख्या में वृद्धि, तहखाना बढ़ाव के रूप में दिखाई) कोई हाइपरप्लासिया 0
न्यूनतम (< 25%) ०.२५
हल्के (26 – 35%) ०.५
मध्यम (36-50%, तहखाना उपकला के ऊपरी तीसरे में mitoses) ०.७५
चिह्नित (> 51%, तहखाना आधार से दूर तहखाने उपकला में mitoses) 1
प्याला सेल नुक्सानः (तहखाना प्रति आधारभूत प्याला कक्ष संख्याओं के सापेक्ष प्याला कक्ष संख्याओं की कमी) कोई नुकसान 0
न्यूनतम (< 25%) ०.२५
हल्के (26 – 35%) ०.५
मध्यम (36-50%) ०.७५
चिह्नित (> 51%) 1
श्लैष्मिक वास्तुकला अल्सर (उपकला दोष muscolaris म्यूकोसा से परे तक पहुँचने) कोई अल्सर 0
अल्सर ०.२५
दानेदार ऊतक (कोशिकाओं, hypertrophied क्षेत्रों घुसपैठ से घिरा हुआ है, नई केशिकाओं के साथ संयोजी ऊतक की मरंमत) कोई दानेदार ऊतक 0
दानेदार ऊतक ०.२५
श्लैष्मिक मोटाई और तहखाना गहराई कोई और अधिक मोटा होना 0
उमड़ना ०.५
ग्रंथियों rarefaction कोई rarefaction 0
Rarefaction ०.५
Dysplasia कोई dysplasia 0
Dysplasia ०.५
अधिकतम स्कोर 6

तालिका 3: स्वचालित दाग प्रोटोकॉल ।

हर स्लाइड के लिए दाग से perfomed एक्शन अभिकर्मक समय (ओं) तापमान (° c)
Essicate १८० ६०
Essicate १८० ६०
Deparaffinize Xylene १२० आरटी
Deparaffinize Xylene १२० आरटी
हाइड्रेट इथेनॉल ९६% १२० आरटी
हाइड्रेट इथेनॉल ९६% १२० आरटी
Wash आसुत wtaer २४० आरटी
दाग Hematoxylin Carazzi की Hematoxylin ५४० आरटी
कुल्ला नल का पानी ३६० आरटी
दाग Eosin Eosin Y 1% aqueos हल ६० आरटी
कुल्ला नल का पानी १२० आरटी
निर्जलीकरण इथेनॉल ९६% 20 आरटी
निर्जलीकरण इथेनॉल ९६% 20 आरटी
निर्जलीकरण निरपेक्ष इथेनॉल 15 आरटी
निर्जलीकरण निरपेक्ष इथेनॉल 15 आरटी
स्पष्ट Xylene 30 आरटी
स्पष्ट Xylene 30 आरटी

तालिका 4: आंतों की सूजन के मूल्यांकन के लिए स्कोरिंग योजना.

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Discussion

हम histopathologic विश्लेषण के लिए murine ऊतकों की तैयारी के दौरान अलग स्वचालित कदम का उपयोग । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य तकनीकी संकेत प्रदान करने के लिए reproducibility और पूरी प्रक्रिया के मानकीकरण बढ़ाने के लिए, इस प्रकार अंतिम histopathological मूल्यांकन की समग्र गुणवत्ता को बढ़ाने । हम स्वचालित उपकरणों और तैयार करने और ऊतकों की embedding, नियमित रूप से मानव नमूनों के अध्ययन के लिए पैथोलॉजी कोर सुविधाओं में इस्तेमाल के लिए तरीकों को लागू किया ।

इस विधि के संभावित प्रयोज्यता को प्रदर्शित करने के लिए, हम आंतों की सूजन की एक पुरानी murine प्रयोगात्मक सेटिंग चुना, DSS-प्रेरित जीर्ण कोलाइटिस मॉडल कहा जाता है । यह सेटिंग जटिल रोग पाठ्यक्रम आईबीडी रोगियों में मनाया जाता है, पुराने आंत्र सूजन पर होने वाली ऊतक वास्तुकला के गहन परिवर्तन की जांच करने के लिए विस्तृत ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन की आवश्यकता होती है जैसा दिखता है । कुल मिलाकर, इन प्रक्रियाओं के ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन बहुत बढ़ा नमूना तैयारी की गुणवत्ता से लाभ हो सकता है । ध्यान दें, इस प्रोटोकॉल अंय murine ऊतकों को लागू किया जा सकता है (यानी, तिल्ली, लिम्फ नोड्स, जिगर, मस्तिष्क), केवल अंतर है कि उंमुख कैसेट एक लुमेन के बिना ऊतकों के लिए की जरूरत नहीं है के साथ ।

सबसे महत्वपूर्ण प्रेक्षण था कि मैनुअल त्रुटियों की कमी है, (यानी, नमूने के उंमुखीकरण) ग्रिड और कैसेट पुनः के उंमूलन के साथ कैसेट का उपयोग करने के लिए खोलने की दी एंबेडिंग (एक कदम सामांयतः मैनुअल के दौरान प्रदर्शन प्रोटोकॉल), दृढ़ता से विश्लेषण के समग्र reproducibility बढ़ाया । यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ, नमूना केवल तैयारी की शुरुआत में हेरफेर किया जाता है, जब प्रयोगकर्ता केंद्रित कैसेट में ऊतक सम्मिलित करता है । एक बार बंद कर दिया, कैसेट फिर से कभी नहीं खोल रहे हैं, इस प्रकार सही अभिविन्यास के रखरखाव को सुनिश्चित करने और मैनुअल त्रुटियों को कम करने3,11. इन दो महत्वपूर्ण कदम के मानकीकरण बाद विश्लेषण की पूरी गुणवत्ता में वृद्धि हुई है और खो दिया है या नहीं assessable नमूनों की संख्या में कमी आई, दोनों के लिए फिर से जुड़े कैसेट के उद्घाटन या नमूना 3 के गलत अभिविंयास के लिए ,11.

हम भी फाइब्रोसिस (चित्रा 7) के रूप में एक जटिल जैविक घटना का मूल्यांकन करने में सफल रहा है, कि बहुत बार प्रयोगात्मक आंत्र सूजन के murine मॉडल में, स्वचालित प्रोटोकॉल के कार्यांवयन के द्वारा आंका है । प्रोटोकॉल की स्थापना के दौरान, हम कड़ाई से ऐसे निर्धारण समय है, जो हम 24 से अधिक नहीं होना चाहिए एहसास के रूप में तकनीकी विवरण मानकीकृत ऊतक परिवर्तन से बचने के लिए । ऐसा करके, हम बाद में immunohistochemical विश्लेषण की गुणवत्ता को संरक्षित कर सकते हैं ।

स्वचालित विधि ऊतक वास्तुकला के परिवर्तन से जुड़े उन मापदंडों के मूल्यांकन में सुधार, विशेष रूप से अनुपचारित चूहों में. दरअसल, एक स्वस्थ समकक्ष के साथ एक रोग ऊतक के सही तुलना प्रयोगात्मक मॉडल3के अंतिम आकलन के लिए महत्वपूर्ण है ।

ऊतक प्रसंस्करण के विषय में, हम स्वचालित प्रोसेसर प्रयोगशाला में उपलब्ध में चलाने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल का परीक्षण किया. यहां वर्णित प्रोटोकॉल ध्वनि और अत्यधिक सुसंगत परिणाम दिया । हम भी प्रोटोकॉल के लिए एक समय लंबाई लागू किया । चूंकि murine नमूनों आकार में मानव छोटे biopsic नमूनों के लिए तुलनीय थे, एक छोटे प्रोटोकॉल murine प्रक्रिया करने के लिए पर्याप्त था (आंतों, इस मामले में) ऊतकों. अंत में, पूरे स्वचालित प्रक्रिया कुल प्रायोगिक समय कम कर दिया । microtome काटने और स्लाइस तैयार करने के लिए प्रसंस्करण की शुरुआत से, हम कुल समय की आवश्यकता 5 एच है कि गणना. इसके विपरीत, ऑपरेटर की तकनीकी क्षमता के आधार पर, मैन्युअल रूप से एक ही प्रोटोकॉल के पूरा होने के समय की मात्रा दोगुनी से अधिक की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से प्रसंस्करण और एम्बेडिंग के दौरान. तकनीक की एक सीमा है कि यह स्वचालित प्रोसेसर और embedder की आवश्यकता को प्रयोगशाला में किया जाएगा ।

अंत में, हमें विश्वास है कि इन स्वचालित प्रोटोकॉल के कार्यांवयन बहुत शोधों मानव रोगों के murine प्रयोगात्मक मॉडल से निपटने के शोधकर्ताओं के काम उंनति सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम IRCCS Policlinico अस्पताल के पैथोलॉजी विभाग, तकनीकी सहायता के लिए मिलान और पशुपालन में सहायता के लिए िीईओ पशु सुविधा का धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10x SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1x Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
  4. Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  6. Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. , New York, N.S.N.Y. (2010).
  7. Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
  9. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
  10. Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
  11. Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ histopathological विश्लेषण murine मॉडल स्वचालन embedding प्रणाली मानकीकरण murine आंत्र नमूनों

Erratum

Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

रोबोट प्रणालियों का उपयोग करने के लिए प्रक्रिया और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए बृहदांत्र Murine नमूने एंबेड
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Cribiù, F. M., Burrello, C.,… More

Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

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