ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Mancanza di standardizzazione per la processazione dei tessuti murini riduce la qualità delle analisi istopatologica murino rispetto agli esemplari umani. Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l'esame istopatologico di murini tessuti infiammati e uninflamed colici a dimostrare la fattibilità di sistemi robotici abitualmente utilizzati per l'elaborazione e l'incorporamento di campioni umani.
Abstract
La comprensione delle malattie umane è stata notevolmente ampliata grazie allo studio di modelli animali. Tuttavia, la valutazione istopatologica di modelli sperimentali deve essere così rigorosa come quella applicata per i campioni umani. Infatti, trarre conclusioni affidabili e accurate criticamente è influenzato dalla qualità della preparazione della sezione di tessuto. Qui, descriviamo un protocollo per l'analisi istopatologica dei tessuti murini che implementa diversi passaggi automatizzati durante la procedura, dalla preparazione iniziale per l'inclusione in paraffina dei campioni murini. La riduzione delle variabili metodologiche attraverso la standardizzazione del protocollo rigoroso da procedure automatizzate contribuisce alla maggiore affidabilità delle analisi patologica murino. In particolare, questo protocollo viene descritto l'utilizzo di trattamento automatizzato e l'incorporamento di sistemi robotici, abitualmente utilizzati per la lavorazione di tessuti e inclusione in paraffina di campioni umani, per elaborare murini esemplari di infiammazione intestinale. Concludiamo che l'affidabilità dell'esame istopatologico dei tessuti murini è aumentato significativamente dopo l'introduzione di tecniche standardizzate e automatizzate.
Introduction
Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati diversi modelli sperimentali per sezionare i meccanismi patogenetici che portano a malattie umane1,2. Al fine di valutare la gravità di una malattia, i ricercatori devono valutare l'effetto di un trattamento e studiare le variazioni architettoniche citologiche ed istologiche o la quantità di infiammazione3. Per eseguire su tali modelli sperimentali, dettagliate analisi istopatologiche sono necessari, spesso confrontando campioni murine ed umane4,5.
Inoltre, campioni umani sono comunemente trattati e segnati da strutture di core di istopatologia e patologi esperti umani attraverso standardizzato criteri istopatologici e metodi. Al contrario, tessuti murini sono solitamente fisso, incorporate e analizzati dai ricercatori con esperienza limitata dei protocolli istopatologici. La qualità e l'affidabilità dell'esame istopatologico inizia con la preparazione di sezioni di tessuto di alta qualità. Diversi fattori contribuiscono criticamente per aumentare o diminuire la qualità dell'analisi finale, tra cui la fissazione, macroscopica di sezionamento, la lavorazione, paraffina embedding ed embedding dei campioni6,7.
Tutti questi passaggi che coinvolgono la manipolazione del campione sono soggetti a errori manuali, tra cui l'incorporamento manuale dei campioni e, in misura minore, microtomo manuale di taglio e colorazione. Allo stato attuale, l'intero processo di preparazione di tessuti murini per valutazione istologica si basa su protocolli che variano da laboratorio a laboratorio e i protocolli manuali. L'obiettivo di questo studio è quello di implementare protocolli standardizzati automatizzati per ridurre gli errori e variabilità nell'esame istopatologico murino.
A nostra conoscenza, descriviamo qui i primi protocolli per tessuto completamente automatizzato di elaborazione e incorporamento per la valutazione istologica dei tessuti murini; Questi sono abitualmente utilizzati nelle unità di patologia per le analisi di campioni umani. Come esempio pratico della fattibilità del metodo, è stato analizzato un modello murino di infiammazione intestinale, cioè, il modello di colite cronica causata da somministrazione ripetuta di Destrano solfato di sodio (DSS) in acqua potabile8 ,9. Questa impostazione sperimentale strettamente assomiglia umano infiammatorie intestinali (IBD) malattie10 poiché animali DSS-trattati mostrano segni di infiammazione intestinale, per esempio, perdita di peso, feci o diarrea e accorciamento del colon, nonché di fibrosi 8,9,11. Come osservato per i pazienti IBD umani, DSS trattamento genera un decorso della malattia complessa. In questo contesto, elaborare valutazioni istologiche sono tenuti a comprendere la profonda alterazione dell'architettura del tessuto. Così, l'implementazione di protocolli descritti per aumentare la qualità di preparazione del campione per la vostra comodità ricercatori basandosi sull'interpretazione di istologici e immunohistochemical analizza per impostazioni sperimentali murine. Modelli sperimentali murini di malattie umane che coinvolge alterazioni dell'architettura del tessuto, la presenza di tessuto cellulare si infiltra in o infiammazione in diversi tessuti e organi (cervello, fegato, intestino, pelle) potrebbe utilizzare l'incremento della qualità della preparazione del campione per esame istopatologico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedure di animali sono state approvate dal Ministero della salute (auth. 127/15 27/13) e seguivano le indicazioni di cura degli animali dell'Istituto europeo di oncologia IACUC (Comitato di uso e istituzionali Animal Care)
1. cronica colite induzione dall'amministrazione ripetitive DSS
- Topi in 2 gruppi (trattamento DSS vs controllo H2O, almeno 5 littermates topi per ogni gruppo sperimentale) abbinati per età separata e sesso.
- Amministrare il 2,5% DSS (40 kDa) nell'acqua potabile per 7 giorni per il gruppo di trattamento e acqua al gruppo di controllo.
Nota: Questo modello induce un transmurale cronica infiammazione intestinale9. - Dopo 7 giorni, interrompere il trattamento di DSS e dare acqua a entrambi i gruppi per 14 giorni. Ripetere questa operazione 3 volte.
Nota: L'amministrazione ripetitive di DSS induce alterazioni della mucosa colica molto somiglianti IBD umana, cioè, fibrosi9. - Sacrificare topi secondo le procedure autorizzate da IACUC istituzionali, cioè, per inalazione di CO2 .
- Aprire l'addome del mouse e il peritoneo con un bisturi.
Nota: Sterilità è consigliato ma non strettamente necessario. - Separare i due punti dal piccolo intestino con pinze e pinzette. Asportare il colon con pinze e pinzette.
Nota: Misurazione della lunghezza del colon (Figura 1A) è un metodo per determinare se si è verificato colite in topi DSS-trattati. - Risciacquare il colon in una capsula di Petri con 10 mL di 1x freddo di soluzione salina tampone fosfato (PBS) e premere delicatamente per rimuovere il materiale fecale.
2. murino tessuti fissazione
- Immergere ogni esemplare del colon murini in 10 mL di 10% neutra tamponata formalina (NBF) a TA (temperatura ambiente).
Nota: Sterilità è consigliato ma non strettamente necessario. - Difficoltà il tessuto per 18 – 24 h a TA.
3. due punti di sezionamento e preparazione tessuto
- Rimuovere tessuti fissi dal Contenitore NBF con pinzette piccole e metterli in una capsula di Petri. Mettere i due punti su una piastra di lavoro taglio con piccole pinzette.
- Tagliare i due punti in frammenti (0,2 cm a 0,3 cm di lunghezza) con un bisturi sterile. Questa lunghezza del frammento è ottima per non superare lo spessore della cassetta.
- Pick up segmento di uno e due punti con piccole pinzette (Figura 2A). Inserire il segmento di uno e due punti in uno della plastica sporgenti punte della paraffina orientata l'incorporamento di cassette con piccole pinzette (Figura 2B).
- Ripetere l'operazione (3.2-3.3) con un ulteriori segmenti del colon 3 per cassetta. Evitare di inserire i segmenti adiacenti punte sporgenti, per minimizzare la sovrapposizione dei tessuti
- Richiudere la cassetta premendo con cura i quattro bordi (Figura 2). Evitare la spremitura del tessuto per evitare danni ai tessuti.
- Inserire la griglia in una struttura di sostegno in plastica. Etichettare il telaio di supporto per identificare il campione. Ripetere per ogni campione biologico.
4. tessuto lavorazione
- Accendere il processore automatico premendo il pulsante di alimentazione (Figura 3A, 3B).
- Riscaldare per 1 h per assicurare la fusione di cera di paraffina. Attendere che lo strumento conferma che la paraffina è completamente sciolto, osservando la presenza dell'icona dedicato (Figura 3).
- Inserire ogni cassetta orientato (contenente gli esemplari del tessuto) manualmente il cestello metallico fornito dal processore automatizzato (Figura 3D). Posizionare le cassette verticalmente da rivestimento li vicino uno a altro per ottimizzare l'occupazione di cestino.
- Chiudere il cestello metallico (Figura 3E).
- Aprire il coperchio della storta (Figura 3F). La storta è il luogo dove il cestello è inserito nella macchina. Inserire il cestello nell'alloggiamento dedicato del processore (Figura 3). Chiudere il coperchio della storta (Figura 3 H).
- Utilizzare il touch screen del computer strumento per definire il protocollo di lavoro (Figura 3I). Scegliere la sequenza delle soluzioni, tempi e temperatura da attuarsi secondo lo schema previsto nella tabella 1.
- Assegnare il protocollo deve essere eseguito su storta contenente il Cestino facendo clic sull'icona computer dedicato (Figura 3J). Avviare il protocollo facendo clic sul Pulsante Start (Figura 3 L).
- Attendere che lo strumento conferma la fine del protocollo, osservando la presenza dell'icona dedicata e ascoltando il tono di allarme provenienti dalla macchina.
- Aprire il coperchio della storta. Togliete il cestello dal processore (Figura 3 M).
5. tessuto incorporamento
- Accendere il embedder automatica premendo il pulsante di alimentazione (Figura 4A).
- Riscaldare per 1 h per assicurare la fusione di cera di paraffina. Attendere che lo strumento conferma che la paraffina è completamente fusa osservando la temperatura del bagno di paraffina indicato dal termometro interno dello strumento.
- Trasferire manualmente tutte le cassette trasformate dal cestino del processore al rack embedder. Ogni rack può contenere fino a 32 cassette. (Figura 4B, 4C).
- Aprire il coperchio principale embedder (Figura 4, 4D, 4E).
- Utilizzare il touch screen del computer strumento per segnalare per la robotica sistema che un rack viene inserita (Figura 4F).
- Aprire il coperchio dell'alloggiamento di aspirazione (Figura 4). Inserire il ripiano nel corpo della presa. Ogni embedder può contenere contemporaneamente fino a 4 rack (Figura 4 H, 4I). Chiudere il coperchio dell'alloggiamento di aspirazione (Figura 4J).
- Utilizzare il touch screen del computer strumento per avviare la procedura di incasso, secondo la tabella 2 (Figura 4 K).
Nota: Ciascun rack di 32 cassette dura circa 45 minuti per essere incorporato. - Attendere che lo strumento conferma la fine del protocollo, osservando la presenza dell'icona dedicato (Figura 4 L).
- Rimuovere la griglia di presa (Figura 4 M). Chiudere il coperchio principale embedder.
- Rimuovere i blocchi incorporati (che contiene le griglie di orientamento) dal rack. Trasferire i blocchi incorporati in una scatola di cartone di stoccaggio.
6. micrometro di sezionamento
- Accendere la piastra di raffreddamento del microtomo. Impostare la temperatura tra -8 e -10 ° C.
- Accendere il bagno termostatico acqua del microtomo, contenente 2 L di acqua distillata. Impostare la temperatura del bagno d'acqua tra 42 – 45 ° C.
- Posto la paraffina incorporati blocchi sulla piastra di raffreddamento. Attendere almeno 5 minuti per consentire i blocchi raffreddare.
- Prendere un isolato dalla piastra di raffreddamento e inserirlo nel supporto per blocco microtomo.
- Impostare il microtomo spessore a 10 µm. Trim il blocco di taglio tagliando 6 volte a 10 µm di spessore.
- Modificare l'impostazione di spessore del microtomo da 10 µm a 3 µm. taglio uno a 3 µm sezione per colorazione ematossilina ed eosina (H & E).
-
Raccogliere la sezione 3 µm con una piccola spazzola. Mettere la sezione 3 µm nel bagno d'acqua, si posa con cura sulla superficie dell'acqua per ridurre le rughe del tessuto. Raccogliere la sezione di tessuto dal bagnomaria termostatato su una lastra di vetro singolo.
- Se necessario, tagliare sezioni aggiuntive.
- Etichettare il vetrino scrivendo l'identificazione dei campioni.
- Mettere i vetrini in un forno a 37 ° C per almeno 10 min.
- Mettere vetrini in rack per analisi immediate o in scatole di immagazzinaggio.
7. ematossilina ed eosina (H & E)
- Accendere il coloratore automatico premendo il pulsante di alimentazione. Consentire l'inizializzazione del braccio robotico, osservando il cambiamento della barra di caricamento sul monitor dello strumento.
- Inserire i vetrini nel rack stainer, inserire verticalmente fino a 30 diapositive.
- Etichettare il rack con l'etichetta di plastica identification (RFID) appropriata frequenza radio. Tagging RFID è un sistema che identifica il protocollo di colorazione corretto caricato nel computer stainer.
- Inserire il rack il coloratore automatico. Consentire al computer caricare automaticamente e avviare il protocollo di colorazione secondo il riconoscimento del tag RFID.
Nota: Il protocollo per la macchiatura di H & E è descritto in tabella 3.
8. la macchiatura di Immunohistochemical
- Eseguire immunohistochemical e Mallory tricromica colorazione come descritto in precedenza7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Colite cronica sperimentale indotta dalla somministrazione ripetuta di DSS nell'acqua potabile è un modello murino di infiammazione intestinale molto somiglianti umano IBD8,9. Figura 1 descrive gli effetti del trattamento di DSS, tra cui colon accorciamento (Figura 1A), un parametro ampiamente usato per segnare la presenza di infiammazione indotta da DSS e colica espressione di geni pro-infiammatori compreso CXCL10 , tnf e mcp-1 (Figura 1B). Infiltrazione di cellule infiammatorie è stata grandemente valorizzata dal trattamento di DSS, mostrando un reclutamento della risposta immunitaria nella lamina propria intestinale come analizzato tramite citofluorimetria (Figura 1).
Figura 2 descrive come coliche tessuti sono sezionato e inserito in cassette orientate. Queste cassette sono progettate per contenere esteriormente una griglia con punte estrusi, permettendo l'inserimento del tessuto in verticale e con il corretto orientamento, cioè, con il lume in parte interna e la parete (Figura 2A, 2B, 2C ). Una volta che le cassette sono chiusi, l'orientamento del tessuto è conservato dalle griglie, contrariamente a quanto accade con cassette istologiche convenzionali (Figura 2B).
L'elaborazione del tessuto viene eseguita con un processore automatizzato (Figura 3A-3 M e tabella 1), mentre l'incorporamento procedura viene eseguita con un embedder automatizzato (Figura 4A-4 M e tabella 2). In quest'ultimo strumento, un robot raccoglie le cassette ed eroga la giusta quantità di paraffina. Infine, utilizzando un microtomo, sezioni sono tagliati da ogni blocco di paraffina. I vetrini vengono quindi preparati per un'ulteriore analisi.
Figura 5 descrive i passaggi fondamentali della H & E colorazione automatica (Figura 5A-5E e tabella 3) e come le diapositive appaiono dopo H & E che macchia (Figura 5F). Figura 6 e 7 mostrano come l'attuazione del trattamento automatizzato e protocolli di incorporamento aumentare fortemente la qualità delle analisi istopatologiche degli esemplari di colici murini. La H & E gli stainings di campioni preparati con i protocolli automatici derivati da topi non trattati (Figura 6A) sono stati confrontati con quelli dei topi trattati di DSS (Figura 6B). Punteggi istopatologici sono stati valutati valutando le modifiche dei parametri differenti che si verificano nella mucosa intestinale, tra cui infiammatoria cellule infiltrazione, alterazioni epiteliali e modifiche dell'architettura della mucosa come descritto in Tabella 4. Figura 6 raffigura un rappresentante H & E colorazione di un tessuto colico trattati manualmente e incluso in cassette tradizionali. In Figura 7, la qualità della preparazione del tessuto murino e incorporamento effettuato attraverso strumenti automatizzati è stata inoltre confermata da IHC macchiatura di CD20 e Mallory tricromica colorazione8,9 a Colico sezioni di non trattata (figura 7A, 7C) e DSS-trattati (figura 7B, 7D) topi.
Figura 8 descrive la rilevanza pratica di questo metodo. Gli stessi campioni di due punti sono stati elaborati e incorporati manualmente oppure mediante metodi automatici. Ogni campione (il controllo o DSS-trattati) è stato tagliato in 2 parti uguali ed elaborata in parallelo con il manuale o con i metodi automatici. Macchiatura di H & E è stata quindi eseguita e una valutazione microscopica completa riguardante tutti i parametri patologici indirizzamento modifiche in architettura della mucosa, granularità delle cellule immuni infiltrarsi, spessore mucoso, rarefazione ghiandolare normalmente osservata durante l'infiammazione intestinale, è stata valutata per ogni campione, sia per il manuale e automatizzata di protocollo (Figura 8A e tabella 4). La preparazione dei campioni con il protocollo automatizzato costantemente ha permesso la valutazione di una proporzione elevata dei parametri istologici che il metodo manuale. Inoltre, è stata effettuata un'analisi separata dei diversi parametri istologici (Figura 8B). L'architettura e la valutazione basale si infiltra in sono stati positivamente colpiti, soprattutto nei topi non trattati, la preparazione del campione con il metodo automatizzato.
Il metodo automatizzato per esempio elaborazione e incorporamento attualmente utilizzato per le analisi istopatologiche umane può essere applicato con successo per l'analisi degli esemplari murini. Esemplari di alta qualità vengono generati con il metodo automatizzato che dimostra la superiorità rispetto al metodo manuale nella valutazione dell'architettura e l'infiltrato immunitario basale di tessuti colici murini.
Figura 1: valutazione di infiammazione intestinale cronica. (A) misurazione della lunghezza del Colon. (B) colica espressione di geni pro-infiammatori (cxcl10, tnf, mcp-1) nel DSS-trattati (nero bar, n = 12) e non trattata di topi (bianco bar, n = 6). (C) Immunophenotyping della colica lamina propria cellule nel DSS-trattati (chiuso simboli, n = 12) e non trattata di topi (aprire simboli, n = 6). CD11b + Ly6G + neutrofili, CD11b + F4 / 80 + macrofagi (pannello sinistro), CD4 + e CD8 + T cellule di infiltrazione (pannello di destra) nei controlli (aprire simboli, n = 10) e topi DSS-trattati (chiuso simboli, n = 10). Significatività statistica è stata calcolata utilizzando coppie abbinate Wilcoxon firmato test t rango. p ≤ 0.05 * * p ≤ 0,01. Media valore ± SEM sono segnalati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Descrizione della preparazione del campione. (A) strumenti necessari per la preparazione dei tessuti e l'immagine della cassetta orientata, composta da una cassetta esterna (bianco) e griglia interna con estruso consigli di orientamento. (B, C) Inserimento di due punti murini in griglie interne della cassetta prima (B) e dopo la chiusura (C) delle griglie. Nel pannello B è raffigurata la cassetta orientata (a sinistra) o in una cassetta tradizionale (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Descrizione del trattamento automatizzato. (A, B) automatizzato processore. (C) icona che descrive la corretta temperatura di fusione della cera paraffinica. (D, E) Inserimento della cassetta nel cestello metallico (D) e la sua chiusura (E). (F, G, H) Inserimento del cestello metallico nella storta. (I, J, K) Selezione del protocollo di trattamento. (L) esecuzione del protocollo. (M) rimozione del modulo cestino della storta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Descrizione di incorporamento automatico . (A) immagine della embedder automatizzato. (B, C) Inserimento delle cassette nel rack. (D, E) (D) di apertura e chiusura (E) del coperchio. (F) segnalazione alla macchina della presenza di un rack. (G, H) Inserimento del rack nell'alloggiamento dell'ingresso. (I, J) chiusura del coperchio. (K) inizio del protocollo incorporamento. (L) apertura del coperchio dell'alloggiamento di presa. (M) rimozione del rack formano il corpo di scarico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Descrizione del coloratore automatico di H & E. (A) immagine del portavetrini. (B, C) Inserimento di portavetrini nella macchina. (D) chiusura della macchina. (E) Start del protocollo colorazione. (F) foto indicativo di una diapositiva dopo il microtomo taglio e colorazione H & E. Pannello di destra, H & E macchiatura raffigurante l'orientamento del campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: H & E gli stainings di colici campioni formano topi non trattati e trattati con DSS. H & E colorazione di non trattati (A) e DSS-trattati (B) campioni preparati (trattati, embedded, macchiato) con automatizzato (A, B) o manuale (C) metodi. Barra della scala = 100 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Mallory tricromica (A, B) e gli stainings di IHC di infiltrazione di cellule CD20 + (C, D) di non trattata (A-C) e DSS trattati (B, D) topi. Mallory colorazione: blu, collagene, rosa scuro, i nuclei, rosso scuro, citoplasma. Barra della scala = 100 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: confronto tra analisi istopatologiche con protocolli manuali e automatizzati. (A) totale parametri istopatologici valutabili in tutte le sezioni preparate con il manuale (barre bianche) o con il metodo automatizzato (purple bar). (B) percentuale dei parametri indicati nei campioni preparati con il manuale (barre bianche) o con il metodo automatizzato (viola barre) in non trattate (barre semplici) o topi DSS-trattati (barre punteggiate). Significatività statistica è stata calcolata utilizzando coppie abbinate Wilcoxon firmato test t rango. p < 0,05; p < 0,005. Media valore ± SEM sono segnalati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | tempo (min) | temperatura (° C) | pressione |
| NBF | 1 | RT | ambiente |
| Etanolo 95% | 1 | RT | ambiente |
| Etanolo 95% | 1 | RT | ambiente |
| Etanolo 95% | 1 | RT | ambiente |
| Etanolo assoluto | 1 | 45 | ambiente |
| Etanolo assoluto | 11 | 45 | ambiente |
| Etanolo assoluto | 30 | RT | ambiente |
| Xilene | 1 | RT | ambiente |
| Xilene | 1 | 45 | ambiente |
| Xilene | 28 | 45 | ambiente |
| Cera di paraffina | 5 | 65 | vuoto |
Tabella 1: Automated protocollo di trattamento del tessuto.
| Azione perfomed dal robot per ogni cassetta |
| Rimuovere una cassetta dal rack |
| Identificare la cassetta |
| Preriscaldare lo stampo |
| Posizionare la cassetta sullo stampo preriscaldato |
| Erogare la quantità di paraffina per la cassetta |
| Raffreddare lo stampo |
| Consentire la paraffina a solidificare |
| Rimuovere il blocco di paraffina solidificata dallo stampo |
| Presente il blocco ai sensori di qualità |
| Posizionare il blocco di paraffina nella porta di uscita |
Tabella 2: Automatizzato l'incorporamento di protocollo.
| Categoria | Criterio | Definizione | Valore di Punteggio |
| Infiltrato di cellule infiammatorie | Livello di gravità (densità del leucocita dell'area propria di lamina infiltrato valutati hpf) | Nessun infiltrato | 0 |
| Minimal acuta (< 10%) | 0.25 | ||
| Lieve cronica (10-25%, neutrofili sparsi) | 0,5 | ||
| Moderata cronico (26-50%) | 0,75 | ||
| Contrassegnato (> 51%, densi infiltrati) | 1 | ||
| Misura (espansione di infiltrazione del leucocita) | Della mucosa | 0,5 | |
| Della mucosa e sottomucosa | 0,75 | ||
| Cambiamenti epiteliali | Iperplasia (aumento del numero delle cellule epiteliali nelle cripte longitudinale, visibile come allungamento cripta) | Senza iperplasia | 0 |
| Minimo (< 25%) | 0.25 | ||
| Lieve (26 – 35%) | 0,5 | ||
| Moderato (36 – 50%, i mitoses nel terzo superiore dell'epitelio cripta) | 0,75 | ||
| Contrassegnato (> 51%, mitoses nell'epitelio cripta distante dalla cripta base) | 1 | ||
| Perdita delle cellule di calice (riduzione dei numeri delle cellule di calice rispetto al basale delle cellule di calice numeri per ogni cripta) | Nessuna perdita | 0 | |
| Minimo (< 25%) | 0.25 | ||
| Lieve (26 – 35%) | 0,5 | ||
| Moderato (36 – 50%) | 0,75 | ||
| Contrassegnato (> 51%) | 1 | ||
| Architettura della mucosa | Ulcerazione (difetto epiteliale raggiungendo oltre la muscolaris mucosae) | Nessun ulcere | 0 |
| Ulcere | 0.25 | ||
| Tessuto di granulazione (riparazione del tessuto connettivo con nuovi capillari, circondato da infiltrazione di cellule ipertrofiche aree) | Nessun tessuto di granulazione | 0 | |
| Tessuto di granulazione | 0.25 | ||
| Profondità di spessore mucoso e cripta | Nessun ispessimento | 0 | |
| Ispessimento | 0,5 | ||
| Rarefazione ghiandolare | Nessuna rarefazione | 0 | |
| Rarefazione | 0,5 | ||
| Displasia | Nessuna displasia | 0 | |
| Displasia | 0,5 | ||
| PUNTEGGIO MASSIMO | 6 |
Tabella 3: Automated protocollo di colorazione.
| Azione perfomed dal coloratore automatico per ogni diapositiva | Reagente | tempo (s) | temperatura (° C) |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Deparaffinizzare | Xilene | 120 | RT |
| Deparaffinizzare | Xilene | 120 | RT |
| Idrato | Etanolo 96% | 120 | RT |
| Idrato | Etanolo 96% | 120 | RT |
| Lavare | Wtaer distillata | 240 | RT |
| Ematossilina di macchia | Ematossilina di Carazzi | 540 | RT |
| Risciacquo | Acqua del rubinetto | 360 | RT |
| Macchia dell'eosina | Eosina g soluzione 1% aqueos | 60 | RT |
| Risciacquo | Acqua del rubinetto | 120 | RT |
| Disidratare | Etanolo 96% | 20 | RT |
| Disidratare | Etanolo 96% | 20 | RT |
| Disidratare | Etanolo assoluto | 15 | RT |
| Disidratare | Etanolo assoluto | 15 | RT |
| Chiaro | Xilene | 30 | RT |
| Chiaro | Xilene | 30 | RT |
Tabella 4: Segnando schema per la valutazione dell'infiammazione intestinale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utilizziamo diversi passaggi automatizzati durante la preparazione dei tessuti murini per analisi istopatologica. Questo protocollo mira a fornire suggerimenti tecnici per incrementare la riproducibilità e la standardizzazione di tutto il processo, migliorando così la qualità complessiva della valutazione istopatologica finale. Abbiamo implementato strumenti automatizzati e metodi per la preparazione e l'incorporamento dei tessuti, abitualmente utilizzati in strutture di nucleo di patologia per lo studio di campioni umani.
Per dimostrare l'applicabilità potenziale di questo metodo, abbiamo scelto un'impostazione sperimentale murina cronica di infiammazione intestinale, chiamato modello di colite cronica indotta da DSS. Questa impostazione è simile il decorso della malattia complessa osservato nei pazienti di IBD, che richiedono la valutazione istologica elaborata per indagare le profonde alterazioni dell'architettura del tessuto che si verificano all'infiammazione intestinale cronica. Complessivamente, la valutazione istologica di questi processi potrebbe beneficiare grandemente di qualità di preparazione del campione maggiorato. Da notare, questo protocollo può essere applicato ad altri tessuti murini (cioè, milze, linfonodi, fegato, cervello), con l'unica differenza è che la cassetta orientata non è necessaria per tessuti senza un lume.
L'osservazione più importante era che la diminuzione di errori manuali, (cioè, l'orientamento del campione) dato l'utilizzo di cassette con griglie e l'eliminazione delle cassette riapertura per l'incorporamento (un passo comunemente eseguito durante manuale protocolli), fortemente migliorato la riproducibilità complessiva dell'analisi. Con il protocollo descritto qui, il campione viene manipolato solo all'inizio della preparazione, quando lo sperimentatore inserisce il tessuto in cassette orientate. Una volta chiuse, le cassette non sono mai riaperta, così assicurando il mantenimento del corretto orientamento e riducendo gli errori manuali3,11. La standardizzazione di questi due passaggi critici esaltato le qualità intera delle analisi successive e diminuito il numero di campioni persi o non valutabili, problemi sia legati alla riapertura della cassetta o per l'orientamento errato del campione3 ,11.
Siamo anche riusciti a valutare un evento biologico complesso quale fibrosi (Figura 7), che è molto spesso sottovalutato in modelli murini di infiammazione intestinale sperimentale, dall'implementazione del protocollo automatizzato. Durante la configurazione del protocollo, abbiamo rigorosamente standardizzato dettagli tecnici come il tempo di fissazione, che ci siamo resi conto che non deve superare i 24 h per evitare alterazioni del tessuto. In questo modo, abbiamo potuto preservare la qualità dell'analisi immunohistochemical successive.
Il metodo automatizzato migliorata la valutazione di tali parametri associati all'alterazione dell'architettura del tessuto, specialmente in topi non trattati. Infatti, il confronto corretto di un tessuto patologico con una controparte sana è criticamente importante per la valutazione finale del modello sperimentale3.
Per quanto riguarda la lavorazione del tessuto, abbiamo testato diversi protocolli per essere eseguito nel processore automatizzato disponibile in laboratorio. Il protocollo descritto qui ha dato risultati altamente coerente e suoni. Abbiamo anche implementato una lunghezza di tempo per il protocollo. Poiché murini campioni erano paragonabili ai campioni umani di biopsic piccoli in dimensioni, un protocollo più corto era sufficiente per elaborare murino (intestinale, in questo caso) tessuti. Infine, la procedura completamente automatizzata ridotto il tempo totale di sperimentale. Dall'inizio del trattamento per il microtomo e fette preparazione, abbiamo calcolato che il tempo totale richiesto è di 5 h. Al contrario, a seconda della capacità tecnica dell'operatore, il completamento dei protocolli stessi manualmente può richiedere più del doppio la quantità di tempo, soprattutto durante la lavorazione e l'incorporamento. Un limite della tecnica è che richiede processori automatizzati ed embedder da eseguire per essere in laboratorio.
In conclusione, crediamo che l'implementazione di questi protocolli automatizzati potrebbe notevolmente migliorare il lavoro dei ricercatori traslazionali a che fare con modelli sperimentali murini di malattie umane.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il dipartimento di patologia dell'ospedale Policlinico IRCCS, Milano per il supporto tecnico e l'IEO Animal Facility per l'assistenza nel settore zootecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10x | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1x | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. , New York, N.S.N.Y. (2010).
- Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
Tags
Immunologia e infezione numero 143 l'analisi istopatologica modelli murini automazione l'incorporamento di sistema la standardizzazione la murini esemplari intestinaliErratum
Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. An author affiliation was updated.
The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS
