Summary
Cell-lösa brosk-derived ställningar kan användas som en byggnadsställning till guide brosk reparation och som ett sätt för att regenerera osteokondrala vävnad. Detta dokument beskriver hur decellularization i detalj och ger förslag att använda dessa ställningar i in vitro-inställningar.
Abstract
Osteokondrala defekter saknar tillräcklig inneboende reparation kapacitet att regenerera funktionellt ljud ben och brosk vävnaden. I denna utsträckning, har brosk forskning fokuserat på utvecklingen av regenerativ ställningar. Denna artikel beskriver utvecklingen av ställningar som helt härrör från naturliga brosk extracellulärmatrix, kommer från ett equine givare. Potentiella tillämpningar av ställningar inkluderar producerar organtransplantationer för brosk reparation, som fungerar som en klätterställning för osteokondrala tissue engineering och ge in vitro-modeller för att studera vävnad bildas. Av decellularizing vävnad, donatorcellerna tas bort, men många av de naturliga bioaktiva cues tros finnas kvar. Den största fördelen med att använda en sådan naturlig byggnadsställning i jämförelse med en syntetiskt framställd byggnadsställning är att ingen ytterligare funktionalisering av polymerer är skyldig att driva osteokondrala vävnadsregeneration. De brosk-derived matrix ställningar kan användas för ben och brosk vävnadsregeneration i både in vivo och in vitro-inställningar.
Introduction
Ledbrosk defekter i knät orsakas av traumatiska händelser kan leda till obehag, och framför allt kan ha en stor inverkan på livet för de unga och aktiva befolkningen1,2,3. Broskskador i unga år kan dessutom leda till en snabbare insättande av artros senare i livet4. För närvarande är den enda bärgning behandlingen för generaliserad artros i knä Ledbyteskirurgi. Brosk är en hypocellular, aneural och avaskulär vävnad, är dess regenerativ kapacitet starkt begränsad. Regenerativ medicin metoder är därför eftertraktade stöd och stimulera regenerativ kapacitet av infödda vävnad. För detta ändamål ställningar utformas och används som antingen en cell-bärare eller som en induktiv material som uppviglar differentiering och förnyelse av vävnad av kroppens infödda celler5.
Cell-lösa ställningar har studerats allmänt inom regenerativ medicin6. Det har haft viss framgång, till exempel i medhjälp förnyelse av huden7, buken strukturer8och senor9. Fördelen med att använda cell-lösa ställningar är deras naturligt ursprung och deras kapacitet att behålla bioaktiva ledtrådar som både lockar och inducera celldifferentiering in lämpliga släktlinje krävs för vävnad reparera6,10. Dessutom eftersom extracellulär matrix (ECM) är en naturlig biomaterial, och decellularization förhindrar en potentiell immunsvaret genom att ta bort cellular eller genetiska innehåll, är frågor rörande biokompatibilitet och biologisk nedbrytbarhet övervinnas.
Brosk-derived matris (CDM) ställningar har visat stor chondrogenic potential i in vitro-experiment när seedade med mesenkymala stromaceller11. Dessutom, har dessa ställningar visat potential att bilda benvävnad genom endochondral benbildning på ektopisk platser i invivo inställningar12. Som CDM ställningar guide bildandet av både ben och brosk vävnaden, dessa ställningar kan hålla potentiella för osteokondrala defekt reparation utöver brosk reparation.
Den här artikeln beskrivs ett protokoll som anpassas från Yang et al. (2010)13 för produktion av cell-lösa CDM ställningar från hästdjur kväva brosk. Dessa ställningar är rika i kollagen typ II och saknar celler, och innehåller inte någon glykosaminoglykaner (GAG) efter decellularization. Både in vitro- och in vivo försök på (osteoartrit) chondral defekt reparation kan utföras med hjälp av dessa ställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För detta protokoll erhölls equine kväva brosk från hästar som hade dött av andra orsaker än artros. Vävnaden erhölls med tillstånd från ägarna, i linje med de institutionella etiska reglerna.
Obs: Det här protokollet beskriver tillverkning av ställningar från cell-lösa equine brosk, som kan användas för applikationer såsom in vitro vävnadsodling plattformar eller för in-vivo implantation i regenerativ medicin strategier. Enzymatisk behandling stegen måste utföras i den beskrivna kronologiska ordningen.
1. upptagning av ledbrosk från givare (avlidna) lederna
- Framåt av skörd steg, förbereda 1 L av brosk tvättlösningen, bestående av steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), kompletterat med 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 1% (v/v) amfotericin B.
- Använd handskar och en labbrock under hela förfarandet vid skörd eftersom givaren kan bära patogener.
- Skaffa en intakt (avlidna) gemensam för brosk isolering.
Obs: Vid denna punkt, är huden runt leden fortfarande intakt. Equine kväva brosk från hästen användes i detta protokoll, men andra leder från andra arter kan också användas. - Ta bort huden som ligger runt det gemensamma området av intresse med hjälp av en skalpell och en kirurgisk pincett. Dessutom ta bort överdriven fett och muskler vävnad vid behov utan att skada underliggande gemensamma. Du kan också överföra den beredda cadaver till biologiska säkerhetsdragskåp.
- För att utföra en artrotomi, dvs, en separation av gemensamt, först definiera platsen där gemensamt artikulerar genom att utföra extension och flexion av gemensamt.
- Ta försiktigt bort flera lager av fett, muskler och senor med en skalpell och kirurgisk pincett att öppna upp det gemensamma området.
- Gör ett snitt att nå gemensam hålighet.
Obs: Gemensamma kaviteten är fylld med ledvätska, som kan droppa från hålrummet när du utför en rätt snitt. - Fortsätta att öppna upp leden helt genom att skära genom senor som håller leden tillsammans.
- Inspektera brosk för makroskopisk skada.
Obs: Om ledbrosket inte har en glansig och smidig utseende eller om uppenbar blåsbildning, klyftor eller defekter är närvarande, kassera brosk. - Använd en steril skalpell för att ta bort brosk från subkondrala benet. Skär ända ner till det subkondrala benet att också ta bort zonen djup av brosk (figur 1). För att förhindra brosk från uttorkning, regelbundet droppa brosk tvättlösningen på brosk.
Obs: Vid denna tid, spelar storleken på brosk skivor ingen roll. - Samla brosk skivor i 50 mL rör som innehåller tidigare beredda brosk tvättlösningen (figur 2A).
- Efter att samla brosk från alla områden av intresse, frysa snapin brosk skivor i flytande kväve för 5 min.
- Överför brosk skivor till 50 mL rör och omedelbart lyophilize brosk skivor för 24 h i en frysning torktumlare. Ställ in frysningen torktumlare på ungefärligt 0.090 mbar medan isen kondensorn är-51 ° C (figur 2B).
- Lagra brosk skivor på en torr plats i rumstemperatur tills vidare användning.
Obs: Fram till punkten av byggnadsställning bildande behöver de lösningar och brosk inte förberedas och behandlas på ett sterilt sätt.
2. skapa cell-lösa brosk partiklar
- Doppa de frystorkade brosk skivorna i flytande kväve.
- Direkt slipa proverna antingen manuellt eller genom en fräsmaskin. Vid slipning brosk skivor för hand, Använd en mortel och stöt och slipa skivor för ca 45 min tills de är pulvriserade (figur 2 c och 2D). Vid slipning automatiskt, använda en fräsmaskin med förinställda hastighet för några sekunder upp till en minut, tills snapin-fryst brosk skivor är pulveriseras.
Obs: Pre cool mortel eller slipning facket av fräsmaskin genom att lägga till flytande kväve. När du använder en fräsmaskin, se till att alla partiklar är marken, och att inga partiklar stannar i botten av slipning facket. - Sikten brosk partiklarna att bli av större delar med hjälp av en sil med en 0.71 mm maskstorlek.
- Lagra partiklarna i en torr plats i rumstemperatur.
3. enzymatisk Decellularization med Trypsin 0.25%-EDTA
- Förbereda den matsmältning lösningen, bestående av 0,25% trypsin med EDTA kompletteras med 100 U/mL penicillin 100 μg/mL streptomycin och 1% (v/v) amfotericin B. Store lösningen vid 4 ° C.
Obs: Trypin är ett proteas som försämrar proteiner som är bosatta i brosk vävnaden. Denna enzymatiska steg kommer att öppna upp tät brosk struktur. - Fyll i 50 mL rör med pulvriserat brosk partiklarna upp till en volym på cirka 7,5 mL per rör.
-
Inkubera brosk partiklarna med förberedda matsmältningen lösningen vid 37 ° C under 24 h totalt, medan uppfriskande matsmältningen lösningen varje 4 h.
- Först, tillsätt 30 mL matsmältningen lösningen till varje 50 mL tub som innehåller brosk partiklar.
- Sedan resuspendera partiklarna med ett vortex eller Pipettera så att alla partiklar utsätts för en enzymatisk lösning.
- Inkubera proverna för 4 h vid 37 ° C på en rulle.
- Om du vill uppdatera matsmältningen lösningen, Centrifugera rören i 20 min vid 3113 x g att orsaka sedimentering av brosk partiklarna. Kassera supernatanten.
Obs: Supernatanten blir tydligare med varje trypsin inkubationstid. - Upprepa steg 3.3.1–3.3.4 tills partiklarna har inkuberats med matsmältningen lösningen i 6 cykler på 4 h.
- Efter den sista cykeln, avlägsna supernatanten efter centrifugering och tvätta partiklarna i 30 mL brosk handtvättar lösning. Centrifugera partiklarna i 20 min vid 3113 x g mellan varje tvättar.
4. enzymatisk Decellularization med nukleotid
- Förbereda en 10 mM Tris-HCl-lösning med pH 7,5 i avjoniserat vatten.
- Lägga till 50 U/mL deoxyribonuclease och 1 U/mL ribonunkleas A Tris-HCl bufferten, att skaffa nuclease lösning.
Obs: Detta steg utförs för att specifikt försämra deoxyribonucleases och ribonucleases. - Ta bort brosket tvättlösningen från brosk partiklarna (steg 3,4), Centrifugera i 20 min vid 3 113 x goch avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 30 mL av lösningen nuclease brosk partiklar och rör partiklarna genom lösningen, att se till att alla partiklar utsätts för nuclease lösningen.
- Inkubera proverna på en roller för 4 h vid 37 ° C.
- Ta bort nuclease lösningen genom centrifugering brosk partiklarna i 20 min vid 3 113 x g och kasta bort supernatanten.
- Tvätta proverna genom att lägga till 30 mL 10 mM Tris-HCl-lösning utan deoxyribonuclease och ribonunkleas A brosk partiklarna. Omsuspendera partiklarna och lämna proverna på en roller för 20 h i rumstemperatur.
5. tvättmedel Decellularization
- Göra rengöringslösning genom upplösning 1% (v/v) octoxynol-1 i PBS.
- Ta bort de Tris-HCl-lösningen från brosk partiklarna genom centrifugering för 20 min vid 3 113 x g och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 30 mL av den förberedda 1% rengöringslösning brosk partiklar. Återsuspendera brosk partiklarna försiktigt för att undvika skumning av lösningen.
Obs: Detta steg bryter ner cellulära membran. - Inkubera proverna på en roller för 24 h i rumstemperatur på en rulle.
- Avlägsna rengöringslösning genom centrifugering i 20 min vid 3 113 x g och Kassera supernatanten.
-
Ta bort alla rester av decellularization lösningar, tvätta brosk partiklarna i 6 cykler av 8 h i 30 mL brosk tvättlösningen. Utför tvätt på en rulle i rumstemperatur.
- Ändra till nästa tvätt, Centrifugera suspensionen för 20 min vid 3 113 x g, avlägsna supernatanten och lägga till färska brosk tvättlösningen.
- Lämna den sista tvättningen i rören och lagra cell-lösa brosk partiklarna vid-80 ° C.
6. skapa ställningar från cell-lösa partiklar
- Om partiklarna har lagrats vid-80 ° C, Tina slutna rören som innehåller brosk partiklarna i varmt vatten innan du skapar ställningar.
- Överföra brosk partiklar med en liten slev till en cylindrisk form, exempelvis plast injektionsflaska med en diameter på 8 mm och en höjd av 2 cm.
- När du placerar brosk partiklarna i plast mögel, tryck på alla air-bubblor ut för att undvika hålrum i ställningen och Fyll formen tills kanten.
Obs: Det blir svårare att ta ställningar ur en metall mögel efter byggnadsställning formation, vilket kan leda till sprickor i ställningen. - Frysa formarna med brosk partiklar under 10 minuter vid-20 ° C.
- Lyophilize i brosket ställningar inom deras formar för 24 h i en frysning torktumlare.
- Efter frystorka den, ta ställningen ur formen (figur 3) och länka dem med ultraviolett (UV) ljus på 30 cm avstånd och 365 nm över natten.
- För att kunna använda ställningar för in vitro-cellkultur eller invivo implantation, sterilisera ställningar med, till exempel etylengas oxid (EtO).
Obs: EtO-sterilisering utförs av extern part.
7. karakterisering av de cell-lösa ställningar med histologiska färgningar
Obs: För att säkerställa komplett decellularization och visualisera den återstående naturliga karaktären av brosk, utföra flera histologiska färgningar innan du använder ställningar i alla experiment, inklusive hematoxylin och eosin (H & E) färgning för att säkerställa decellularization, Safranin-O färgning för att visualisera kvarstående GAG närvaro, kollagen typ I immunohistokemi att skilja mellan kollagen innehåll och kollagen typ II immunohistokemi att skilja mellan kollagen innehåll.
- Skär ställningar i tunna skivor ca 3 mm med en skalpell.
Obs: Om ställningar skärs i större eller mindre storlekar, behöver varaktigheterna för uttorkning cykler anpassas. - Bädda in ställningar i en droppe 4% (w/v) alginat och inducera cross-linking genom att lägga till en liknande volym på 3,7% icke buffrad formalin som innehåller 20 mM CaCl2.
Obs: Alginat inbäddning gör byggnadsställning skivor styvare jämfört med tvätt stegen före paraffin inbäddning. I fall ställningar har varit cell-seedade eller i vivo implanteras, är alginat inbäddning inte nödvändigt, eftersom sammansättningen av ställningar blir resistenta tillräckligt på grund av ECM införlivande genom cellerna. - Torka proverna genom att placera dem i en graderad etanol serie, börjar med en timme cykler av 70%, 96%, 96%, 100% och 100% etanol, följt av två 1 h cykler av xylen, och slutar med två 1 h cykler av paraffin vid 60 ° C.
- Efter uttorkning, paraffin-bädda in proverna i en mögel och svalna av proverna.
- Skär proverna med en mikrotom i skivor av 5 μm tjockt.
- Innan färgning, rehydrera proverna genom att placera dem i en returnerade graderade etanol-serie. Börja med två tvättar av xylen i 5 min, följt av 2 tvättar 100%, 95% och 70% etanol för 3 min per tvätt. Slutligen, tvätta proverna 3 gånger i vatten i 2 min.
Obs: Vid användning alginat för att bearbeta prover för paraffin inbäddning, se till att tvätta bort alginat med 10 mM citronsyra före rehydrering paraffin avsnitt. - Färga av prov med hematoxylin och eosin, Safranin-O, kollagen I, och kollagen II som tidigare beskrivits11.
8. karakterisering av de cell-lösa ställningar med kvantitativa analyser
- Erhålla papain smälter av ställningar som tidigare beskrivits11.
- Utför ett test med en fluorescens-baserad DNA kvantifiering kit att mäta dubbel-strand DNA innehållet i de ställningar att säkerställa fullständig decellularization. Följa protokollet som tillhandahålls av tillverkaren. Express mängden DNA per torrvikt av ställningen.
- Utför en dimethylmethylene blå assay för att kvantifiera återstoden av GAGs inom schavotten, som tidigare beskrivits11. Express beloppet i GAG per DNA.
9. sådd av de cell-lösa ställningar
- Skär steriliserad ställningar från steg 6,7 till 3 mm tjocka skivor.
- Överföra ställningar i separata brunnar i en 6-väl-plattan.
- Rehydrera ställningar med cellodlingsmedium genom pipettering 1 mL medium ovanpå schavotten och låt det dra i 30 min. Använd antingen chondrocyte eller mesenkymala stamceller (MSC) expansion medium.
Obs: Använd samma medium för byggnadsställning rehydrering som för cellodling celler som kommer att vara seedad. Chondrocyte expansion medium består av Dulbeccos modifierade media (DMEM) med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin och 10 ng/mL fibroblast tillväxtfaktor-2 (FGF-2). MSC expansion medium består av minst viktigt medium alpha (a-MEM) med 10% Värmeinaktiverade FBS, 0,2 mM L-ascorbic syra 2-fosfat, 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin och 10 ng/mL FGF-2. - Förbered 3 x 106 celler i 100 μL av medium, som är volymen som krävs för varje Rullställning med en diameter på 8 mm och en höjd av 3 mm.
Obs: Flera celltyper från olika arter kan användas för sådd. När du använder kondrocyter eller mesenkymala stromaceller, isolera cellerna som tidigare beskrivits11. När du använder kondrocyter, se till att de inte har utökats förbi P1 passagen för att minimera antalet dedifferentiated kondrocyter. När du använder mesenkymala stromaceller, måste de testas på deras förmåga för flera härstamning differentiering, som tidigare beskrivits14. - Överför med pipett 50 μL av beredd cellsuspension ovanpå före blötläggas schavotten och inkubera ställningen för 1 h vid 37 ° C.
- Försiktigt slå på schavotten upp och ner, Pipettera de återstående 50 μl cellsuspension på denna sida av ställningen och inkubera i 1 timme vid 37 ° C.
- Efter inkubation, Lägg 3 mL medium till brunnarna, och kultur de cell-seedade ställningar vid 37 ° C. Hantera kultur plattan försiktigt för att undvika avlossning av cellerna.
- Kultur ställningar under den tid som krävs för experimentet och ändra medium 2 – 3 gånger i veckan. Pipettera långsamt och så långt bort från ställningen som möjligt.
- Efter odling av cell-seedade schavotten, skär ställningar i halv och bearbeta dem för både histologi och biokemiska analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization av CDM ställningar måste alltid bekräftas med histologiska färgningar samt använda DNA kvantifiering för att mäta mängden DNA rester. Otillräcklig decellularization kan leda till oönskad immunologiska reaktioner som påverkar resultaten i invivo inställningar15,16,17. För denna specifika decellularization metod, DNA var nedanför detektionsområdet, som började på 13,6 ± 2.3 ng/mg DNA/torr vikt (n = 3). Full decellularization använder det här protokollet kommer att leda till produktion av en byggnadsställning som är rik i kollagen typ II (figur 4 c) och har ingen celler (figur 4A) eller GAGs (figur 4B). Friska equine brosk visas som jämförelse, färgas för Safranin-O (figur 5A) och kollagen II (figur 5B).
Schavotten måste visa en makroskopiskt homogen porositet. Luftbubblor kommer att leda till lätt påvisbara stora hål i ställningen och, därför, avlägsnas noggrant. Dessa stora hål i ställningen kan ha en negativ inverkan på de mekaniska egenskaperna och leda till inhomogena cell fastsättning vid sådd. Framgångsrik produktion av ställningen innebär också ett frystorkning steg som varar i minst 24 tim. Detta kommer att leda till en byggnadsställning som har en vit utseende (figur 3). Vid otillräcklig frystorka den, ställningar kommer att ha en gulaktig färg och inga tydliga porer kan observeras.
För ställningen som ska användas för i vivo måste applikationer och in vitro-cell-sådd, cell integration med den byggnadsställning som cellulära funktionalitet, visas. Här, ställningar var seedad med MSCs som producerade ECM efter 4 (Figur 6A-D) och 6 (figur 6E-H) veckor av in vitro-odling. Bildandet av GAG, kollagen II och en perifer kollagen I, samt närvaron av celler, visades. Dessutom är specificiteten av kollagen II visas i figur 5B, där brosk men inte ben är målat positivt för kollagen II i en osteokondrala plug.
Figur 1: Equine knä efter flyttande fullhudsskador brosk. Brosk avlägsnas från de kondyler med en skalpell tills det förkalkat brosk lager som inte kan skäras med en skalpell nås. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: sekventiella steg att skapa cell-lösa brosk-derived matrix partiklar. (A) brosk skivor som har tagits bort från kondyler tvättas i en antibiotikum-infunderas lösning. (B) brosk skivor är frystorkade, och nu har en vit och pappers-liknande utseende. (C) snapin-frysning av frystorkade brosk är utförda precis innan (D) pulverisering brosk partiklar av hand-fräsning med hjälp av en mortel och stöt. Steg D kan också göras med automatisk fräsning. Denna siffra har ändrats från Benders et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: den slutliga produkten, en cell-lösa brosk-derived matrix byggnadsställning. Detta cylindriska byggnadsställning är 2 cm höga och har en diameter på 8 mm. Ställningen har en tydlig porösa struktur. Vänstra och högra bilden visar en byggnadsställning från två olika vinklar. Observera att det finns inga stora hål på ytan av ställningen som alla luftbubblorna togs bort före frystorka den. Denna siffra har ändrats från Benders et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: histologiska karakterisering av schavotten. (A) H & E färgning visar ECM partiklar av olika storlekar och avsaknad av celler. (B) Safranin-O färgning visar att ingen gag har bibehållits i den decellularization processen. (C) kollagen typ II immunolocalization avslöjar att cell-lösa partiklarna är rik på kollagen typ II. Skala barer = 500 µm. Denna siffra har ändrats från Benders et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: histologiska representation av friska equine brosk. (A) en osteokondrala plug färgas med Safranin-O och snabbt grönt visar ben utan GAGs (grön), brosk med GAGs (röd) och förkalkade brosket lagret i mellan. (B) en kollagen II-färgade osteokondrala plug fläckar brosk men inte ben. Skala barer = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: Neo-matrix bildandet på schavotten efter 4 och 6 veckor av kultur med hjälp av mesenkymala stromaceller. Efter 4 (A-D) och 6 (E-H) veckor av kultur, nybildade matris är rik i celler (A + E), kollagen II (B + F), och GAGs (C + G), som kan observeras med H & E, kollagen II och Safranin-O infärgning, respektive. Dessutom kollagen jag är närvarande efter både 4 (D) och 6 (H) veckor i peripheryen av ställningen. Celldensitet samt mängden matrix nedfall är högre vid periferin. Skala barer = 500 µm. Denna siffra har ändrats från Benders et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ECM av ledbrosk är mycket tät och ganska motståndskraftig mot olika enzymatiska behandlingar. Flerstegs decellularization protokollet beskrivs i denna artikel behandlar sådana motstånd och genererar framgångsrikt cell-lösa matriser. För att uppnå detta, spänner processen över flera dagar. Många decellularization processer har föreslagits för olika typer av vävnader18, och den här artikeln beskrivs ett protokoll som är lämplig för decellularization av brosk. I detta protokoll är det dock nödvändigt att följa enzymatisk behandling med tvättmedel steg för att ta bort alla celler. Mängden DNA är minskat anmärkningsvärt i de första stegen som involverar behandlingen med trypsin och utelämna dessa steg kommer inte att resultera i korrekt decellularization11.
Observera att detta protokoll baseras på decellularization av equine broskvävnad. Aktiviteten av enzymet lösningar används hittades tillräckligt för lämplig avlägsnande av equine kondrocyterna. Men trots bevarande av matrix sammansättning mellan arter kanske protokollet justeras för decellularization av brosk från andra djur på grund av skillnaderna i mängden naturligt bosatta kondrocyter19. Exempelvis brosk av mindre djur är kända för att ha en högre cellinnehållets, och kan därför kräva en mer aggressiv decellularization-process. Särskilda skäl för att välja equine brosk att skapa cell-lösa ställningar är att hästdjur och mänskligt brosk Visa tydliga likheter i tjocklek, cell densiteten och biokemiska make-up20.
För att säkerställa en reproducerbar produkt, kan flera bedömningskriterier vara viktigt att avgöra om fullständig decellularization har uppnåtts. I detta protokoll användes både H & E färgning och biokemiska kvantifiering för att utvärdera det resterande beloppet av DNA i slutprodukten. Andra forskare har också föreslagit att avgöra storleken på återstående DNA, med högst 200 bp i längd för kvalitet styr21eller en DNA restmängd av mindre än 50 ng/mg torr vävnad vikt18,22. Oavsett, måste ändringar i protokollet alltid följas upp med Histologisk undersökning och kvantitativa analyser att avgöra effekten av decellularization, liksom de återstående ECM-produkterna.
Den största begränsningen av detta protokoll är att den grundlig decellularization åtgärd som medför exponering för trypsin leder till omfattande förlust av GAGs. Även om trypsin inte klyva GAGs, kan orsaken till förlusten av gag vara öppningen av brosk vävnaden av trypsin klyva proteiner som ankare eller kapsla in GAGs. ECM-komponenter som GAGs är viktiga för att behålla vatten i ledbrosk och därför spela en betydande roll i den vävnad4biomekaniska motståndskraft. Protokoll som syftar till att minska förlusten av GAGs under hela decellularization kommer att påverka grundligheten av decellularization processen.
Efter decellularization, har cell integration och funktion visats i cell-seedade ställningar. Tidigare forskning har visat att matrix produktion av kondrocyter på denna byggnadsställning är otillfredsställande, särskilt i jämförelse med rikligt matrix nedfall av mesenkymala stromaceller11. Som brosk-liknande vävnad är deponerat på schavotten, deponeras denna nya matris allmänt först i peripheryen av ställningen innan de invaderar resten av ställningar. Detta tydligt kan observeras på histologiska skivor där en cell-rika periferi, snarare än en cell-rika center, är ofta sett (figur 6). Denna effekt kan dock minskas när du använder perfusion bioreaktorer för cell sådd och att förbättra näringsämnen exchange. Som matris nedfall inträffar, kommer ställningar också anta en glansigare utseende, att bli mer mekaniskt konsekventa och mindre sprött. Som sådan, kan enkelt kapas med en skalpell utan att falla isär. Egenskaperna för den nybildade matrisen kan utvärderas med hjälp av både histologiska färgningar och kvantitativa analyser. Ingen GAGs kvar efter decellularization processen, blir alla de GAGs som kan mätas kvantitativt en produkt av nysyntesen.
De ställningar som produceras med hjälp av detta decellularization protokoll ger en off-the-shelf lösning och kan implanteras utan nödvändigheten av cell-sådd före implantation. Dock när den appliceras som en behandling för (osteoartrit) chondral defekter, måste biomekaniska egenskaper förbättras för att minska risken för indrag för construct i tidiga faser av artikulära lastning. Samtidig implantation med skyddande lager på toppen, eller andra förstärkning strategier kan behöva genomföras. I framtiden kan ytterligare förfining av protokollet stärka ställningen regenerativ potential. Till exempel, lagring av GAGs, bevarandet av kollagen fiber orientering eller kombination med andra biomaterial att förstärka dessa ställningar kan vara fördelaktigt att möjliggöra en förbättrad och smidigt regenererad artikulära ytan. Därför kan dessa ställningar spela en roll som delar av nästa generation av regenerativ grafter för behandling av (osteoartrit) chondral defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna W. Boot för stöd i produktionen av ställningar. K.E.M. Benders stöds av Alexandre Suerman Stipendium från University Medical Center. R. Levato och J. Malda stöds av holländska Arthritis Foundation (bidragsavtal CO-14-1-001 och LLP-12, respektive).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlite S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
- Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
- Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
- Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
- Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
- Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J.
- Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
- Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
- Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
- Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
- Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
- Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
- Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683 (2013).
- Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).
