Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ijzeroxide Polyethyleneimine-gecoate nanodeeltjes als een voertuig voor de levering van kleine Mengend RNA aan macrofagen In Vitro en In Vivo

Published: February 5, 2019 doi: 10.3791/58660
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 2, 2, 1
1Key Laboratory of Ministry of Education for Developmental Genes & Human Diseases, Institute of Life Sciences and School of Medicine, Southeast University, 2State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials & Devices, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University
* These authors contributed equally

Summary

Beschrijven we een methode van het gebruik van polyethyleneimine (PEI)-gecoat superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes voor transfecting macrofagen met siRNA. Deze nanodeeltjes kan efficiënt siRNA leveren aan macrofagen in vitro en in vivo en stilte doel genexpressie.

Abstract

Vanwege hun cruciale rol bij het reguleren van de immuunrespons, macrofagen hebben voortdurend onderwerp geweest van intensief onderzoek en vertegenwoordigen een veelbelovend therapeutisch doel in vele aandoeningen, zoals kanker, auto-immune ziekten en atherosclerose. RNAi-gemedieerde gene zwijgen is een waardevolle benadering van keuze sonde te manipuleren macrofaag functie; echter de transfectie van macrofagen met siRNA wordt vaak beschouwd als worden technisch uitdagende en paar methodologieën gewijd aan de overdracht van siRNA aan macrofagen zijn momenteel beschikbaar. Hier presenteren we een protocol superparamagnetische ijzeroxide polyethyleneimine-gecoate nanodeeltjes (PEI-SPIONs) te gebruiken als een voertuig voor de beoogde levering van siRNA aan macrofagen. PEI-SPIONs zijn in staat van bindende en volledig condenserend siRNA wanneer de gewichtsverhouding Fe: siRNA 4 bereikt en hoger. In vitro, deze nanodeeltjes kan efficiënt leveren siRNA in primaire macrofagen, alsmede in de macrofaag-achtige RAW 264.7 cellijn, zonder afbreuk te doen aan levensvatbaarheid van de cellen in de optimale dosis voor transfectie, en, uiteindelijk, ze veroorzaken siRNA-gemedieerde doel gene zwijgen. Naast wordt gebruikt voor in vitro siRNA transfectie, vormen PEI-SPIONs ook een veelbelovende instrument voor het leveren van siRNA macrofagen in vivo. Met het oog op de gecombineerde functies van magnetische eigenschap en het gen-zwijgen vermogen, worden systemisch toegediende PEI-SPION/siRNA deeltjes verwacht niet alleen te moduleren macrofaag functie, maar ook om macrofagen image gemaakt en bijgehouden worden. Kortom, PEI-SPIONs een eenvoudige, veilige en effectieve nonviral platform voor siRNA levering aan macrofagen vertegenwoordigen zowel in vitro als in vivo.

Introduction

Macrofagen zijn een soort aangeboren immuun cellen verdeeld in alle weefsels van het lichaam, zij het in verschillende hoeveelheden. Door overlegging van een verscheidenheid van cytokines en andere bemiddelaars, zij een kritische rol spelen in de verdediging van de gastheer tegen invasie microbiële ziekteverwekkers, weefselherstel na verwonding en bij het handhaven van de weefsel homeostase1. Macrofagen zijn vanwege hun belang, voortdurend het onderwerp van intensief onderzoek. Ondanks de prevalentie in genregulatie en functie studies, siRNA-gemedieerde gene zwijgen is echter minder kans om te slagen in macrofagen, omdat deze cellen — met name primaire macrofagen — zijn vaak moeilijk te transfect. Dit kan worden toegeschreven aan een relatief hoge mate van toxiciteit meest gevestigde transfectie benaderingen waarin het celmembraan chemisch is is gekoppeld (bijvoorbeeldmet polymeren en lipiden) of fysiek (bijvoorbeelddoor electroporation en Gene geweren) verstoord te laten siRNA moleculen Kruis het membraan, daardoor drastisch verminderen van2,3van de levensvatbaarheid van de macrofagen. Macrofagen zijn bovendien speciale fagocyten rijk aan afbraakroutes enzymen. Deze enzymen kunnen schade aan de integriteit van siRNA, verzwakken haar silencing efficiëntie zelfs als gen-specifieke siRNA is afgeleverd in de cel3,4. Daarom moet een effectieve macrofaag-gerichte siRNA delivery systeem ter bescherming van de integriteit en stabiliteit van siRNA tijdens levering4.

Het wordt steeds duidelijker dat disfunctionele macrofagen zijn betrokken bij het opzetten en de progressie van bepaalde gemeenschappelijke klinische stoornissen zoals auto-immune ziekten, kanker en atherosclerose. Om deze reden, modulerende macrofaag functie met, bijvoorbeeld, siRNA, is ontstaan als een aantrekkelijke methode voor de behandeling van deze stoornissen5,6,7. Hoewel veel vooruitgang is geboekt, is een grote uitdaging van siRNA gebaseerde behandeling strategie de specificiteit van de arme cel van systemisch toegediende siRNA en de onvoldoende siRNA ICT door macrofagen, die bijgevolg tot ongewenste bijwerkingen leiden. In vergelijking met gratis nucleïnezuur therapeutics die meestal geen optimale cel selectiviteit en leiden vaak tot uit-target bijwerkingen, drug-geladen nanodeeltjes (NPs), vanwege hun spontane neiging van worden gevangen door het reticuloendotheliaal systeem, kan worden ontworpen voor passieve targeting macrofagen in vivo, waardoor verbeterde therapeutische effectiviteit met minimale bijwerkingen8. Huidige NPs onderzocht voor de levering van molecules van RNA omvatten anorganische nanocarriers en verschillende liposomen polymeren9. Onder hen toont polyethyleneimine (PEI), een type van kationische polymeren staat bindend en nucleïnezuren condenserend in gestabiliseerde NPs, de hoogste RNA capaciteit9,10te leveren. PEI nucleïnezuren beschermt tegen aantasting van het enzymatische en nonenzymatic hun overdracht bemiddelt tussen de celmembranen en bevordert hun intracellulaire vrijlating. Hoewel aanvankelijk geïntroduceerd als een DNA levering reagens, PEI bleek later een aantrekkelijk platform voor in vivo siRNA levering, hetzij lokaal of systemisch9,10.

Superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (SPIONs) hebben aangetoond grote belofte in de medische biologie, vanwege hun magnetische eigenschappen, biocompatibiliteit, vergelijkbare grootte op biologisch belangrijke objecten, hoge oppervlakte-gebied-te-volumeverhouding, en gemakkelijk aan te passen oppervlak voor bioagent bijlage11. Bijvoorbeeld, vanwege hun potentiële nut als contrast agent en snelle opname door macrofagen, zijn SPIONs ontstaan als een favoriete klinische instrument om beeld weefsel macrofagen12. Terwijl de SPIONs zijn ook uitvoerig bestudeerd als nucleïnezuur levering voertuigen11,13,14,15, om onze kennis, bevat de literatuur weinig rapporten van SPIONs als een drager voor macrofaag-gerichte siRNA levering. Voor de levering van het gen door SPIONs, is hun oppervlak meestal bekleed met een laag van hydrofiel kationische polymeren waarop negatief geladen nucleic zuren kunnen worden via een elektrostatisch proces aangetrokken en vastgebonden. Hier presenteren we een methode voor de synthese van SPIONs waarvan oppervlak wordt gewijzigd met laag-moleculair-gewicht (10 kDa), vertakte PEI (PEI-SPIONs). Deze magnetische nanoplatforms zijn dan aangewend om te condenseren siRNA, vorming van PEI-SPION/siRNA complexen waarmee siRNA vervoer in de cel. We reden dat spontane fagocytose van SPIONs door de cellen van de reticuloendotheliaal systeem16, in combinatie met het sterke vermogen van bindende en PEI-SPIONs geschikt voor het efficiënte vervoer van siRNA in condenserend nucleic zuren door PEI, maakt macrofagen. De hier gepresenteerde gegevens ondersteunen de haalbaarheid PEI-SPION/siRNA-gemedieerde gene monddood maken in macrofagen in cultuur, alsmede in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle methoden waarbij levende dieren werden uitgevoerd overeenkomstig het dier zorg en gebruiken van richtsnoeren voor het zuidoosten Universiteit, China.

1. bereiding van PEI-SPIONs

  1. Voorbereiding van oliezuur gemodificeerde SPIONs
    1. Los FeCl3•6H2O en FeSO4•7H2O in water onder de bescherming van N2.
      1. Voeg 28 g FeCl3•6H2O en 20 g FeSO4•7H,2O in 80 mL gedeïoniseerd water in een bekerglas. N2 introduceren in het water door een glazen buis en roer tot de vaste stof is opgelost.
      2. Verwarm het reactiemengsel tot 72 ° C in een opzwepende tempo van 800 rpm, gevolgd door toevoeging van 40 mL ammonia water (28%). Roer gedurende 5 min.
    2. Voeg 9 mL oliezuur ontkleuring in de bovengenoemde oplossing en roer het bij 72 ° C gedurende 3 uur.
    3. Koel de oplossing op kamertemperatuur (RT). Het neerslaan van de oplossing via magnetische scheiding.
    4. Was het neerslag met SPIONs 3 x met absolute ethylalcohol en, vervolgens, het verspreiden van het precipitaat op in 100 mL N-hexaan.
  2. Voorbereiding van dimercaptosuccinic zuur gemodificeerde SPIONs
    1. Toevoegen van 800 mg oliezuur (OA)-gewijzigd SPIONs verspreid in 200 mL N-hexaan en 400 mg dimercaptosuccinic zuur (DMSA), gedispergeerd in 200 mL aceton, in een drie-nek maatkolf in een waterbad bij 60 ° C.
      Opmerking: Om te bepalen van de concentratie van OA gemodificeerde SPION verkregen uit de vorige stap, neem een klein volume (b.v. 1 mL) van de SPION dispersie, vormen de N-hexaan en weegt het resulterende poeder.
    2. Voeg 200 µL van triethylamine ontkleuring in de bovengenoemde oplossing met roeren bij 1000 omwentelingen per minuut en maagzuur.
    3. Na 5 h van roeren en maagzuur, krijgt u een zwarte neerslag door magnetische scheiding.
    4. De hydrofiele SPIONs in gedeïoniseerd water homogeen verspreiden door de pH van de oplossing met behulp van tetramethylammoniumhydroxide aan te passen.
  3. Voorbereiding van PEI-SPIONs
    1. Toevoegen van de SPION DMSA-bewerkt colloïdale oplossing ontkleuring in PEI oplossing (10 kDa) in een maatkolf van 500 mL drie-nek onder mechanische roeren bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 2 uur (WFe: WPEI = 1:3).
      Opmerking: De kosten en de grootte van PEI-SPIONs afhankelijk van de verhouding van WFe naar WPEI. De W-Fe: WPEI verhouding van 1:3 kan een goed uitgangspunt voor de synthese van PEI-SPIONs geschikt voor siRNA levering.
    2. Toevoegen van de resulterende oplossing in een buis van de ultrafiltratie met een molecuulgewicht cutoff van 100 kDa en een inhoud van 15 mL; vervolgens, centrifuge op 5400 x g gedurende 10 minuten totdat de resterende oplossing 1 mL is. Voeg gedeïoniseerd water toe aan de oplossing voor het maken van het volume 15 mL opnieuw en herhaal het bovenstaande proces 10 x te verkrijgen van het eindproduct. Vervolgens, filtreer de oplossing door een filter van 0.22-μm en slaan het eindproduct bij 4 ° C.
    3. Bepaal de concentratie van de Fe van PEI-SPIONs door de colorimetrische methode met behulp van phenanthroline17. PEI-SPIONs met gedeïoniseerd steriel water tot een concentratie van 1 mg Fe/mL verdund en op te slaan bij 4 ° C.
    4. Verdun 10 μL van de PEI-SPION oplossing (1 mg Fe/mL) tot 1 mL met gedeïoniseerd water; vervolgens test de hydrodynamische grootte en zeta potentiële door een dynamische licht-verstrooiing apparaat.
      Opmerking: Bereiden PEI-SPIONs in het bereik van ongeveer 30-50 nm. In deze grootte lijkt het effect van de NP-grootte op siRNA bindende en cellulaire opname niet significant te zijn. PEI-SPIONs rekening houdend met een gemiddelde zeta potentieel meer dan +37 mV kan giftige in het dosisinterval voor transfectie, en een bepaling van de cytotoxiciteit moet worden uitgevoerd om veiligheid te garanderen. De oppervlakte lading en hydrodynamische grootte van de nanodeeltjes kunnen een gewenste bereik worden bestuurd door de PEI-inhoud aan te passen.

2. voorbereiding en Agarose de Elektroforese van het Gel van PEI-SPION/siRNA NPs

  1. Verdunde siRNA met RNase-gratis water tot het opleveren van een eindconcentratie van 20 μM (0,26 μg/l).
  2. Vijf RNase-vrije microcentrifuge buizen label 0, 1, 2, 4 en 8 voorbereiden. De etiketten vertegenwoordigen verschillende Fe: siRNA gewicht ratio's. Pipetteer 3 μL van siRNA oplossing voor alle buizen (~0.8 μg van siRNA/buis).
  3. 0, 0.8, 1.6, 3.2 en 6,4 μg Fe in de vorm van PEI-SPIONs aan de buizen met 0, 1, 2, 4 en 8, respectievelijk het label toevoegen. Houd het volume van de totale steekproef voor elke buis minder dan 20 μL. Meng door zachtjes op en neer pipetteren.
  4. Incubeer de mengsels op RT gedurende 30 minuten om PEI-SPION/siRNA complexvorming. Tijdens deze periode, maken een 3% agarose gel met hoge zuiverheid agarose.
    Opmerking: Extra PEI-SPION/siRNA complexen met andere Fe: siRNA ratio's (b.v.5 of 6) kunnen worden voorbereid en getest.
  5. Voeg 1 μl van 6 x DNA-laden buffer per 5-μL monster en meng voorzichtig. Laden van alle monsters en draaien van elektroforese op 5 V/cm totdat het bromophenol blauw zoveel tweederde van de lengte van de gel migreert. Vlek de gel met ethidiumbromide (EB) voor 15-20 min.
    Opmerking: Vers bereide elektroforese buffer en EB oplossing moeten worden gebruikt.
  6. Visualiseren van siRNA banden onder een UV-imaging systeem. Controle van de Fe: siRNA verhoudingen op welke siRNA vormen complexen met PEI-SPIONs en, dientengevolge, de bands vertegenwoordigen gratis siRNA zijn achtergebleven of niet aantoonbaar.

3. de transfectie van RAW264.7 macrofagen In Vitro

  1. Cultuur muis macrofaag-achtige RAW264.7 cellen in een 10-cm schotel met behulp van DMEM voltooien gemiddeld met 10% foetale runderserum (FBS) per 100 U/mL penicilline per 100 μg/mL streptomycine bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
  2. Een dag voorafgaand aan de transfectie, gecombineerd worden overgedragen door de cellen en spoel ze af met fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7.4). Voeg 1 mL trypsine van 0,25% naar de 10-cm schotel. Trypsinize RAW264.7 cellen voor ongeveer 5-10 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
  3. Wanneer de meerderheid van de cellen hebben losgekoppeld (na 5-10 min), voeg 5 mL van DMEM compleet medium naar de schotel naar de inactivering van de trypsine. Pipetteer omhoog en omlaag te verspreiden van cel clusters in afzonderlijke cellen.
  4. De celsuspensie overbrengen in een steriele 15 mL conische buis. Centrifugeer het bij 300 x g gedurende 3 minuten op RT. Verwijder de bovendrijvende substantie.
  5. Resuspendeer de cellen met 5 mL verse DMEM volledige voedingsbodem en cellen tellen.
  6. Plaat 9 x 104 cellen per goed in een 6-well plaat met 2 mL van volledige DMEM medium en Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende ongeveer 24 uur.
    Opmerking: Als een plaat van een verschillende grootte, de vergulde celdichtheid in verhouding tot de relatieve oppervlakte zodanig aanpassen dat de cellen 80% confluentie ten tijde van de transfectie bereiken.
  7. Als cel confluentie is 80%, het medium van de cellen verwijderen en vervangen door 1 mL van de volledige medium DMEM per putje. Terug de plaat naar de incubator totdat PEI-SPION/siRNA complexen zijn opgesteld en klaar voor gebruik (ongeveer 30 min zijn).
  8. Bereiden van PEI-SPION/siRNA complexen: berekent het bedrag van PEI-SPION/siRNA complexen die nodig zijn voor een experiment van de transfectie. Meng in een 1.5-mL RNase-vrije microcentrifuge buis, een passend bedrag van PEI-SPIONs met siRNA bij een bepaalde Fe: siRNA verhouding. Bijvoorbeeld, ter voorbereiding van PEI-SPION/siRNA NPs met 100 µg Fe bij een Fe: siRNA-verhouding van 4, voeg 100 µL (1 mg Fe/mL) van PEI-SPIONs tot 96 μL van siRNA (0,26 μg/l), gevolgd door het mengen zachtjes met een micropipet. Incubeer gedurende 30 min op RT.
    Opmerking: Bereiden een volume van PEI-SPION/siRNA complex dat is 10% meer dan de totale definitieve massa aan account voor eventuele incidentele verliezen. Maak PEI-SPION/siRNA complexen op lage Fe: siRNA ratio's, waaronder siRNA moleculen zijn volledig geladen op PEI-SPIONs en, vandaar, kleine hoeveelheden PEI-SPIONs kunnen worden gebruikt om te minimaliseren van potentiële cytotoxiciteit. Proefprojecten (gel retardatie assay) voor de optimalisatie van de Fe: siRNA verhouding zijn noodzakelijk.
  9. Nemen de 6-well plaat boven de incubator (stap 3.7). Een vereiste volume van PEI-SPION/siRNA complex ontkleuring toevoegen aan elk putje en swirl van de plaat voorzichtig zodat een gelijkmatige verdeling. Terug de plaat naar de incubator tot de beoordeling van de cellulaire opname of gene vechtpartij efficiëntie (1-3 d).
    Opmerking: Transfecting macrofagen met PEI-SPION/siRNA bij een concentratie van ~ 15 μg Fe/mL kunnen transfectie efficiëntie maximaliseren terwijl het minimaliseren van potentiële cytotoxiciteit.

4. systemische levering van siRNA aan macrofagen in ratten met experimentele artritis

  1. Het verkrijgen van specifieke pathogenen vrije mannelijke Wistar ratten die 7 oud weken. Koeien de rats voor 7 d vóór gebruik en hen te voorzien van voldoende voedsel en water. Induceren adjuvans artritis (AA) in de rats als eerder beschreven18.
  2. PEI-SPION/siRNA complexen zoals beschreven in stap 3.8 voor te bereiden.
  3. Injecteren de PEI-SPION/siRNA NPs (0.3 mg van siRNA/kg) in de AA ratten via de ader van de staart. Beoordelen de cellulaire opname via, bijvoorbeeld stroom cytometry weefsel ook via, bijvoorbeeld, een real-time fluorescentie imaging systeem, of therapeutische effecten op basis van, bijvoorbeeld, radiografische, klinische en histologische analyses op gewenste tijdstip punten18.
    Opmerking: Voor cellulaire en weefsel ook studies, behandelen de ratten met een enkele injectie van de gewenste NPs; voor therapeutische studies, de ratten te injecteren met de NPs geteste 1 x per week gedurende drie opeenvolgende weken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De grootte en de zeta potentieel van PEI-SPIONs bereid met dit protocol werden in het bereik van 29-48 nm (polydispersiteit index: 0.12 - 0.23) en 30-48 mV, respectievelijk. Ze waren stabiel in water bij 4 ° C voor meer dan 12 maanden zonder duidelijk aggregatie. Om te beoordelen hun siRNA bindend vermogen, waren PEI-SPIONs gemengd met siRNA op verschillende Fe: siRNA gewicht verhoudingen. Figuur 1 laat zien dat wanneer de gewichtsverhouding Fe: siRNA bereikt 4 en hoger, de band van gratis siRNA was volledig ontbreekt, impliceert succesvolle siRNA binding aan PEI-SPIONs. Een belangrijke zorg van PEI in biomedische toepassing is de giftigheid, dat een gevolg van de sterk positieve lading, vooral bij hoge molecuulgewicht en hoge doses is. Zoals aangegeven in figuur 2A, PEI-SPIONs met een zeta potentieel van deed 30.5 en 37 mV niet vertonen duidelijke cytotoxiciteit bij concentraties tot 30 μg Fe/mL, dat is ongeveer tweeledig hoger is dan de concentratie (15 μg Fe/mL), meestal gebruikt voor cel transfectie. Echter, PEI-SPIONs met een potentieel zeta van 48 mV waren giftige zelfs bij de laagste dosis die onderzocht (10 μg Fe/mL). Daarom, PEI-SPIONs bezitten een lading-afhankelijke toxiciteit. Aangezien kationische kosten niet belangrijk voor de opname van de NP door macrofagen19 is, we raden PEI-SPIONs met een gemiddelde zeta potentieel niet hoger dan +37 mV worden gebruikt voor de overdracht van siRNA, hoewel siRNA bindend zou het afnemen van de lading tot op zekere hoogte en verlichten van cytotoxiciteit18.

Om te testen de mogelijke toepassing van PEI-SPIONs voor siRNA levering aan macrofagen, werd de transfectie in vitro uitgevoerd met de lymfkliertest macrofaag cellijn ruwe 264.7. Zoals geanalyseerd door stroom cytometry, werden meer dan 90% van de cellen transfected met fluorescently geëtiketteerde PEI-SPION/siRNA complexen op 15 µg Fe/mL (figuur 2B). Ten aanzien van transfectie efficiëntie was er eigenlijk geen verschil tussen PEI-SPION/siRNA NPs gevormd op Fe: siRNA gewicht ratio's van 4 en 8, hoewel, onder de laatste voorwaarde, de NPs die werden gevormd waren kleiner en zwakker in positieve lading omdat een mindere hoeveelheid siRNA was geladen per deeltje. We ook beoordeeld het effect van PEI-SPION/siRNA concentratie op cellulaire internalisering door Pruisisch blauw kleuring. Zoals blijkt uit figuur 2C, waren de blauwe vlekken binnen transfected cellen minimaal waarneembare op 7,5 µg Fe/mL, maar duidelijk zichtbaar op de 15 µg Fe/mL. Interessant, verhogen verhoging van de concentratie van de PEI-SPION/siRNA op 32 µg Fe/mL niet de kleuring intensiteiten, waarschijnlijk omdat de PEI-SPION/siRNA opname werd verzadigd bij concentraties rond 15 µg Fe/mL. Bovendien, de mogelijkheid van PEI-SPIONs voor de overdracht van siRNA bemiddelen in primaire macrofagen18werd bevestigd, en de methode die hier gepresenteerd had een hoge siRNA transfectie efficiëntie in rat peritoneale macrofagen, gelijkwaardig is aan die in RAW264.7 cellen. De peritoneale macrofagen transfected met PEI-SPIONs herbergen specifieke siRNA toonde een significante afname in het streefniveau van mRNA ten opzichte van niet-specifieke siRNA (figuur 2D), hetgeen impliceert dat siRNA kon ontsnappen aan endocytose blaasjes in de cytoplasma en bereik het RNAi-machines.

We onderzochten ook eerder de in vivo cellulaire opname van systemisch toegediende PEI-SPION/siRNA complexen in ratten met adjuvans artritis18. We geanalyseerd PEI-SPION/siRNA transfectie efficiëntie in fagocytische macrofagen en nonphagocytic T-lymfocyten. Zoals blijkt uit Figuur 3, pakte CD11b + cellen PEI-SPION/siRNA complexen efficiënter dan CD3 + cellen op elk punt van de tijd in al de organen onderzocht, die aangeeft dat de PEI-SPION/siRNA NPs macrofagen18bij voorkeur richten. Met name werd een hoog niveau accumulatie van de NPs waargenomen in ontstoken gewrichten18, wat suggereert dat de PEI-SPION een aantrekkelijk platform voor de systemische levering van siRNA therapeutics bij reumatoïde artritis waarvan pathogenese is gekoppeld kunnen aan macrophage dysfunctie en voor welke lokale siRNA administratie is niet een favoriete keuze als gevolg van de betrokkenheid van meerdere organen van de ziekte.

Figure 1
Figuur 1: Agarose de Elektroforese van het gel van PEI-SPION/siRNA complexen op verschillende Fe: siRNA (w/w) verhoudingen gevormd. Een Fe: siRNA verhouding tussen 0 vertegenwoordigt gratis siRNA duplexen zonder PEI-SPIONS. De gemiddelde grootte en zeta potentieel van de gratis PEI-SPIONs hier gebruikt werden 30 nm en 45 mV. siRNA volledig kon binden aan PEI-SPIONs wanneer de verhouding tussen de Fe: siRNA 4 bereikt en hoger, conform de resultaten van de vorige PEI-SPIONs met een gemiddelde grootte van 48 nm en een potentieel zeta van 30.5 mV-18. Het ontbreken van achtergebleven bands (PEI-SPION/siRNA complexen) kan weerspiegelen ontoegankelijkheid van siRNA aan EB tijdens kleuring, een indicatie van sterke siRNA bindende en/of het condenserende vermogen van PEI-SPIONs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: biologische karakterisering van PEI-SPION en PEI-SPION/siRNA NPs. (A) dit paneel toont een cel levensvatbaarheid assay. RAW 264.7 cellen werden behandeld voor 16 h met de aangegeven doses van PEI-SPIONs rekening houdend met verschillende zeta potentieel, en vervolgens een MTS-assay werd uitgevoerd. De levensvatbaarheid van de cellen was genormaliseerd tegen het besturingselement (geen deeltje blootstelling). De gegevens zijn de gemiddelde ± SD van dubbele wells. (B) dit paneel toont een flow cytometrische analyse van de PEI-SPION/Cy3-siRNA-opname door RAW 264.7 cellen. De cellen werden geïncubeerd gedurende 24 uur met 15 µg Fe/mL (bovenste deelvenster) of 5 μg Fe/mL (lagere paneel) PEI-SPIONs complexvorm met Cy3-geëtiketteerden siRNA op een Fe: siRNA (w/w) verhouding tussen de 4 en 8, respectievelijk. Nonspecific (NC) siRNA vertegenwoordigt niet-fluorescerende siRNA. M2: gated regio; De intensiteit van de fluorescentie van de PE-H: Cy3. De siRNA transfectie efficiëntie van PEI-SPIONs gebruikt hier (37,8 nm, 48 mV) is vergelijkbaar met een eerdere studie PEI-SPIONs met een gemiddelde grootte van 48 nm en een potentieel zeta van 30.5 mV-18. (C) dit deelvenster bevat een analyse van PEI-SPION/siRNA opname door het visualiseren van cellulaire ijzer deposito's. RAW 264.7 cellen werden geïncubeerd met 7.5, 15 en 32 μg Fe/mL PEI-SPIONs (48 nm, 30,5 mV) complexvorm met siRNA (Fe: siRNA = 8) en gekleurd door Pruisisch blauw. De schaal bars zijn 20 μm. (D) dit paneel toont een in vitro -validatie van de silencing efficiëntie van siRNA geleverd door PEI-SPIONs. Een specifieke targeting siRNA rat IL-2 receptor /-15 β-keten was geladen op PEI-SPIONs (48 nm, 30,5 mV) = 8 bij Fe: siRNA en, vervolgens, transfected in rat peritoneale macrofagen. Een NC-siRNA werd gebruikt als controle. Het gen silencing effect werd beoordeeld door kwantitatieve PCR. De cellen werden geïncubeerd met de complexen op 15 μg Fe/mL. De gegevens zijn de gemiddelde ± de SD drievoudige Wells. Deelvenster D is van Duan et al. gewijzigd 18 met toestemming van de uitgever. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: In vivo cellulaire opname van PEI-SPION/siRNA NPs. Drie artritis ratten werden intraveneus ingespoten met een enkelvoudige dosis van 0,3 mg/kg Cy3-siRNA geformuleerd met PEI-SPION (48 nm, 30,5 mV). Een rat geïnjecteerd met PBS werd gebruikt als een besturingselement. Bloed, milt, lever, nier en ontstoken gewrichten werden verzameld op 2, 8 en 24 uur na de injectie. De cellulaire opname van PEI-SPION/Cy3-siRNA NPs werd beoordeeld door cytometry van de stroom met behulp van anti-CD3 (A) en (B) anti-CD11b monoklonale antilichamen. De percentages zijn van Cy3-siRNA opname binnen de omheinde CD3 + of CD11b + cellen. De resultaten die hier worden weergegeven zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van Duan et al. 18 met toestemming van de uitgever. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Macrofagen zijn vuurvast tot transfect door veelgebruikte nonviral benaderingen, zoals electroporation, kationische liposomen, en lipide-soorten. Hier beschreven we een betrouwbare en efficiënte methode om transfect van macrofagen met siRNA. Met behulp van het huidige protocol, kunnen meer dan 90% van macrofaag-achtige RAW 264.7 cellen (figuur 2B) en rat peritoneale macrofagen18 zijn transfected met siRNA zonder aanzienlijke waardevermindering van de levensvatbaarheid van de cellen. Deze methode hangt af van de levering platform PEI-SPION, die is een nanocarrier bestaande uit een kern van ijzeroxide en een schelp van PEI. Dus, de eerste belangrijkste stap van het protocol is de synthese van PEI-SPIONs geschikt voor siRNA levering. Meestal, worden PEI-gecoate SPIONs bereid uit oliezuur beklede SPIONs door een ligand-uitwisseling methode waarin oliezuur is direct van het oppervlak van SPIONs door uitgewisseld PEI of zijn derivaten15, genereren van hydrofiele NPs met een positief geladen oppervlak. In het geval hier gepresenteerd, de oliezuur afgetopt op het oppervlak van SPIONs werd vervangen door de in water oplosbare dimercaptosuccinic zuur, en vervolgens PEI in SPION oppervlakken door middel van elektrostatische interacties werd geladen. Deze methode is zacht en makkelijk te bereiden in grote hoeveelheden, en de gesynthetiseerde NPs hebben uitstekende stabiliteit in water20. Het is bekend dat PEI cytotoxisch is, en de toxiciteit sterk met zijn moleculair gewicht21 correleert. Om veiligheid te garanderen, is een belangrijke overweging als synthese van PEI-SPIONs dat deze deeltjes zijn bekleed met een laag-moleculair-gewicht PEI, oftewel 10 kDa in dit protocol. Het ongewenste toxische effect van PEI wordt voornamelijk gemedieerd door haar positieve lading; Dus, het meten van het potentieel van de zeta van PEI-SPIONs is van essentieel belang, en de waarde mogen niet hoger dan 37 mV. Een afname van de positieve lading kan eenvoudig door het verminderen van de PEI-inhoud worden bereikt. Een andere belangrijke stap voor de succesvolle toepassing van deze siRNA uitvoeringssysteem is het optimaliseren van de verhouding van de Fe: siRNA door gel retardatie. Het lijkt redelijk om PEI-SPION/siRNA complexen op lage Fe: siRNA verhoudingen onder welke siRNA moleculen nog in staat van binding aan PEI-SPIONs zijn. In dit geval kunnen kleine hoeveelheden PEI-SPIONs worden gebruikt, dus het minimaliseren van de potentiële cytotoxiciteit.

In het geval dat een gewenste silencing efficiëntie of therapeutische werking wordt niet geproduceerd, controleren stroom cytometry of fluorescentie microscopie de drager beladen met een fluorescently geëtiketteerde siRNA de transfectie efficiëntie. U kunt ook kan de PEI-SPION/siRNA opname worden onderzocht door conventionele Pruisisch blauw kleuring, die is gevoelig genoeg voor het detecteren van enkele korrels van ijzer in de cellen. Als de efficiëntie van de transfectie inderdaad laag is, kan het optimaliseren van de transfectie aandoeningen zoals celdichtheid, transfectie tijd, en de dosis van PEI-SPION/siRNA deeltjes worden vereist. De passage celaantal kan ook invloed hebben op de efficiëntie van de transfectie22. In de meeste gevallen wordt een onvoldoende silencing effect niet veroorzaakt door een onvoldoende opname van PEI-SPION/siRNA, zoals het huidige systeem van PEI-SPION is aangetoond om een effectieve siRNA overdracht naar macrofagen. Het combineren van verschillende siRNAs gericht op hetzelfde gen kunnen soms een goede strategie om vechtpartij efficiëntie te vergroten. Het is opmerkelijk dat, hoewel RNAi in het algemeen binnen 24 uur van transfectie optreedt, het begin en de duur van het gen silencing afhangen van het percentage van de omzet van het doel, de mate van verdunning en levensduur van siRNA en zelfs de concentratie van serum in het medium. Dus, tijd cursus experimenten kunnen nodig zijn om nauwkeurig het bepalen van het punt van de tijd van maximaal effect2,22. Voor in vivo toepassing, de therapeutische werking ook afhankelijk is van of en in hoeverre het doel siRNA bijdraagt aan ziekte fenotypen; Dus, de keuze van een geschikte siRNA doelwit is essentieel voor de verwachte resultaten.

Er zijn verschillende voordelen van dit protocol voor het leveren van siRNA aan macrofagen. (1) de methode is gemakkelijk uit te voeren is een goedkope manier om PEI-SPIONs produceren in grote hoeveelheden en de NPs geproduceerd zijn stabiel in water voor meer dan 12 maanden als ze worden bewaard bij 4 ° C. (2) spontane fagocytose van SPIONs door macrofagen vergemakkelijkt de overdracht van een effectieve PEI-SPION-gemedieerde siRNA, wat resulteert in hoge transfectie efficiëntie. Verwacht wordt dat naast RAW 264.7 cellen en rat peritoneale macrofagen, deze aanpak voor andere macrofaag cellijnen en primaire macrofagen, geldt zolang de dosis voor transfectie is geoptimaliseerd. (3) siRNA transfectie is snel en gemakkelijk uit te voeren vergeleken met andere methoden van de transfectie macrofaag zoals nucleofection, die tijdrovend en vereist een Nucleofector apparaat2. (4) PEI-SPION kunnen een ideale voertuig voor systemische siRNA macrofaag-gerichte levering in bepaalde modellen van de ziekte. Macrofagen spelen een kritieke rol in de ontwikkeling en de progressie van verschillende chronische inflammatoire aandoeningen, evenals tumoren; en opvallende histologische feature van deze ziekten is de abnormale bloedvaten met lekkende endotheel. Vandaar, als gevolg van de verbeterde permeabiliteit en het effect van de retentie, systemisch toegediende drugs-geladen NPs hebben de neiging om te accumuleren in zieke weefsels worden gemakkelijk gevangen door lokale macrofagen, wat leidt tot verbeterde specificiteit, bijwerkingen verminderd en verbeterd therapeutische werking. In het model van een rat van adjuvante artritis, zijn intraveneus ingespoten PEI-SPION/siRNA complexen overgenomen door ~ 40% van de CD11b +-cellen gedurende de eerste 24 uur na de injectie18. In tegenstelling, toen kationische liposoom werd gebruikt als drager voor systemische siRNA levering in muizen, minder dan 5% van de CD11b + cellen in de artritis gewrichten in de val gelokt de siRNA lipoplexes23. Bovendien, als gevolg van hun magnetische eigenschappen, de toepassing van een extern magnetisch veld kan verder vergemakkelijken de accumulatie van PEI-SPION/siRNA complexen in de weefsels van de doelgroep en verhogen hun cellulaire opname. Ook is opmerkelijk dat dergelijke siRNA-geladen NPs niet alleen voor het moduleren van macrofaag functie, maar ook voor imaging macrofaag kunnen worden gebruikt om diagnostische gegevens over de werkzaamheid van monitor behandeling, en patiënten klinische resultaten12voorspellen.

Echter, de beperkingen die zijn gekoppeld aan dit protocol bestaan. Het PEI-SPION systeem vertoont een smalle waaier van dosering voor siRNA levering. De maximale opname gebeurde toen RAW264.7 cellen werden blootgesteld aan PEI - SPION/siRNAs bij een concentratie van 15 µg Fe/mL (figuur 2B en 2 C). Verhoging van de concentratie van de PEI-SPION/siRNA op 32 µg Fe/mL niet resulteren in een toename van de cellulaire opname (figuur 2C) maar, integendeel, het risico van inducerende celdood als gevolg van de intrinsieke toxiciteit van PEI kan verhogen. Aan de andere kant, verminderd PEI-SPION/siRNA daalt tot 5- of 7.5 µg Fe/mL duidelijk zijn ICT door RAW264.7 cellen (figuur 2B en 2 C). Daarom stellen wij voor dat de optimale PEI-SPION/siRNA concentratie voor in vitro macrofaag transfectie ~ 15 µg Fe/mL (de uiteindelijke concentratie in een put is). Een andere beperking dat moet in aanmerking worden genomen is het mogelijke effect van PEI-SPIONs op de macrofaag activiteit. Nanodeeltjes veroorzaken de immuunrespons24, afhankelijk van hun oppervlakte modificatie, oppervlakte kosten, grootte, vorm, en zelfs op de methodologie die wordt gebruikt voor het synthetiseren van hen. Mulens-Arias et al. rapporteerde onlangs dat PEI-gecoate SPIONs trigger macrofaag activering25. De methode van PEI-SPION synthese gepresenteerd hier verschilt aanzienlijk van die van Mulens-Arias et al., en daarom, of PEI-SPIONs bereid op basis van de huidige protocol trigger macrofaag activering wacht op verder onderzoek. Echter om ondubbelzinnig aan deze bezorgdheid, wij stellen voor dat, naast de PEI-SPION complexvorm met scramble siRNA, het voertuig zelf (alleen PEI-SPION) kan dienen als een ander besturingselement bij gebruik van dit protocol. Tot slot, dit protocol is niet geschikt voor de levering van DNA als gevolg van de relatief grote omvang.

Kortom, wij hier een methode van het gebruik van PEI-gecoate SPIONs als een voertuig voor siRNA transfectie in macrofagen gepresenteerd. Deze NPs kunnen efficiënt leveren siRNA in vereeuwigd macrofaag cellijnen, maar ook in primaire macrofagen in vitroen functioneel bewegen gene monddood maken zonder gevolgen voor de levensvatbaarheid van de cellen in de optimale dosis voor Transfectie. Bovendien, PEI-SPIONs kan worden gebruikt voor in vivo siRNA levering aan macrofagen, die het mogelijk maken om beeld, evenals moduleren, macrofagen waarvan dysfunctie draagt bij aan de ontwikkeling en de progressie van veel chronische inflammatoire aandoeningen en kankers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (81772308) en de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (nr. 2017YFA0205502).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco C11995500BT Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum Gibco A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) Gibco 15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit Promega G3582 For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China TCM13
Tissue culture plates (6-well) Corning 3516
Tissue culture dishes (10 cm) Corning 430167
RNase-free tubes (1.5 ml) AXYGEN MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430791
Trypsin Gibco 25200-056
Wistar rats Shanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder National
Institutes for Food and Drug Control, China		 for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa) Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. E107079
Ammonia water Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. A112077
Oleic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. O108484
Dimethylsulfoxide Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D103272
FeSO4•7H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012118
FeCl3•6H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011918
Dimercaptosuccinic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D107254
ultrafiltration tube Millipore UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. T100882
Particle size and zeta potential analyzer Malvern, England Nano ZS90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
  2. Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  3. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , Springer. 123-143 (2009).
  4. Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
  5. Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
  6. Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
  7. Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
  8. Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
  9. Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  10. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
  11. Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
  12. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
  13. Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
  14. Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
  15. Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
  16. Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
  17. Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
  18. Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
  19. Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
  20. Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
  21. Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
  22. Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
  23. Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
  24. Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
  25. Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).

Tags

Geneeskunde kwestie 144 Macrophage transfectie nanoparticle siRNA levering polyethyleneimine voertuig gene zwijgen
Ijzeroxide Polyethyleneimine-gecoate nanodeeltjes als een voertuig voor de levering van kleine Mengend RNA aan macrofagen <em>In Vitro</em> en <em>In Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jia, N., Wu, H., Duan, J., Wei, C.,… More

Jia, N., Wu, H., Duan, J., Wei, C., Wang, K., Zhang , Y., Mao, X. Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (144), e58660, doi:10.3791/58660 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter