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Polyethyleneimine-लेपित आयरन ऑक्साइड छोटे हस्तक्षेप आरएनए के वितरण के लिए एक वाहन के रूप में नैनोकणों में और Vivo में मैक्रोफेज

Published: February 5, 2019 doi: 10.3791/58660
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 2, 2, 1
1Key Laboratory of Ministry of Education for Developmental Genes & Human Diseases, Institute of Life Sciences and School of Medicine, Southeast University, 2State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials & Devices, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University
* These authors contributed equally

Summary

हम मैक्रोफेज के साथ transfecting सिरना के लिए polyethyleneimine (पी)-लेपित superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों का उपयोग करने की एक विधि का वर्णन । इन नैनोकणों को कुशलतापूर्वक सिरना में मैक्रोफेज करने के लिए और vivo और मौन लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति में उद्धार कर सकते हैं ।

Abstract

प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका की वजह से, मैक्रोफेज लगातार गहन अनुसंधान का विषय रहा है और ऐसे स्व-प्रतिरक्षित रोग, atherosclerosis, और कैंसर के रूप में कई विकारों में एक होनहार चिकित्सकीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । RNAi-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने चुनाव की जांच करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है और मैक्रोफेज समारोह में हेरफेर; हालांकि, सिरना के साथ मैक्रोफेज के अभिकर्मक अक्सर तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण माना जाता है, और, वर्तमान में, कुछ के तरीके मैक्रोफेज को सिरना हस्तांतरण के लिए समर्पित उपलब्ध हैं । यहां, हम सिरना के लिए मैक्रोफेज के लक्षित वितरण के लिए एक वाहन के रूप में polyethyleneimine लेपित superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (पी-SPIONs) का उपयोग करने का एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । पी-SPIONs बाध्यकारी और पूरी तरह से संघनित्र सिरना जब Fe: सिरना वजन अनुपात 4 और ऊपर तक पहुंच में सक्षम हैं । इन विट्रो में, इन नैनोकणों कुशलतापूर्वक प्राथमिक मैक्रोफेज में सिरना उद्धार कर सकते हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में मैक्रोफेज-कच्चे २६४.७ सेल लाइन की तरह, अभिकर्मक के लिए इष्टतम खुराक पर सेल व्यवहार्यता समझौता किए बिना, और, अंततः, वे प्रेरित सिरना-मध्यस्थता लक्ष्य जीन मुंह बंद करने. इसके अलावा इन विट्रो में के लिए इस्तेमाल किया जा रहा सिरना अभिकर्मक, पी-SPIONs भी vivo मेंमैक्रोफेज करने के लिए सिरना पहुंचाने के लिए एक आशाजनक उपकरण हैं । चुंबकीय संपदा और जीन-मुंह बंद करने क्षमता की अपनी संयुक्त सुविधाओं को ध्यान में रखते हुए, प्रणालीबद्ध प्रशासित पी-SPION/सिरना कणों की अपेक्षा की जाती है न केवल मैक्रोफेज समारोह का नियमन करने के लिए बल्कि मैक्रोफेज को भी सक्षम करने के लिए imaged और ट्रैक किया जा सकता है । संक्षेप में, पी-SPIONs सिरना वितरण के लिए एक सरल, सुरक्षित, और प्रभावी गैर वायरल मंच का प्रतिनिधित्व दोनों विट्रो में और vivo मेंमैक्रोफेज ।

Introduction

मैक्रोफेज शरीर के सभी ऊतकों में वितरित जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक प्रकार है, हालांकि अलग मात्रा में । साइटोकिंस और अन्य मध्यस्थों की एक किस्म का उत्पादन करके, वे चोट के बाद ऊतक मरम्मत में माइक्रोबियल रोगजनकों पर हमला करने के खिलाफ मेजबान रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और ऊतक homeostasis1बनाए रखने में । इनके महत्व के कारण मैक्रोफेज लगातार गहन शोध का विषय रहा है. हालांकि, जीन विनियमन और समारोह के अध्ययन में अपनी व्यापकता के बावजूद, सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने कम मैक्रोफेज में सफल होने की संभावना है क्योंकि इन कोशिकाओं को विशेष रूप से, प्राथमिक मैक्रोफेज-अक्सर transfect मुश्किल है । यह सबसे अच्छी तरह से स्थापित अभिकर्मक दृष्टिकोण जिसमें कोशिका झिल्ली रासायनिक है के साथ जुड़े विषाक्तता के एक अपेक्षाकृत उच्च डिग्री करने के लिए जिंमेदार माना जा सकता है (जैसे, पॉलिमर और लिपिड के साथ) या शारीरिक रूप से (जैसे, electroporation द्वारा और जीन बंदूकें) दो सिरना अणुओं झिल्ली को पार करने के लिए बाधित है, जिससे काफी ' मैक्रोफेज व्यवहार्यता को कम करने2,3। इसके अलावा, मैक्रोफेज degradative एंजाइमों में अमीर फ़ैगोसाइट समर्पित कर रहे हैं । इन एंजाइमों सिरना की अखंडता को नुकसान पहुंचा सकते हैं, भले ही जीन विशिष्ट सिरना सेल3,4में दिया गया है अपनी मुंह बंद करने दक्षता कमजोर । इसलिए, एक प्रभावी मैक्रोफेज-लक्षित सिरना वितरण प्रणाली अखंडता और सिरना की स्थिरता की रक्षा के लिए4प्रसव के दौरान की जरूरत है ।

यह तेजी से स्पष्ट है कि बेकार मैक्रोफेज दीक्षा और स्व-प्रतिरक्षित रोग, atherosclerosis, और कैंसर जैसे कुछ आम नैदानिक विकारों की प्रगति में फंसा रहे हैं । इस कारण के लिए, के साथ मैक्रोफेज समारोह मॉडुलन, उदाहरण के लिए, सिरना, इन विकारों के इलाज के लिए एक आकर्षक पद्धति के रूप में उभर रहा है5,6,7. हालांकि बहुत प्रगति की गई है, सिरना के एक प्रमुख चुनौती आधारित उपचार रणनीति प्रणालीबद्ध प्रशासित सिरना के गरीब कोशिका विशिष्टता और मैक्रोफेज द्वारा अपर्याप्त सिरना है, जो फलस्वरूप अवांछित दुष्प्रभावों के लिए नेतृत्व । नि: शुल्क न्यूक्लिक एसिड चिकित्सकीय है कि आमतौर पर इष्टतम सेल selectivity कमी और अक्सर बंद लक्ष्य को प्रतिकूल प्रभाव, दवा भरी नैनोकणों (एनपीए) का नेतृत्व के साथ तुलना में, उनके सहज प्रवृत्ति के कारण reticuloendothelial प्रणाली द्वारा कब्जा किया जा रहा है, निष्क्रिय लक्ष्यीकरण के लिए vivo मेंमैक्रोफेज करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, न्यूनतम साइड इफेक्ट8के साथ बेहतर चिकित्सकीय प्रभावकारिता के लिए अनुमति देता है. मौजूदा एनपीएस आरएनए अणुओं के वितरण के लिए अन्वेषण अकार्बनिक nanocarriers, विभिन्न liposomes, और पॉलिमर9शामिल हैं । उनमें से, polyethyleneimine (पी), स्थिर एनपीएस में न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी और संघनित्र में सक्षम cationic पॉलिमर का एक प्रकार, उच्चतम आरएनए देने क्षमता9,10से पता चलता है । पी एंजाइमी और nonenzymatic गिरावट से न्यूक्लिक एसिड की रक्षा करता है, कोशिका झिल्ली के पार उनके स्थानांतरण मध्यस्थता, और उनके intracellular रिलीज को बढ़ावा देता है । हालांकि शुरू में एक डीएनए प्रसव के एजेंट के रूप में पेश किया, पी बाद में vivo सिरना वितरण, या तो स्थानीय या प्रणालीबद्ध9,10में के लिए एक आकर्षक मंच हो प्रदर्शन किया था ।

Superparamagnetic आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (SPIONs) जैव चिकित्सा में महान वादा दिखाया है, उनके चुंबकीय गुणों के कारण, जैविक रूप से महत्वपूर्ण वस्तुओं के लिए तुलनीय आकार, उच्च सतह क्षेत्र-मात्रा अनुपात, और आसानी से अनुकूलनीय सतह के लिए-एजेंट अनुलग्नक11। उदाहरण के लिए, एक विपरीत एजेंट और मैक्रोफेज द्वारा तेजी से तेज के रूप में अपने संभावित उपयोगिता की वजह से, SPIONs12मैक्रोफेज छवि ऊतक के लिए एक पसंदीदा नैदानिक उपकरण के रूप में उभरा है । जबकि SPIONs भी बड़े पैमाने पर न्यूक्लिक एसिड डिलीवरीवाहनों11,13,14,15के रूप में अध्ययन किया गया है, हमारे ज्ञान के लिए, साहित्य के लिए एक वाहक के रूप में SPIONs के कुछ रिपोर्टों में शामिल मैक्रोफेज-लक्षित सिरना वितरण । SPIONs द्वारा जीन वितरण के लिए, उनकी सतह आमतौर पर हाइड्रोफिलिक cationic पॉलिमर की एक परत है जिस पर नकारात्मक न्यूक्लिक एसिड का आरोप लगाया electrostatically आकर्षित किया जा सकता है और सीमित के साथ लेपित है । यहां, हम synthesizing SPIONs के लिए एक तरीका है जिसकी सतह कम आणविक वजन (10 केडीए), बंटी पी (पी-SPIONs) के साथ संशोधित किया गया है प्रस्तुत करते हैं । इन चुंबकीय nanoplatforms तो गाढ़ा सिरना करने के लिए कार्यरत हैं, बनाने बेई-SPION/सिरना परिसरों कि सेल में सिरना परिवहन सक्षम करें । हम reticuloendothelial प्रणाली16की कोशिकाओं द्वारा SPIONs की है कि सहज phagocytosis कारण, बेई द्वारा बाध्यकारी और संघनित्र न्यूक्लिक एसिड की मजबूत क्षमता के साथ युग्मित, SPIONs के कुशल परिवहन के लिए पी-सिरना उपयुक्त renders Macrophages. यहां प्रस्तुत आंकड़ों में मैक्रोफेज में पी-SPION/सिरना-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने की व्यवहार्यता के साथ-साथ vivoमें संस्कृति का समर्थन है ।

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Protocol

सभी जीवित पशुओं को शामिल तरीकों के अनुसार पशु देखभाल और दक्षिण पूर्व विश्वविद्यालय, चीन के उपयोग के दिशा निर्देशों के साथ प्रदर्शन किया गया ।

1. पी-SPIONs की तैयारी

  1. ओलिक अम्ल-संशोधित SPIONs की तैयारी
    1. भंग FeCl3• 6H2ओ और FeSO4• 7H2हे N2के संरक्षण के तहत पानी में ।
      1. FeCl3• 6H2o और 20 ग्राम के FeSO4• 7H2o के ८० मिलीलीटर में एक चोंच में पानी के 28 ग्राम डालें । एक गिलास नाली के माध्यम से पानी में एन2 परिचय और जब तक ठोस मामला भंग कर दिया है हलचल ।
      2. ७२ डिग्री सेल्सियस के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण गर्मी ८०० rpm की सरगर्मी दर पर, अमोनिया पानी की ४० मिलीलीटर के अलावा इसके बाद (28%) । 5 मिनट के लिए हिलाओ ।
    2. उपर्युक्त समाधान में ओलिक एसिड dropwise के 9 मिलीलीटर जोड़ें और 3 एच के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर यह हलचल ।
    3. कमरे के तापमान (आरटी) के परिणामस्वरूप समाधान शांत । चुंबकीय जुदाई के माध्यम से समाधान हाला ।
    4. पूर्ण एथिल शराब के साथ SPIONs 3x युक्त तेज़ी से धोएं और फिर, N-hexane के १०० मिलीलीटर में हाला को फैलाएं ।
  2. dimercaptosuccinic अम्ल-संशोधित SPIONs की तैयारी
    1. जोड़ें ८०० ओलिक एसिड की मिलीग्राम (OA)-संशोधित SPIONs N-hexane के २०० मिलीलीटर में फैलाया, और ४०० dimercaptosuccinic एसिड की मिलीग्राम (DMSA) एसीटोन के २०० मिलीलीटर में फैलाया, एक पानी में स्नान में एक तीन गर्दन कुप्पी में ६० ° c ।
      नोट: पिछले चरण से प्राप्त की OA-संशोधित SPION की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, एक छोटी मात्रा ले (उदाहरण के लिए 1 एमएल) SPION फैलाव, volatilize N-hexane और परिणामस्वरूप पाउडर वजन ।
    2. जोड़ें २०० µ एल triethylamine dropwise के ऊपर में उल्लेख किया समाधान में सरगर्मी के साथ १,००० rpm और भाटा ।
    3. चमचे और भाटा के 5 ज के बाद, चुंबकीय जुदाई से एक काली हाला प्राप्त करें ।
    4. tetramethylammonium हीड्राकसीड का उपयोग करते हुए समाधान के पीएच को एडजस्ट करके हाइड्रोफिलिक SPIONs को पानी के homogeneously में फैलाएं ।
  3. बेई-SPIONs की तैयारी
    1. जोड़ें DMSA-संशोधित SPION कोलाइडयन समाधान में dropwise पी समाधान (10 केडीए) में यांत्रिक सरगर्मी के तहत एक ५०० मिलीलीटर तीन गर्दन कुप्पी में १,००० rpm के लिए 2 ज (डब्ल्यूFe: wबेई = 1:3) ।
      नोट: प्रभारी और पी के आकार-SPIONs wपीके लिए डब्ल्यूFe के अनुपात के आधार पर बदलती हैं । डब्ल्यूFe: डब्ल्यूपी 1:3 के अनुपात synthesizing पी के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु-SPIONs सिरना वितरण के लिए उपयुक्त हो सकता है ।
    2. एक ultrafiltration ट्यूब में परिणामी समाधान जोड़ें १०० केडीए की एक आणविक भार कटऑफ और 15 मिलीलीटर की एक सामग्री; फिर, 10 मिनट के लिए शेष समाधान 1 मिलीलीटर है जब तक ५,४०० x g पर केंद्रापसारक । हल करने के लिए मात्रा 15 मिलीलीटर फिर से बनाने और अंतिम उत्पाद प्राप्त करने के लिए ऊपर की प्रक्रिया 10x दोहराने के लिए पानी में जोड़ें । फिर, एक ०.२२-माइक्रोन फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम उत्पाद की दुकान ।
    3. वर्णमिति phenanthroline17का उपयोग कर विधि द्वारा पी-SPIONs के Fe एकाग्रता का निर्धारण । एक एकाग्रता के लिए जल के साथ बेई-SPIONs को पतला 1 मिलीग्राम Fe/एमएल और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
    4. पी-SPION समाधान के 10 μL को पतला करें (1 मिलीग्राम Fe/एमएल) से 1 मिलीलीटर पानी के साथ; फिर, एक गतिशील प्रकाश-कैटरिंग डिवाइस द्वारा अपने hydrodynamic आकार और जीटा क्षमता का परीक्षण करें ।
      नोट: के बारे में 30-50 एनएम की सीमा में बेई-SPIONs तैयार करते हैं । इस आकार सीमा में, सिरना बाइंडिंग और सेलुलर पर अनुआकार का प्रभाव को महत्वपूर्ण प्रतीत नहीं होता है । पी-SPIONs एक औसत जीटा क्षमता असर पर + ३७ एमवी अभिकर्मक के लिए खुराक रेंज में विषाक्त किया जा सकता है, और एक cytotoxicity परख के लिए सुरक्षा सुनिश्चित किया जाना चाहिए । नैनोकणों की सतह प्रभारी और hydrodynamic आकार बेई सामग्री का समायोजन करके एक वांछित श्रेणी के भीतर नियंत्रित किया जा सकता है ।

2. तैयारी और Agarose जेल ट्रो के पी-SPION/सिरना एनपीएस

  1. RNase-मुक्त पानी के साथ सिरना पतला 20 माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता उपज (०.२६ μg/μL) ।
  2. 0, 1, 2, 4, और 8 लेबल पांच RNase-free microcentrifuge ट्यूबों तैयार करें । लेबल अलग Fe: सिरना वजन अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं । प्लास्टिक 3 μL के सिरना समाधान के सभी ट्यूबों (~ ०.८ μg of सिरना/
  3. जोड़ना 0, ०.८, १.६, ३.२, और ६.४ के रूप में Fe के μg पी-SPIONs ट्यूबों को 0, 1, 2, 4, और 8 लेबल, क्रमशः । प्रत्येक ट्यूब के कुल नमूना मात्रा 20 μL से कम रखें । मिश्रण धीरे से ऊपर और नीचे pipetting ।
  4. 30 मिनट के लिए आर टी पर मिश्रण मशीन पी-SPION/सिरना परिसर गठन की अनुमति । इस अवधि के दौरान, उच्च शुद्धता agarose के साथ एक 3% agarose जेल बनाओ ।
    नोट: अतिरिक्त पी-SPION/सिरना परिसरों अंय Fe के साथ: सिरना अनुपात (जैसे, 5 या 6) तैयार किया जा सकता है और परीक्षण ।
  5. 5-μL नमूना प्रति 6x डीएनए लोडिंग बफर के 1 μL जोड़ें और सावधानी से मिश्रण । bromophenol नीला जेल की लंबाई के रूप में दूर के रूप में दो तिहाई का विस्थापित होने तक सभी नमूनों को लोड और 5 वी/सेमी पर ट्रो चलाते हैं । दाग ethidium ब्रोमाइड (EB) के साथ 15-20 मिनट के लिए जेल ।
    नोट: हौसले से तैयार ट्रो बफर और EB समाधान का इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  6. एक यूवी इमेजिंग प्रणाली के तहत सिरना बैंड कल्पना । Fe की जांच करें: सिरना अनुपात जो सिरना पी के साथ परिसर रूपों-SPIONs और, एक परिणाम के रूप में, मुक्त सिरना का प्रतिनिधित्व बैंड मंदबुद्धि या नहीं detectable हैं ।

3. रॉ के अभिकर्मक 264.7 मैक्रोफेज इन विट्रो

  1. संस्कृति माउस मैक्रोफेज-एक 10 में कच्चे 264.7 कोशिकाओं की तरह-सेमी पकवान DMEM पूर्ण मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) प्रति १०० U/एमएल पेनिसिलिन १०० μg/एमएल streptomycin में ३७ ° c में एक 5% सह2 मशीन से युक्त का उपयोग कर ।
  2. एक दिन पहले अभिकर्मक करने के लिए, कोशिकाओं से महाप्राण मध्यम और उंहें फॉस्फेट के साथ कुल्ला-बफर खारा (पीएच ७.४) । 10 सेमी डिश के लिए ०.२५% trypsin की 1 मिलीलीटर जोड़ें । Trypsinize एक 5% सह2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस से कम के बारे में 5-10 मिनट के लिए कच्चे 264.7 कोशिकाओं ।
  3. जब कोशिकाओं के बहुमत अलग है (5-10 मिनट के बाद), trypsin को निष्क्रिय करने के लिए पकवान के लिए DMEM पूरा मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें । सेल क्लस्टर्स को एकल कक्षों में फैलाने के लिए ऊपर और नीचे प्लास्टिक ।
  4. एक बाँझ 15 एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण । इसे ३०० पर 3 मिनट के लिए RT. supernatant को हटा दें ।
  5. ताजा DMEM पूर्ण माध्यम की 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend और कोशिकाओं की गिनती ।
  6. प्लेट 9 x 104 पूरी तरह से DMEM मध्यम और ३७ ° c में एक 5% CO2 मशीन में मशीन के बारे में 24 एच के लिए 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से थाली में प्रति 6 कोशिकाओं ।
    नोट: यदि एक अलग आकार की एक थाली का उपयोग कर, सापेक्ष सतह क्षेत्र के अनुपात में मढ़वाया कोशिका घनत्व को समायोजित इतना है कि कोशिकाओं अभिकर्मक के समय ८०% प्रवाह तक पहुंचने ।
  7. जब कोशिका प्रवाह ८०% है, कोशिकाओं से मध्यम निकालें और अच्छी तरह से प्रति DMEM पूरा मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें । SPION/सिरना परिसरों तैयार किया गया है और उपयोग के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक मशीन के लिए थाली वापसी (के बारे में 30 मिनट).
  8. पी-SPION/सिरना परिसरों तैयार: एक अभिकर्मक प्रयोग के लिए आवश्यक पी-SPION/सिरना परिसरों की मात्रा की गणना । एक १.५-एमएल RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूब में, एक दी Fe पर सिरना के साथ पी-SPIONs के एक उचित मात्रा में मिश्रण: सिरना अनुपात । मसलन, पी-SPION/सिरना एनपीएस को तैयार करने के लिए एक fe: सिरना के अनुपात में १०० µ g के 4, जोड़ें १०० µ l (1 मिलीग्राम Fe/पी-SPIONs के ९६ μL करने के लिए सिरना (०.२६ μg/μL), यह एक micropipette के साथ धीरे मिश्रण से पीछा किया । आरटी पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
    नोट: पी-SPION/सिरना कॉंप्लेक्स की एक मात्रा तैयार है कि कुल अंतिम मास के अतिरिक्त में 10% किसी भी घटना के नुकसान के लिए खाते में है । कम Fe पर पी-SPION/सिरना परिसरों: सिरना अनुपात, जिसके तहत सिरना अणुओं पूरी तरह से पी-SPIONs पर लोड कर रहे हैं और, इसलिए, पी-SPIONs की छोटी मात्रा में संभावित cytotoxicity को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पायलट प्रयोग (जेल मंदता परख) Fe के अनुकूलन के लिए: सिरना अनुपात आवश्यक हैं ।
  9. बाहर 6 मशीन से अच्छी तरह से थाली ले लो (३.७ कदम) । एक अच्छी तरह से एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए पी-SPION/सिरना परिसर dropwise की एक आवश्यक मात्रा में जोड़ें और थाली सावधानी से घूमता है । सेलुलर या जीन पछाड़ना दक्षता (1-3 डी) के आकलन तक मशीन के लिए थाली लौटें ।
    नोट: Transfecting मैक्रोफेज के साथ पी-SPION/सिरना के एक एकाग्रता में ~ 15 μg Fe/एमएल अभिकर्मक क्षमता को अधिकतम कर सकते है जबकि संभावित cytotoxicity ंयूनतम ।

4. प्रयोगात्मक गठिया के साथ चूहों में मैक्रोफेज को सिरना की प्रणालीगत डिलिवरी

  1. विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त पुरुष Wistar चूहों कि 7 सप्ताह पुराने हैं प्राप्त करें । Habituate 7 डी के लिए चूहों का उपयोग करने से पहले और उंहें पर्याप्त भोजन और पानी के साथ प्रदान करते हैं । चूहों में सहायक गठिया (एए) के रूप में प्रेरित पहले18वर्णित है ।
  2. ३.८ चरण में वर्णित के रूप में बेई-SPION/सिरना परिसरों तैयार करें ।
  3. पूंछ नस के माध्यम से ए. ए. चूहों में पी-SPION/सिरना एनपीएस (०.३ मिलीग्राम सिरना/kg) इंजेक्ट । उदाहरण के लिए, के माध्यम से सेलुलर तेज का आकलन, उदाहरण के लिए, प्रवाह cytometry, ऊतक के माध्यमसे वितरण, मसलन, एक वास्तविक समय प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली, या उपचारात्मक प्रभाव पर आधारित, उदाहरण के लिए, नैदानिक, histologic, और रेडियोग्राफिक विश्लेषण में वांछित समय अंक18.
    नोट: सेलुलर और ऊतक के लिए वितरण अध्ययन, वांछित एनपीएस के एक इंजेक्शन के साथ चूहों का इलाज; चिकित्सकीय अध्ययन के लिए, एनपीएस के साथ चूहों का इंजेक्शन 1x लगातार तीन सप्ताह के लिए एक सप्ताह परीक्षण किया जाना है ।

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Representative Results

आकार और इस प्रोटोकॉल के साथ तैयार पी-SPIONs के जीटा क्षमता 29-48 एनएम (polydispersity सूचकांक: ०.१२-०.२३) और 30-48 एमवी, क्रमशः की सीमा में थे । वे स्पष्ट एकत्रीकरण के बिना 12 महीने से अधिक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी में स्थिर थे । उनके सिरना बाध्यकारी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, पी-SPIONs विभिंन Fe पर सिरना के साथ मिश्रित: सिरना वजन अनुपात थे । चित्रा 1 से पता चलता है कि जब Fe: सिरना वजन अनुपात 4 और ऊपर तक पहुंचता है, मुक्त सिरना के बैंड पूरी तरह से याद आ रही थी, पी के लिए सफल सिरना बंधन-SPIONs का अर्थ । बायोमेडिकल आवेदन में पी का एक प्रमुख चिंता का विषय है, जो मजबूत सकारात्मक आरोप का एक परिणाम है, विशेष रूप से उच्च आणविक भार और उच्च खुराक पर है । के रूप में चित्रा 2aमें दिखाया गया है, पी-३०.५ और ३७ एमवी की एक जीटा क्षमता के साथ SPIONs स्पष्ट cytotoxicity सांद्रता पर 30 μg fe/एमएल, जो एकाग्रता से अधिक दोहरा (15 μg fe/आम तौर पर सेल अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल के बारे में अधिक है प्रदर्शित नहीं किया । हालांकि, पी-४८ एमवी के एक जीटा क्षमता के साथ SPIONs भी सबसे कम खुराक पर विषाक्त थे (10 μg Fe/एमएल) । इसलिए, पी-SPIONs एक आरोप निर्भर विषाक्तता के अधिकारी । cationic प्रभारी के बाद से मैक्रोफेज19द्वारा एनपी के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, हम सुझाव है कि पी एक औसत जीटा क्षमता से अधिक नहीं + ३७ एमवी के साथ SPIONs सिरना हस्तांतरण के लिए उपयोग किया जाता है, हालांकि सिरना बाध्यकारी कुछ हद तक चार्ज कम हो जाएगा और कम cytotoxicity18.

मैक्रोफेज के लिए सिरना डिलीवरी के लिए पी-SPIONs के संभावित अनुप्रयोग का परीक्षण करने के लिए, इन विट्रो अभिकर्मक murine मैक्रोफेज सेल लाइन रॉ २६४.७ के साथ किया गया था । के रूप में प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण, कोशिकाओं के ९०% से अधिक फ्लोरोसेंट लेबल के साथ transfected थे पी-SPION/सिरना परिसरों में 15 µ g Fe/एमएल (चित्रा बी12) । अभिकर्मक दक्षता के संबंध में, वास्तव में पी-SPION/सिरना एनपीएस में कोई अंतर नहीं था: सिरना 4 और 8 के वजन के अनुपात, हालांकि, उत्तरार्द्ध शर्त के तहत, एनपीएस का गठन किया गया था जो आकार में छोटे थे और सकारात्मक प्रभार में कमजोर क्योंकि सिरना की एक कम राशि प्रति कण लोड किया गया था । हम भी पी के प्रभाव का आकलन किया-SPION/सिरना एकाग्रता सेलुलर internalization पर प्रशिया नीले दाग के द्वारा । जैसा चित्र 2cमें दिखाया गया है, transfected कोशिकाओं के भीतर नीले धब्बे ७.५ µ g fe/एमएल पर ंयूनतम detectable थे, लेकिन स्पष्ट रूप से दिखाई 15 µ g fe/ दिलचस्प है, पी-SPION/सिरना एकाग्रता में वृद्धि ३२ µ g fe/एमएल धुंधला तीव्रता वृद्धि नहीं किया था, शायद क्योंकि पी-SPION/सिरना तेज सांद्रता पर संतृप्त किया गया था चारों ओर 15 µ g Fe/ इसके अलावा, सिरना स्थानांतरण मध्यस्थता के लिए पी-SPIONs की क्षमता प्राथमिक मैक्रोफेज18में पुष्टि था, और यहां प्रस्तुत विधि चूहे सिरना अभिकर्मक में एक उच्च पेरिटोनियल मैक्रोफेज दक्षता, कच्चे 264.7 में उस के समकक्ष था कक्षों. पेरिटोनियल मैक्रोफेज transfected के साथ पी-SPIONs हार्बर विशिष्ट सिरना लक्ष्य mRNA स्तर में एक महत्वपूर्ण कमी के रूप में गैर विशिष्ट सिरना (चित्रा 2d) के साथ तुलना में पता चला है कि सिरना में बुलबुले endocytosis से बच सकता है कोशिका द्रव्य और RNAi मशीनरी तक पहुंचते हैं ।

हम पहले भी vivo में प्रणालीबद्ध प्रशासित पी-SPION/सिरना के साथ चूहों में सहायक गठिया18के सेलुलर के साथ आगे की जांच की । हम phagocytic मैक्रोफेज और nonphagocytic टी लिम्फोसाइटों में पी-SPION/सिरना अभिकर्मक दक्षता का विश्लेषण किया । के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, CD11b + कोशिकाओं पी-SPION/सिरना परिसरों से अधिक कुशलता से CD3 + कोशिकाओं की जांच की सभी अंगों में किसी भी समय बिंदु पर ले लिया, यह दर्शाता है कि पी-SPION/सिरना एनपीएस तरजीही लक्ष्य मैक्रोफेज18। विशेष रूप से, एनपीएस के एक उच्च स्तरीय संचय सूजन जोड़ों18में मनाया गया था, सुझाव है कि पी-SPION रुमेटी गठिया जिसका रोगजनन से जुड़ा हुआ है में सिरना चिकित्सकीय के प्रणालीगत प्रसव के लिए एक आकर्षक मंच हो सकता है मैक्रोफेज शिथिलता और जिसके लिए स्थानीय सिरना प्रशासन बीमारी के कई अंगों की भागीदारी के कारण एक पसंदीदा विकल्प नहीं है ।

Figure 1
चित्रा 1: Agarose जेल ट्रो पी-SPION/सिरना परिसरों के विभिंन Fe पर गठित: सिरना (डब्ल्यू/ A Fe: 0 के सिरना अनुपात बेई-SPIONS के बिना नि: शुल्क सिरना डुप्लेक्स का प्रतिनिधित्व करता है । औसत आकार और मुक्त पी के जीटा क्षमता-SPIONs यहां इस्तेमाल 30 एनएम और ४५ एमवी थे । सिरना पूरी तरह से पी-SPIONs को बांध सकता है जब Fe: सिरना अनुपात 4 तक पहुंच जाता है और ऊपर, पिछले ४८ एनएम के एक औसत आकार और ३०.५ एमवी18के एक जीटा क्षमता के साथ पी-SPIONs का उपयोग परिणामों के साथ संगत । मंदबुद्धि बैंड के अभाव (पी-SPION/सिरना परिसरों) धुंधला, मजबूत सिरना बंधन का एक संकेत है, और/या पी-SPIONs के संघनित्र की क्षमता के दौरान EB को सिरना के अप्राप्यता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: पी-SPION और पी-SPION/सिरना एनपीएस का जैविक लक्षण वर्णन । (क) इस पैनल के एक सेल व्यवहार्यता परख दिखाता है । कच्चे २६४.७ कोशिकाओं पी के संकेत खुराक-SPIONs अलग जीटा क्षमता असर और, तो, एक MTS परख प्रदर्शन किया गया था के साथ 16 एच के लिए इलाज किया गया । कोशिका व्यवहार्यता नियंत्रण (कोई कण जोखिम) के खिलाफ सामान्यीकृत था । डेटा डुप्लिकेट कुओं का मतलब ± एसडी कर रहे हैं । (ख) इस पैनल के एक प्रवाह cytometric विश्लेषण से पता चलता है पी-SPION/Cy3-सिरना कच्चे २६४.७ कोशिकाओं द्वारा तेज । कोशिकाओं 15 µ g Fe के साथ 24 घंटे के लिए मशीन/एमएल (ऊपरी पैनल) या 5 μg fe/एमएल के (कम पैनल) पी-SPIONs एक Fe पर Cy3-लेबल सिरना के साथ परिसर: सिरना (डब्ल्यू/डब्ल्यू) अनुपात 4 और 8, क्रमशः । गैर विशिष्ट (नेकां) सिरना नॉन-फ्लोरोसेंट सिरना का प्रतिनिधित्व करता है । M2: gated क्षेत्र; Pe-H: Cy3 प्रतिदीप्ति तीव्रता । पी के सिरना अभिकर्मक क्षमता-SPIONs यहां इस्तेमाल किया (३७.८ एनएम, ४८ एमवी) एक पिछले पी का उपयोग कर अध्ययन के समान था-४८ एनएम के एक औसत आकार और ३०.५ एमवी18के एक जीटा क्षमता के साथ SPIONs । (ग) यह पैनल सेलुलर आयरन जमा visualizing द्वारा पी-SPION/सिरना के एक विश्लेषण से पता चलता है । कच्चे २६४.७ कोशिकाओं ७.५, 15, और ३२ μg Fe/एमएल पी-SPIONs (४८ एनएम, ३०.५ एमवी) सिरना (Fe: सिरना = 8) के साथ जटिल और प्रशिया नीले रंग से सना हुआ के साथ मशीन थे । पैमाने सलाखों के 20 माइक्रोन हैं । (घ) इस पैनल से पता चलता है एक इन विट्रो में पी द्वारा दिया सिरना के मुंह बंद करने दक्षता के सत्यापन-SPIONs । एक विशिष्ट सिरना-लक्ष्यीकरण चूहा IL-2/-15 रिसेप्टर β चेन पी पर लोड किया गया था-SPIONs (४८ एनएम, ३०.५ एमवी) पर Fe: सिरना = 8 और, फिर, transfected में चूहे पेरिटोनियल मैक्रोफेज. एक नेकां सिरना नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । जीन मुंह बंद करने प्रभाव मात्रात्मक पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किया गया था । कोशिकाओं 15 μg Fe/एमएल में परिसरों के साथ मशीन थे । डेटा तपसिल कुओं के एसडी मतलब ± हैं । पैनल डी डुआन एट अल से संशोधित किया गया है । 18 प्रकाशक से अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: वीवो सेलुलर में पी के SPION/सिरना एनपीएस । तीन गठिया चूहों ०.३ मिलीग्राम/kg Cy3-सिरना के साथ तैयार की एक खुराक के साथ नसों में इंजेक्ट किया गया-SPION (४८ एनएम, ३०.५ एमवी) । पंजाब के साथ एक चूहे का इंजेक्शन एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । इंजेक्शन के बाद रक्त, तिल्ली, यकृत, गुर्दे, और सूजन जोड़ों 2, 8, और 24 एच में एकत्र किए गए । पी के सेलुलर तेज-SPION/Cy3-सिरना एनपीएस का उपयोग प्रवाह cytometry द्वारा (क) विरोधी CD3 और (ख) विरोधी CD11b मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का आकलन किया गया. प्रतिशत gated CD3 + या CD11b + कोशिकाओं के भीतर Cy3-सिरना के हैं । यहाँ दिखाए गए परिणाम दो स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. यह आंकड़ा डुआन एट अल से संशोधित किया गया है । 18 प्रकाशक से अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

मैक्रोफेज electroporation, cationic liposomes, और लिपिड प्रजातियों के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल किया वायरल दृष्टिकोण, द्वारा transfect करने के लिए दुर्दम्य हैं । यहां हम सिरना के साथ मैक्रोफेज transfect करने के लिए एक विश्वसनीय और कुशल विधि का वर्णन किया । वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करना, मैक्रोफेज के ९०% से अधिक कच्चे २६४.७ कोशिकाओं की तरह (चित्रा बी1) और चूहे पेरिटोनियल मैक्रोफेज18 सेल व्यवहार्यता के महत्वपूर्ण हानि के बिना सिरना के साथ transfected जा सकता है । इस विधि वितरण मंच पी-SPION, जो एक लोहे की ऑक्साइड के एक कोर और पी के एक खोल से बना nanocarrier है पर निर्भर करता है । तो, प्रोटोकॉल की पहली महत्वपूर्ण कदम पी के संश्लेषण-SPIONs सिरना वितरण के लिए उपयुक्त है । आमतौर पर, पी-लेपित SPIONs को ligand-विनिमय पद्धति द्वारा ओलिक अम्ल-लेपित SPIONs से तैयार किया जाता है जिसमें ओलिक एसिड बेई या उसके डेरिवेटिव15द्वारा SPIONs की सतह से सीधे आदान-प्रदान होता है, एक सकारात्मक शुल्क के साथ हाइड्रोफिलिक एनपीएस पैदा होता है सतह. यहां प्रस्तुत मामले में, ओलिक एसिड SPIONs की सतह पर छाया पानी में घुलनशील dimercaptosuccinic एसिड की जगह थी, और फिर पी SPION पर लोड किया गया था इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के माध्यम से सतहों । इस विधि कोमल और बड़ी मात्रा में तैयार करने के लिए आसान है, और संश्लेषित एनपीएस20पानी में उत्कृष्ट स्थिरता है । यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि बेई साइटोटोक्सिक है, और विषाक्तता अपने आणविक वजन21के साथ दृढ़ता से संबद्ध है । सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए, एक महत्वपूर्ण विचार जब synthesizing बेई-SPIONs है कि इन कणों कम आणविक वजन पी, जो इस प्रोटोकॉल में 10 केडीए है के साथ लेपित हैं । पी के अवांछित विषाक्त प्रभाव मुख्य रूप से अपने सकारात्मक प्रभार द्वारा मध्यस्थता है; इसलिए, पी के जीटा क्षमता की माप-SPIONs आवश्यक है, और मूल्य से अधिक नहीं होना चाहिए ३७ एमवी । एक सकारात्मक चार्ज में कमी बस बेई सामग्री को कम करने से प्राप्त किया जा सकता है । इस सिरना वितरण प्रणाली के सफल आवेदन के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम Fe के अनुकूलन: जेल मंदता द्वारा सिरना अनुपात है । यह कम Fe पर बेई-SPION/सिरना परिसरों बनाने के लिए उचित लगता है: सिरना अनुपात जिसके तहत सिरना अणुओं अभी भी पी के लिए बाध्यकारी-SPIONs में सक्षम हैं । इस परिस्थिति में, पी-SPIONs की छोटी मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार अपनी क्षमता cytotoxicity को कम करने ।

मामले में एक वांछित मुंह बंद करने दक्षता या उपचारात्मक प्रभाव का उत्पादन नहीं किया है, एक फ्लोरोसेंट लेबल सिरना के साथ भरी हुई वाहक का उपयोग कर प्रवाह cytometry या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा अभिकर्मक दक्षता की जाँच करें. वैकल्पिक रूप से, पी SPION/सिरना ऊपर पारंपरिक प्रशिया नीले दाग है, जो पर्याप्त कोशिकाओं में आयरन का एक granules का पता लगाने के लिए संवेदनशील है द्वारा जांच की जा सकती है । यदि अभिकर्मक दक्षता वास्तव में कम है, यह सेल घनत्व, अभिकर्मक समय, और पी-SPION/सिरना कणों की खुराक के रूप में अभिकर्मक स्थितियों का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है । सेल मार्ग संख्या भी22अभिकर्मक की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं । अधिकांश मामलों में, अपर्याप्त मुंह बंद करने प्रभाव एक अपर्याप्त बेई के कारण नहीं है-SPION/सिरना, के रूप में वर्तमान बेई-SPION प्रणाली को सिरना के लिए एक प्रभावी मैक्रोफेज हस्तांतरण की सुविधा का प्रदर्शन किया गया है । कई बार, एक ही जीन लक्ष्यीकरण siRNAs एक अच्छी रणनीति पछाड़ना दक्षता बढ़ाने के लिए हो सकता है । यह उल्लेखनीय है कि, हालांकि RNAi आम तौर पर अभिकर्मक के 24 घंटे के भीतर होता है, शुरुआत और जीन मुंह बंद करने की अवधि लक्ष्य की टर्नओवर दर पर निर्भर करता है, कमजोर पड़ने और सिरना की लंबी उंर की दर, और यहां तक कि मध्यम में सीरम की एकाग्रता । इस प्रकार, समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के लिए सही ढंग से अधिकतम प्रभाव2,22के समय बिंदु निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है । के लिए vivo आवेदन में , चिकित्सीय प्रभावकारिता भी है कि क्या, और किस हद तक, सिरना लक्ष्य रोग phenotypes के लिए योगदान देता है पर निर्भर करता है; इस प्रकार, एक उपयुक्त सिरना लक्ष्य का चुनाव अपेक्षित परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है ।

मैक्रोफेज को सिरना देने के लिए इस प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं । (1) विधि प्रदर्शन करने के लिए आसान है और बड़ी मात्रा में पी-SPIONs उत्पादन करने के लिए एक सस्ता तरीका है, और वे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, तो एनपीएस का उत्पादन 12 से अधिक महीनों के लिए पानी में स्थिर हैं । (2) मैक्रोफेज द्वारा SPIONs के सहज phagocytosis एक प्रभावी पी-SPION मध्यस्थता सिरना स्थानांतरण की सुविधा, उच्च अभिकर्मक दक्षता में जिसके परिणामस्वरूप. यह उम्मीद है कि कच्चे २६४.७ कोशिकाओं और चूहे पेरिटोनियल मैक्रोफेज के अलावा, इस दृष्टिकोण अन्य मैक्रोफेज सेल लाइनों और प्राथमिक मैक्रोफेज के लिए लागू है, अभिकर्मक के लिए खुराक के रूप में लंबे समय के रूप में अनुकूलित है. (3) सिरना अभिकर्मक तेज और आसान है जैसे nucleofection, जो समय लेने वाली है और एक Nucleofector डिवाइस2की आवश्यकता है के रूप में अंय मैक्रोफेज अभिकर्मक तरीकों के साथ तुलना आचरण । (4) पी-SPION कुछ रोग मॉडलों में मैक्रोफेज-लक्षित प्रणालीगत सिरना वितरण के लिए एक आदर्श वाहन हो सकता है । मैक्रोफेज विभिन्न जीर्ण भड़काऊ विकारों के विकास और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, साथ ही ट्यूमर; और इन रोगों के एक विशिष्ट ऊतकवैज्ञानिक सुविधा टपका हुआ endothelium के साथ असामान्य रक्त वाहिकाओं है । इसलिए, बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण प्रभाव के कारण, प्रणालीबद्ध प्रशासित दवा लोड एनपीएस रोगग्रस्त ऊतकों में जमा करने के लिए करते हैं और आसानी से स्थानीय मैक्रोफेज द्वारा कब्जा कर रहे हैं, बढ़ाया विशिष्टता के लिए अग्रणी, कम साइड इफेक्ट, और सुधार चिकित्सीय प्रभावकारिता । सहायक गठिया के एक चूहे के मॉडल में, नसों में पी-SPION/सिरना परिसरों इंजेक्शन18के बाद पहले 24 घंटे के दौरान ~ CD11b + कोशिकाओं के ४०% द्वारा उठाए गए थे । इसके विपरीत, जब cationic liposome चूहों में प्रणालीगत सिरना वितरण के लिए एक वाहक के रूप में प्रयोग किया जाता था, गठिया जोड़ों में CD11b + कोशिकाओं के 5% से कम फंस सिरना23. इसके अलावा, उनके चुंबकीय गुणों के कारण, एक बाहरी चुंबकीय क्षेत्र के आवेदन आगे लक्ष्य ऊतकों में पी-SPION/सिरना परिसरों के संचय की सुविधा हो सकती है और उनके सेलुलर वृद्धि बढ़ा सकते हैं । यह भी उल्लेखनीय है कि इस तरह के सिरना-लोड एनपीएस न केवल मैक्रोफेज समारोह मॉडुलन के लिए लेकिन यह भी इमेजिंग मैक्रोफेज के लिए नैदानिक जानकारी प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मॉनिटर उपचार प्रभावकारिता, और रोगियों के नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी12.

हालांकि, इस प्रोटोकॉल के साथ संबद्ध सीमाएं मौजूद हैं । पी-SPION प्रणाली सिरना वितरण के लिए खुराक की एक संकीर्ण रेंज दर्शाती है । अधिकतम अधिक हुई जब कच्चे 264.7 कोशिकाओं बेई को उजागर किया गया-SPION/siRNAs 15 µ g Fe/एमएल (चित्रा 2 बी और 2c) की एकाग्रता में । ३२ µ g Fe/mL को पी-SPION/सिरना एकाग्रता में वृद्धि सेलुलर तेज (चित्रा 2c) लेकिन, इसके विपरीत में, के कारण कोशिका मृत्यु उत्प्रेरण का खतरा बढ़ सकता है पी के आंतरिक विषाक्तता के लिए वृद्धि हुई । दूसरी ओर, कम बेई-SPION/सिरना को 5 या ७.५ µ g Fe/एमएल जाहिर है कच्चे 264.7 कोशिकाओं (चित्रा 2 बी और 2c) द्वारा अपने ऊपर की ओर कम । इस प्रकार, हम प्रस्ताव है कि इन विट्रो मैक्रोफेज अभिकर्मक के लिए इष्टतम पी-SPION/सिरना एकाग्रता है ~ 15 µ g Fe/एमएल (एक अच्छी तरह से अंतिम एकाग्रता) । एक और सीमा है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए पी के संभावित प्रभाव मैक्रोफेज गतिविधि पर SPIONs है । नैनोकणों प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया24प्रेरित कर सकते हैं, उनकी सतह संशोधन, भूतल प्रभारी, आकार, आकृति पर निर्भर करता है, और यहां तक कि उंहें संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया पद्धति पर । Mulens-arias एट अल । हाल ही में बताया कि पी लेपित SPIONs ट्रिगर मैक्रोफेज सक्रियकरण25। पी-SPION संश्लेषण की विधि यहां प्रस्तुत की है कि Mulens-arias एट अलसे काफी अलग है, और इसलिए, कि पी-SPIONs वर्तमान प्रोटोकॉल ट्रिगर मैक्रोफेज सक्रियण के आधार पर तैयार आगे की जांच का इंतजार कर रहा है । हालांकि, स्पष्ट रूप से इस चिंता का पता है, हम सुझाव है कि, पी के अलावा SPION हाथापाई सिरना के साथ परिसर में, वाहन ही (पी-SPION केवल) एक और नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते है जब वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर । अंत में, यह प्रोटोकॉल अपने अपेक्षाकृत बड़े आकार के कारण डीएनए के वितरण के लिए उपयुक्त नहीं है ।

संक्षेप में, हम यहां मैक्रोफेज में सिरना अभिकर्मक के लिए एक वाहन के रूप में पी लेपित SPIONs का उपयोग करने की एक विधि प्रस्तुत किया । इन एनपीएस कुशलतापूर्वक मैक्रोफेज सेल लाइनों में सिरना उद्धार कर सकते हैं, साथ ही साथ में प्राथमिक मैक्रोफेज में इन विट्रो, और कार्यात्मक अभिकर्मक के लिए इष्टतम खुराक पर कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना जीन मुंह बंद करने प्रेरित । इसके अलावा, पी-SPIONs vivo सिरना डिलीवरी में मैक्रोफेज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह छवि के लिए संभव बनाने, साथ ही साथ मिलाना, मैक्रोफेज जिसकी शिथिलता कई पुरानी भड़काऊ विकारों के विकास और प्रगति के लिए योगदान देता है और कैंसर.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (८१७७२३०८) और चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (No. 2017YFA0205502) ने समर्थन दिया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco C11995500BT Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum Gibco A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) Gibco 15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit Promega G3582 For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China TCM13
Tissue culture plates (6-well) Corning 3516
Tissue culture dishes (10 cm) Corning 430167
RNase-free tubes (1.5 ml) AXYGEN MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430791
Trypsin Gibco 25200-056
Wistar rats Shanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder National
Institutes for Food and Drug Control, China		 for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa) Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. E107079
Ammonia water Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. A112077
Oleic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. O108484
Dimethylsulfoxide Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D103272
FeSO4•7H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012118
FeCl3•6H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011918
Dimercaptosuccinic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D107254
ultrafiltration tube Millipore UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. T100882
Particle size and zeta potential analyzer Malvern, England Nano ZS90

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References

  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
  2. Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  3. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , Springer. 123-143 (2009).
  4. Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
  5. Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
  6. Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
  7. Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
  8. Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
  9. Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  10. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
  11. Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
  12. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
  13. Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
  14. Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
  15. Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
  16. Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
  17. Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
  18. Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
  19. Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
  20. Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
  21. Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
  22. Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
  23. Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
  24. Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
  25. Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).

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Polyethyleneimine-लेपित आयरन ऑक्साइड छोटे हस्तक्षेप आरएनए के वितरण के लिए एक वाहन के रूप में नैनोकणों में <em></em> और <em>Vivo में</em> मैक्रोफेज
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