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Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages In Vitro et In Vivo

Published: February 5, 2019 doi: 10.3791/58660
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 2, 2, 1
1Key Laboratory of Ministry of Education for Developmental Genes & Human Diseases, Institute of Life Sciences and School of Medicine, Southeast University, 2State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials & Devices, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University
* These authors contributed equally

Summary

Les auteurs décrivent une méthode d’utilisation polyéthylèneimine (PEI)-enduit superparamagnetic iron oxide nanoparticules pour la transfection des macrophages avec siARN. Ces nanoparticules peuvent délivrer efficacement des siARN d’expression du gène cible in vitro et in vivo et silence macrophages.

Abstract

En raison de leur rôle crucial dans la régulation des réponses immunitaires, les macrophages ont constamment fait l’objet de recherches intensives et représentent une cible thérapeutique prometteuse dans plusieurs maladies, telles que les maladies auto-immunes, l’athérosclérose et le cancer. Silençage génique véhiculée par Arni est une approche utile de choix de sonde et de manipuler la fonction des macrophages ; Toutefois, la transfection des macrophages avec siARN est souvent considéré comme pour être techniquement difficile et, à l’heure actuelle, il existe quelques méthodes dédiés au transfert de siARN aux macrophages. Nous présentons ici un protocole d’utilisation de nanoparticules d’oxyde de fer superparamagnétique polyéthylèneimine-enduit (PEI-SPIONs) comme un véhicule pour l’administration ciblée d’ARNsi aux macrophages. PEI-SPIONs sont capables de liaison et de condensation complètement siARN lorsque le rapport de poids / Fe : siARN atteint 4 et au-dessus. In vitro, ces nanoparticules peuvent délivrer efficacement siRNA dans les macrophages primaires, ainsi que dans la lignée cellulaire de type macrophages RAW 264.7, sans compromettre la viabilité des cellules à la dose optimale pour la transfection, et, en fin de compte, ils induisent induite par le siARN cible silençage génique. Outre utilisé pour in vitro transfection de siARN, PEI-SPIONs sont un outil prometteur pour la livraison des siARN à macrophages in vivo. Compte tenu de ses caractéristiques combinées de propriété magnétique et capacité de gène-baffle, systématiquement administré PEI-SPION/siARN particules devraient non seulement pour moduler la fonction de macrophage, mais aussi pour activer les macrophages à être photographié et suivies. En substance, PEI-SPIONs représentent une plate-forme nonviral simple, sûre et efficace pour la livraison de siARN aux macrophages in vitro et in vivo.

Introduction

Les macrophages sont un type de cellules immunitaires innées, distribué dans tous les tissus de l’organisme, mais dans des quantités différentes. En produisant une variété de cytokines et d’autres médiateurs, ils jouent un rôle crucial dans la défense de l’hôte contre l’invasion des pathogènes microbiens, à la réparation des tissus après une blessure et dans le maintien de l’homéostasie tissulaire1. En raison de leur importance, les macrophages ont continuellement fait l’objet de recherches intensives. Cependant, malgré sa prévalence dans la régulation des gènes et des études de fonction, siARN-mediated gene silencing est moins susceptible de réussir dans les macrophages, parce que ces cellules — en particulier, les macrophages primaires — sont souvent difficiles à transfecter. Ceci peut être attribué à un degré relativement élevé de toxicité associé à des approches plus bien établies de transfection dans lequel la membrane cellulaire est chimiquement (par exemple, avec des polymères et des lipides) ou physique (p. ex., par électroporation et canons de gène) perturbé pour laisser les siARN molécules traversent la membrane, réduisant ainsi considérablement viabilité2,3 des macrophages. En outre, les macrophages sont des phagocytes dédiés riches en enzymes de dégradation. Ces enzymes peuvent endommager l’intégrité des siARN, affaiblissement de l’efficacité de son silencieux même si gène-spécifique siARN a été remis dans la cellule3,4. Par conséquent, un système d’administration des siARN efficaces axés sur les macrophages a besoin pour protéger l’intégrité et la stabilité des siARN au cours de la livraison4.

Il est de plus en plus évident que les macrophages dysfonctionnels sont impliqués dans l’apparition et la progression de certains troubles cliniques courants comme les maladies auto-immunes, l’athérosclérose et le cancer. Pour cette raison, en modulant la fonction des macrophages avec, par exemple, siRNA, a été en train de devenir une méthodologie attrayante pour le traitement de ces troubles5,6,7. Si beaucoup de progrès ont été accompli, un enjeu majeur de la stratégie de traitement fondées sur des siARN est la spécificité cellulaire pauvre de siARN systématiquement administré et l’absorption de siARN insuffisante par les macrophages, qui par conséquent conduire à des effets secondaires indésirables. Par rapport aux thérapies de libre d’acide nucléique qui manquent généralement de sélectivité cellulaire optimale et conduisent souvent à des effets indésirables, chargé de drogue nanoparticles (NPs), en raison de leur propension spontanée d’être capturé par le système réticulo-endothélial, hors cible peut être conçue pour le ciblage passive à macrophages en vivo, permettant une meilleure efficacité thérapeutique avec des effets secondaires minimes8. Courants NPs explorés pour l’administration de molécules d’ARN incluent nanocarriers inorganiques et liposomes divers polymères9. Parmi eux, polyéthylèneimine (PEI), un type de polymères cationiques lier et condensation des acides nucléiques dans NPs stabilisées, montre l’ARN plus haut livraison capacité9,10. PEI protège des acides nucléiques de la dégradation enzymatique et non-enzymatique, médiatise leur transfert à travers la membrane cellulaire et favorise leur libération intracellulaire. Bien qu’initialement présenté comme un réactif de livraison de l’ADN, PEI a été démontré par la suite pour être une plate-forme attrayante pour in vivo ARNsi, soit localement ou de manière systématique9,10.

Nanoparticules superparamagnétiques d’oxyde de fer (SPIONs) ont montré de grandes promesses en biomédecine, en raison de leurs propriétés magnétiques, de biocompatibilité, de taille comparable aux objets biologiquement importants, surface-surface-à-volume élevé et facilement adaptable surface pour ètre pièce jointe11. Par exemple, en raison de leur utilité potentielle comme agent de contraste et une absorption rapide par les macrophages, SPIONs ont émergé comme un outil clinique préféré à l’image de macrophages tissulaires12. Alors que SPIONs ont également été largement étudiées sous la forme d’acide nucléique livraison véhicules11,13,14,15, à notre connaissance, la littérature contienne peu de rapports de SPIONs comme un support pour ARNsi axés sur les macrophages. Pour la livraison de gène de SPIONs, leur surface est généralement recouvert d’une couche de polymères cationiques hydrophiles sur lequel des acides nucléiques chargés négativement peut être électrostatiquement attirés et attachés. Nous présentons ici une méthode de synthèse de SPIONs dont la surface est modifiée avec faible poids moléculaire (10 kDa), PEI ramifié (PEI-SPIONs). Ces nanoplatforms magnétiques travaillent alors à se condenser siRNA, formant des complexes de PEI-SPION/siARN qui permettent le transport de siARN dans la cellule. Nous avons raison cette phagocytose spontanée de SPIONs par les cellules du système réticulo-endothélial16, associée à la forte capacité de liaison et condensation des acides nucléiques par PEI, rend PEI-SPIONs adapté pour le transport efficace des siARN dans macrophages. Les données présentées ici confirment la faisabilité de PEI-SPION/siARN-mediated gene silencing dans les macrophages en culture ainsi qu’in vivo.

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Protocol

Toutes les méthodes impliquant des animaux vivants ont été effectuées conformément à l’animal soin et d’utilisent des lignes directrices de l’Université du Sud-est, en Chine.

1. préparation du PEI-SPIONs

  1. Préparation de l’acide oléique-modified SPIONs
    1. Dissoudre FeCl3•6H2O et FeSO4•7H2O dans l’eau sous la protection du N2.
      1. Ajouter 28 FeCl3•6H2O et 20 g de FeSO4•7H2O dans 80 mL d’eau désionisée dans un bécher. N2 introduire de l’eau dans une gaine de verre et remuer jusqu'à ce que la matière solide a dissous.
      2. Faire chauffer le mélange réactionnel à 72 ° C à un taux d’agitation de 800 tr/min, suivie par l’ajout de 40 mL d’ammoniaque eau (28 %). Remuez pendant 5 min.
    2. Ajouter goutte 9 mL d’acide oléique dans la solution susmentionnée et remuez-le à 72 ° C pendant 3 h.
    3. Laisser refroidir la solution obtenue à la température ambiante (RT). Précipiter la solution par séparation magnétique.
    4. Laver le précipité contenant SPIONs 3 x avec alcool éthylique absolu et, ensuite, disperse le précipité dans 100 mL de N-hexane.
  2. Préparation de dimercaptosuccinique modifiés acide SPIONs
    1. Ajouter 800 mg d’acide oléique (OA)-modification SPIONs dispersées dans 200 mL de N-hexane, et 400 mg d’acide dimercaptosuccinique (DMSA) dispersées dans 200 mL d’acétone, dans une fiole de trois-cou dans un bain-marie à 60 ° C.
      Remarque : Pour déterminer la concentration de SPION OA modifiés obtenue à partir de l’étape précédente, prenez un petit volume (p. ex. 1 mL) de la dispersion de SPION, se volatiliser le N-hexane et peser la poudre qui en résulte.
    2. Ajouter 200 µL de triéthylamine goutte à goutte dans la solution ci-dessus avec reflux et en remuant à 1 000 tr/min.
    3. Après 5 h en remuant et reflux, obtenir un précipité noir par séparation magnétique.
    4. Disperser les SPIONs hydrophiles dans l’eau désionisée homogène en ajustant le pH de la solution à l’aide d’hydroxyde de tétraméthylammonium.
  3. Préparation de PEI-SPIONs
    1. Solution colloïdale SPION DMSA modifié, ajouter quelques gouttes dans la solution de PEI (10 kDa) dans un ballon jaugé de 500 mL trois-cou sous agitation mécanique à 1 000 tr/min pendant 2 h (WFe: WPEI = 1:3).
      Remarque : La charge et la taille de PEI-SPIONs varient selon le ratio de WFe WPEI. Le WFe: rapport 1:3 WPEI peut être un bon point de départ pour la synthèse de PEI-SPIONs adaptés pour la livraison de siARN.
    2. Ajouter la solution résultante dans un tube d’ultrafiltration ayant un seuil de poids moléculaire de 100 kDa et d’une teneur de 15 mL ; Ensuite, la centrifugeuse à 5 400 x g pendant 10 min jusqu'à ce que le reste de la solution est de 1 mL. Ajouter de l’eau déminéralisée à la solution pour rendre le volume 15 mL à nouveau et répéter le processus ci-dessus 10 x pour obtenir le produit final. Ensuite, filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 μm et stocker le produit final à 4 ° C.
    3. Déterminer la concentration de Fe de PEI-SPIONs par la méthode colorimétrique utilisant phénanthroline17. Diluer les PEI-SPIONs avec de l’eau désionisée stérile à une concentration de 1 mg Fe/mL et conserver à 4 ° C.
    4. Diluer 10 μL de la solution de PEI-SPION (1 mg Fe/mL) à 1 mL avec de l’eau déionisée ; Testez ensuite sa taille hydrodynamique et le potentiel zêta par un dispositif de dispersion de la lumière dynamique.
      Remarque : Préparer des PEI-SPIONs dans la gamme d’environ 30 à 50 nm. Dans cette gamme de taille, l’effet de la taille du NP sur liaison siARN et la capture cellulaire ne semble pas être importante. PEI-SPIONs portant un potentiel zêta moyenne plus + 37 mV peut être toxique dans la gamme de doses pour la transfection, et un essai de cytotoxicité devrait être effectué pour assurer la sécurité. La charge superficielle et hydrodynamique taille des nanoparticules peuvent être commandés dans une gamme désirée en réglant le contenu de PEI.

2. préparation et Gel d’agarose de PEI-SPION/siARN NPs

  1. SiARN diluée avec de l’eau exempte de RNase pour donner une concentration finale de 20 μM (0,26 μg/μL).
  2. Préparer cinq tubes de microcentrifuge exempte de RNase marqués 0, 1, 2, 4 et 8. Les étiquettes représentent Fe : siARN différents rapports de poids. Pipette 3 μl de solution de siARN à tous les tubes (~0.8 μg de siRNA/tube).
  3. Ajouter 0, 0,8, 1.6, 3.2 et 6.4 μg de Fe sous forme de PEI-SPIONs aux tubes marqués 0, 1, 2, 4 et 8, respectivement. Garder le volume de l’échantillon total de chaque tube de moins de 20 μL. La composition de pipetage doucement verticalement.
  4. Incuber les mélanges à ta pendant 30 min pour permettre la formation d’un complexe PEI-SPION/siARN. Durant cette période, faire une agarose à 3 % gel d’agarose de haute pureté.
    Remarque : Autres PEI-SPION/siARN complexes avec les autres ratios de Fe : siARN (p. ex., 5 ou 6) peuvent être préparés et testés.
  5. Ajouter 1 μL de 6 x tampon ADN-chargement par échantillon 5 μL et mélanger avec précaution. Chargez tous les échantillons et exécutez électrophorèse à 5 V/cm, jusqu'à ce que le bleu de bromophénol migre dans la mesure où les deux-tiers de la longueur du gel. Souillez le gel avec le bromure d’éthidium (EB) pendant 15-20 min.
    Remarque : Électrophorèse fraîchement préparés et solution EB devraient servir.
  6. Visualiser les bandes de siARN sous une exposition aux UV système d’imagerie. Vérifier les ratios Fe : siARN à laquelle siARN forme des complexes avec PEI-SPIONs et, par conséquent, les bandes représentant les siARN libre sont retardés ou non détectable.

3. la transfection des Macrophages RAW264.7 In Vitro

  1. Cellules de RAW264.7 de macrophage-comme la culture souris dans un plat de 10 cm à l’aide de DMEM complètent moyen contenant 10 % bovine sérum fœtal (SVF) par 100 U/mL de pénicilline par 100 μg/mL de streptomycine à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.
  2. Un jour avant la transfection, aspirer moyen des cellules et les rincer avec une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4). Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine dans le plat de 10 cm. Trypsinize cellules RAW264.7 pour environ 5-10 min à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 %.
  3. Lorsque la majorité des cellules ont détaché (après 5-10 min), ajouter 5 mL de milieu complet DMEM au plat pour inactiver la trypsine. Pipette de haut en bas pour disperser des agrégats cellulaires dans des cellules individuelles.
  4. Transférer la suspension de cellules dans un tube conique stérile de 15 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à RT. enlever le surnageant.
  5. Remettre en suspension les cellules avec 5 mL d’un milieu DMEM complet frais et compter les cellules non vides.
  6. Plaque 9 x 104 cellules par puits dans une plaque 6 puits avec 2 mL de milieu DMEM complet et incuber à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant environ 24 h.
    Remarque : Si vous utilisez une plaque de dimensions différentes, ajuster la densité de cellules plaqué au prorata de la superficie relative afin que les cellules atteignent la confluence de 80 % au moment de la transfection.
  7. Lorsque la confluence de la cellule est de 80 %, retirer le support des cellules et remplacez-la par 1 mL de milieu complet DMEM / puits. Remettez la plaque dans l’incubateur jusqu'à ce que le PEI-SPION/siARN complexes ont été préparés et sont prêts à l’emploi (environ 30 min).
  8. Préparer des PEI-SPION/siARN complexes : calculer le montant de PEI-SPION/siARN complexes nécessaires pour une expérience de transfection. Dans un tube de microcentrifuge de RNase-libre 1,5 mL, mélanger une quantité appropriée de PEI-SPIONs avec siARN dans un rapport donné Fe : siARN. Par exemple, pour préparer le NPs de PEI-SPION/siARN contenant 100 µg de Fe à un ratio de Fe : siRNA de 4, ajouter 100 µL (1 mg Fe/mL), de PEI-SPIONs à 96 μL de siARN (0,26 μg/μL), puis en le mélangeant doucement avec une micropipette. Incuber 30 min à température ambiante.
    Remarque : Préparer un volume de PEI-SPION/siARN complexe qui est de 10 % supérieure à la masse totale et définitive pour tenir compte de toute perte accidentelle. Faire des complexes de PEI-SPION/siARN Fe : siARN faibles ratios, sous lequel des molécules de siARN sont complètement chargées dans le PEI-SPIONs et, par conséquent, de petites quantités de PEI-SPIONs peuvent être utilisées pour réduire au minimum la cytotoxicité potentielle. Expériences pilotes (analyse d’un retard de gel) pour l’optimisation du ratio Fe : siARN sont nécessaires.
  9. Retirez la plaque de 6 puits de l’incubateur (étape 3,7). Ajouter un volume requis du complexe de PEI-SPION/siARN goutte à chaque puits et agiter la plaque avec prudence afin d’assurer une répartition uniforme. Remettez la plaque dans l’incubateur jusqu'à ce que l’évaluation de la cellulaire absorption ou gène knockdown efficacité (d 1-3).
    Remarque : Les macrophages transfection avec PEI-SPION/siARN à une concentration de ~ 15 μg Fe/mL peuvent maximiser l’efficacité de transfection tout en minimisant la cytotoxicité potentielle.

4. systémique administration d’ARNsi aux Macrophages chez les Rats avec l’arthrite expérimentale

  1. Obtenir des rats Wistar mâles exempts d’agents pathogènes spécifiques qui sont âgés de 7 semaines. Habituer les rats pour 7D avant utilisation et leur fournir de l’eau et de nourriture suffisante. Induire l’arthrite adjuvant (AA) chez les rats comme décrit précédemment18.
  2. Préparer des PEI-SPION/siARN complexes comme indiqué au point 3.8.
  3. Injecter les PEI-SPION/siARN NPs (0,3 mg de siRNA/kg) dans l’AA rats via la veine caudale. Évaluer l’absorption cellulaire via, par exemple, cytométrie en flux, tissu biodistribution via, par exemple, une fluorescence en temps réel système, d’imagerie ou d’effets thérapeutiques basé sur, par exemple, les cliniques, histologiques et radiographique les analyses au moment désiré points18.
    Remarque : Pour les études de biodistribution cellulaire et tissulaire, traiter les rats avec une seule injection de la SNPP désirée ; pour les études thérapeutiques, injecter les rats avec les NPs est testé 1 x par semaine pendant trois semaines consécutives.

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Representative Results

La taille et zeta potentiel de PEI-SPIONs préparé avec ce protocole étaient de l’ordre de 29 à 48 nm (indice de polydispersité : 0,12 - 0,23) et 30 à 48 mV, respectivement. Ils étaient stables dans l’eau à 4 ° C pendant plus de 12 mois sans agrégation évidente. Afin d’évaluer leur siARN capacité de liaison, PEI-SPIONs étaient mêlés siARN à divers rapports de poids Fe : siARN. La figure 1 montre que lorsque le rapport de poids / Fe : siARN atteint 4 et au-dessus, la bande des siARN libre était manquant complètement, ce qui implique la liaison siARN réussie à PEI-SPIONs. Une préoccupation majeure des PEI en application biomédicale est sa toxicité, ce qui est le résultat de la forte charge positive, en particulier à un poids moléculaire élevé et de fortes doses. Comme illustré à la Figure 2 a, PEI-SPIONs avec un zeta potentiels de 30,5 et 37 mV ne montre pas de cytotoxicité apparente à des concentrations allant jusqu'à 30 μg Fe/mL, ce qui est environ deux fois supérieure à la concentration (15 μg Fe/mL) normalement utilisé pour la transfection de cellules. Cependant, PEI-SPIONs avec un potentiel zêta de 48 mV sont toxiques même à la dose la plus faible examinée (10 μg Fe/mL). Par conséquent, PEI-SPIONs possèdent une toxicité dépendante de frais. Puisque cationique charge n’est pas important pour l’absorption de NP par les macrophages19, nous suggérons que PEI-SPIONs avec un potentiel zêta moyenne ne dépassant pas + 37 mV sont utilisés pour le transfert de siARN, bien que la liaison des siARN diminuerait la charge dans une certaine mesure et soulager la cytotoxicité18.

Pour tester l’application potentielle de PEI-SPIONs pour ARNsi aux macrophages, la transfection in vitro a été réalisée avec la lignée de cellules macrophages murins RAW 264.7. Tel qu’analysé par cytométrie en flux, plus de 90 % des cellules ont été transfectées avec des complexes de PEI-SPION/siARN fluorescent étiquetés à 15 µg Fe/mL (Figure 2 b). En ce qui concerne l’efficacité de la transfection, il n’y avait en fait aucune différence entre PEI-SPION/siARN NPs formé à Fe : siARN rapports de poids de 4 et 8, bien que, en vertu de cette dernière condition, les NPs qui ont été formés étaient plus petits et plus faibles en charge positive parce qu’une moindre quantité de siARN a été chargée par particule. Nous avons également évalué l’effet de la concentration de PEI-SPION/siARN sur internalisation cellulaire par coloration au bleu de Prusse. Comme illustré à la Figure 2, les taches bleues dans les cellules transfectées ont été très peu détectables à 7,5 g Fe/mL, mais clairement visible à 15 µg Fe/mL. Fait intéressant, augmentation de la concentration de PEI-SPION/siARN à 32 µg Fe/mL n’a pas augmenté l’intensité de coloration, probablement parce que l’absorption de PEI-SPION/siARN a été saturée à des concentrations autour de 15 µg Fe/mL. En outre, la capacité de PEI-SPIONs pour la médiation de la cession de siARN a été corroborée en macrophages primaires18, et la méthode présentée ici a une efficacité de transfection de siARN haute en macrophages péritonéaux de rat, équivalentes à celle de RAW264.7 cellules. Les macrophages péritonéaux transfectées avec PEI-SPIONs hébergeant des siARN spécifique ont montré une diminution significative du niveau d’ARNm cible par rapport aux siARN non spécifique (Figure 2D), ce qui implique que les siARN peuvent s’évader de vésicules d’endocytose dans le cytoplasme et la portée du mécanisme de l’ARNi.

Précédemment, nous avons également étudié la capture cellulaire in vivo des complexes de PEI-SPION/siARN systématiquement administrés chez des rats souffrant de l’arthrite adjuvant18. Nous avons analysé l’efficacité de transfection de PEI-SPION/siARN dans les macrophages phagocytaires et des lymphocytes T nonphagocytic. Comme illustré à la Figure 3, cellules CD11b + ont plus efficacement que des cellules CD3 + à tout moment dans tous les organes examinés, ce qui indique que les PEI-SPION/siARN NPs ciblent préférentiellement macrophages18PEI-SPION/siARN complexes. Notamment, une accumulation de haut niveau de la SNPP a été observée à l’inflammation des articulations18, suggérant que le PEI-SPION peut être une plate-forme attrayante pour la délivrance systémique de siRNA therapeutics dans la polyarthrite rhumatoïde dont la pathogénie est liée à dysfonctionnement des macrophages et pour laquelle siARN local administration n’est pas un choix de prédilection en raison de l’implication des divers organes de la maladie.

Figure 1
Figure 1 : gel d’agarose de PEI-SPION/siARN complexes formés à divers rapports Fe : siARN (p/p). Un ratio de Fe : siRNA de 0 représente duplex siARN libres sans PEI-SPIONS. La taille moyenne et le potentiel zêta de les PEI-SPIONs gratuits utilisé ici étaient 30 nm et 45 mV. siRNA pouvait lier complètement à PEI-SPIONs lorsque le ratio Fe : siARN atteint 4 et au-dessus, cohérente avec les résultats précédents à l’aide de PEI-SPIONs avec une taille moyenne de 48 nm et un potentiel zêta de 30,5 Mt18. L’absence de bandes retardés (PEI-SPION/siARN complexes) peut refléter l’inaccessibilité des siARN pour EB pendant la coloration, l’indication des siARN forte liaison, et/ou la capacité de condensation de PEI-SPIONs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : caractérisation biologique de PEI-SPION et PEI-SPION/siARN NPs. (A), ce panneau indique une analyse de viabilité de cellules. 264.7 cellules ont été traitées pendant 16 h avec les doses indiquées de PEI-SPIONs portant le potentiel zêta différentes et, ensuite, un test MTS a été effectué. La viabilité cellulaire a été normalisée contre le contrôle (aucune exposition de particules). Les données sont la moyenne ± écart-type de puits dédoublés. (B), ce panneau indique une cytométrie de l’absorption de PEI-SPION/Cy3-siARN par 264.7 cellules crues. Les cellules ont été incubées pendant 24 h avec 15 g Fe/mL (graphique du haut) ou 5 μg Fe/mL (panneau inférieur) de PEI-SPIONs complexés avec siARN Cy3-étiqueté à un ratio (p/p) de Fe : siRNA de 4 et 8, respectivement. SiARN non spécifique (NC) représente des siARN fluorescents non–. M2 : gated région ; PE-H: Cy3 intensité de fluorescence. L’efficacité de transfection de siARN de PEI-SPIONs utilisé ici (37,8 nm, 48 mV) était semblable à une étude antérieure à l’aide de PEI-SPIONs avec une taille moyenne de 48 nm et un potentiel zêta de 30,5 Mt18. (C), ce panneau indique une analyse de l’absorption de PEI-SPION/siARN en visualisant les gisements de fer cellulaire. 264.7 cellules ont été incubées avec 7,5, 15 et 32 μg Fe/mL PEI-SPIONs (48 nm, 30,5 mV) complexé avec siARN (Fe : siARN = 8) et teinté de bleu de Prusse. Les barreaux de l’échelle sont de 20 μm. (D) ce panneau affiche une validation in vitro de l’efficacité silencieux du siARN envoyée par PEI-SPIONs. Un rat de siARN-cible spécifique chaîne de IL-2/15 récepteur β a été chargé à bord PEI-SPIONs (48 nm, 30,5 mV) à Fe : siARN = 8 et, ensuite, transfectés dans des macrophages péritonéaux de rat. Un siARN NC a été utilisé comme témoin. Le gène silencieux effet a été évalué par PCR quantitative. Les cellules sont incubées avec les complexes à 15 μg Fe/mL. Les données sont la moyenne ± SD de puits en triple. Panneau D a été modifié par Duan et al. 18 avec la permission de l’éditeur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : In vivo la capture cellulaire de PEI-SPION/siARN SNPP. Trois rats arthritiques ont été injectés par voie intraveineuse avec une seule dose de 0,3 mg/kg siARN-Cy3 formulé avec PEI-SPION (48 nm, 30,5 mV). Un rat injecté avec du PBS a été utilisé comme témoin. Sang, rate, foie, rein et inflammation des articulations ont été prélevées à 2, 8 et 24 h après l’injection. L’assimilation de PEI-SPION/Cy3-siARN NPs a été mesurée par cytométrie en utilisant (A) anti-CD3 et des anticorps monoclonaux anti-CD11b (B). Les pourcentages sont des siARN-Cy3 absorption au sein de la gated CD3 + ou cellules CD11b +. Les résultats présentés ici sont représentatifs des deux expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié par Duan et al. 18 avec la permission de l’éditeur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les macrophages sont réfractaires à transfecter par des approches nonviral couramment utilisées, telles que l’électroporation, liposomes cationiques et espèces de lipides. Ici, nous avons décrit une méthode fiable et efficace pour transfecter macrophages avec siARN. En utilisant le présent protocole, plus 90 % des macrophages RAW 264.7 cellules (Figure 2 b) et le rat macrophages péritonéaux18 peut être transfectées avec les siARN sans dégradation notable de la viabilité des cellules. Cette méthode dépend de la plate-forme de distribution PEI-SPION, qui est composé d’un noyau d’oxyde de fer et d’une coquille de PEI nanocarrier. Ainsi, la première étape clée du protocole est la synthèse de PEI-SPIONs adaptés pour la livraison de siARN. Habituellement, PEI-enduit SPIONs sont préparées à partir SPIONs acide oléique-enduit par une méthode d’échange de ligand dans lequel l’acide oléique est directement échangé de la surface de SPIONs par PEI ou ses dérivés15, générant hydrophiles NPs avec un chargés positivement surface. Dans le cas présenté ici, l’acide oléique plafonné sur la surface de SPIONs a été remplacé par l’acide dimercaptosuccinique soluble dans l’eau, et ensuite PEI était chargée sur des surfaces de SPION grâce à des interactions électrostatiques. Cette méthode est douce et facile à préparer en grande quantité, et les NPs synthétisées ont excellente stabilité à l’eau20. Il est bien connu que les PEI est cytotoxique et la toxicité est fortement corrélée avec son poids moléculaire21. Pour garantir la sécurité, une considération importante quand synthèse PEI-SPIONs est que ces particules sont recouvertes de bas poids moléculaire PEI, qui est 10 kDa dans le présent protocole. L’effet toxique indésirable de PEI est véhiculée principalement par sa charge positive ; par conséquent, la mesure du potentiel zêta de PEI-SPIONs est essentielle, et la valeur ne soit pas supérieure à 37 mV. Une diminution de la charge positive est possible simplement en réduisant la teneur en PEI. Une autre étape cruciale pour l’application de ce système de livraison de siARN est l’optimisation du ratio Fe : siARN par un retard de gel. Il semble raisonnable de PEI-SPION/siARN complexes à faible Fe : siARN rapports en vertu de laquelle siARN molécules sont encore capables de se lier à PEI-SPIONs. Dans ce cas, de petites quantités de PEI-SPIONs peuvent être utilisées, ce qui minimise sa cytotoxicité potentielle.

Dans le cas où une efficacité silencieux souhaitée ou l’effet thérapeutique n’est pas produit, vérifier l’efficacité de la transfection par microscopie à écoulement cytometry ou fluorescence en utilisant le transporteur chargé avec un siARN fluorescent étiqueté. Alternativement, l’absorption de PEI-SPION/siARN peut être examinée par coloration au bleu de Prusse conventionnel, qui est assez sensible pour détecter des simples granules de fer dans les cellules. Si l’efficacité de la transfection est effectivement faible, il peut être requis pour optimiser les conditions de transfection comme densité cellulaire, temps de transfection et la dose de particules de PEI-SPION/siARN. Le nombre de passage de cellules peut également affecter l’efficacité de transfection22. Dans la plupart des cas, un effet silencieux insuffisant n’est pas causé par une absorption insuffisante de PEI-SPION/siARN, comme l’a démontré le système actuel de PEI-SPION pour faciliter un transfert de siARN efficace aux macrophages. Parfois, combinant plusieurs siARN ciblant le même gène peut être une bonne stratégie pour améliorer l’efficacité défiant. Il convient de noter que, bien que l’ARNi se produit généralement dans les 24h de la transfection, l’apparition et la durée de silençage génique dépendant le taux de roulement de la cible, le taux de dilution et de la longévité des siARN et même la concentration du sérum dans le milieu. Ainsi, temps de parcours des expériences peuvent être nécessaires pour déterminer avec précision le point de temps de l’effet maximal2,22. Pour application de in vivo , l’efficacité thérapeutique dépend également de si et dans quelle mesure, la cible des siARN contribue aux phénotypes de la maladie ; ainsi, le choix d’une cible de siRNA approprié est essentiel pour obtenir les résultats escomptés.

Il y a plusieurs avantages du présent protocole pour livrer des siARN aux macrophages. (1) la méthode est facile à réaliser et est un moyen peu coûteux de produire des PEI-SPIONs en grande quantité, et le SNP produites est stables dans l’eau pendant plus de 12 mois s’ils sont conservés à 4 ° C. (2) la phagocytose spontanée de SPIONs par les macrophages facilite un transfert efficace de siARN véhiculée par PEI-SPION, transfection haut rendement. Il est prévu qu’outre 264.7 cellules crues et macrophages péritonéaux de rat, cette approche est applicable à d’autres lignées de cellules macrophages et macrophages primaires, aussi longtemps que la dose pour la transfection est optimisée. (3) transfection de siARN est rapide et facile à conduire comparé avec d’autres méthodes de transfection de macrophages comme nucleofection, qui prend du temps et nécessite un dispositif de Nucleofector2. (4) PEI-SPION peut être un véhicule idéal pour la livraison de siARN systémique macrophage ciblées dans certains modèles de la maladie. Les macrophages jouent un rôle crucial dans le développement et la progression des divers troubles inflammatoires chroniques, ainsi que des tumeurs ; et une caractéristique histologique de ces maladies est les vaisseaux sanguins anormaux avec l’endothélium qui fuit. Donc, en raison de la perméabilité améliorée et l’effet de rétention, systématiquement administrés NPs chargés de médicaments ont tendance à s’accumuler dans les tissus malades sont facilement capturés par les macrophages locales, conduisant à une spécificité améliorée, moins d’effets indésirables et amélioré efficacité thérapeutique. Dans un modèle de rat, de l’arthrite adjuvant, injectée par voie intraveineuse PEI-SPION/siARN complexes ont été repris par environ 40 % des cellules CD11b + durant les premières 24 h après l’injection de18. En revanche, lorsque les liposomes cationiques était utilisé comme support pour ARNsi systémique chez la souris, moins de 5 % des cellules CD11b + dans les articulations arthritiques piégé le siARN lipoplexes23. En outre, en raison de leurs propriétés magnétiques, l’application d’un champ magnétique extérieur pourrait encore faciliter l’accumulation des PEI-SPION/siARN complexes dans les tissus de cible et augmenter leur assimilation. Est également à noter que ces siARN chargés NPs peuvent être utilisés non seulement pour moduler la fonction des macrophages, mais aussi pour les macrophages d’imagerie pour fournir des informations de diagnostic, l’efficacité du traitement moniteur et prédisent les résultats cliniques de patients'12.

Cependant, les limites associées à ce protocole existent. Le système de PEI-SPION présente une gamme étroite de dosage pour ARNsi. L’absorption maximale s’est produite lorsque les cellules RAW264.7 ont été exposés à PEI - SPION/siARN à une concentration de 15 µg Fe/mL (Figure 2 b et 2C). Augmentation de la concentration de PEI-SPION/siARN à 32 µg Fe/mL n’a pas entraîné une augmentation de l’absorption cellulaire (Figure 2) mais, au contraire, pourrait accroître le risque d’induire la mort cellulaire en raison de la toxicité intrinsèque de l’IPE. En revanche, diminuant de PEI-SPION/siARN à 5 ou 7,5 µg Fe/mL réduit évidemment son absorption par les cellules RAW264.7 (Figure 2 b et 2C). Ainsi, nous proposons que la concentration optimale de PEI-SPION/siARN pour in vitro transfection de macrophage est ~ 15 µg Fe/mL (la concentration finale dans un puits). Une autre limite qui doit être pris en considération est l’effet possible de PEI-SPIONs sur l’activité des macrophages. Des nanoparticules peuvent induire la réponse immunitaire24, en fonction de leur modification de surface, la charge de surface, la taille, la forme et même sur la méthodologie utilisée pour synthétiser les. Mulens-Arias et coll. ont récemment rapporté que PEI-enduit SPIONs déclenchent macrophage activation25. La méthode de synthèse de PEI-SPION présentée ici diffère considérablement de celle de Mulens-Arias et al., et par conséquent, PEI-SPIONs préparer ou non fondées sur la gâchette de protocole actuel activation macrophage attend encore enquête. Toutefois, pour répondre clairement à cette préoccupation, nous suggérons que, outre le PEI-SPION complexé avec siARN scramble, le véhicule lui-même (PEI-SPION uniquement) peut servir à un autre contrôle lors de l’utilisation du présent protocole. Enfin, ce protocole n’est pas approprié pour la prestation de l’ADN en raison de sa taille relativement grande.

En résumé, nous avons présenté ici un procédé d’utilisation SPIONs PEI-enduit comme un véhicule pour la transfection de siARN dans les macrophages. Ces NPs peuvent délivrer efficacement des siARN dans les lignées cellulaires immortalisées macrophages, ainsi que dans les macrophages primaires in vitroet fonctionnellement induire de silençage génique sans affecter la viabilité des cellules à la dose optimale pour la transfection. En outre, PEI-SPIONs peut être utilisés pour in vivo ARNsi aux macrophages, ce qui permet à l’image, mais aussient moduler, macrophages, dont le dysfonctionnement contribue au développement et à la progression de nombreux troubles inflammatoires chroniques et cancers.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81772308) et le National clé de recherche et programme de développement de Chine (n° 2017YFA0205502).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco C11995500BT Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum Gibco A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) Gibco 15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit Promega G3582 For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China TCM13
Tissue culture plates (6-well) Corning 3516
Tissue culture dishes (10 cm) Corning 430167
RNase-free tubes (1.5 ml) AXYGEN MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430791
Trypsin Gibco 25200-056
Wistar rats Shanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder National
Institutes for Food and Drug Control, China		 for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa) Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. E107079
Ammonia water Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. A112077
Oleic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. O108484
Dimethylsulfoxide Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D103272
FeSO4•7H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012118
FeCl3•6H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011918
Dimercaptosuccinic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D107254
ultrafiltration tube Millipore UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. T100882
Particle size and zeta potential analyzer Malvern, England Nano ZS90

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References

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Médecine numéro 144 Macrophage transfection nanoparticules ARNsi polyéthylèneimine véhicule silençage génique
Nanoparticules de Polyéthylèneimine recouvertes d’oxyde de fer comme un véhicule pour la livraison de petits ARN interférents à Macrophages <em>In Vitro</em> et <em>In Vivo</em>
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Jia, N., Wu, H., Duan, J., Wei, C., Wang, K., Zhang , Y., Mao, X. Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (144), e58660, doi:10.3791/58660 (2019).

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