Summary
ポリエチレンイミン (PEI) を使用しての方法を述べる-siRNA 株マクロファージの超常磁性酸化鉄ナノ粒子をコーティングします。これらのナノ粒子は効率的に大食細胞の体外および体内と沈黙のターゲット遺伝子の発現を siRNA を提供できます。
Abstract
免疫応答の調節に重要な役割のためマクロファージは集中的な研究の対象とされている継続的に、自己免疫疾患、動脈硬化、癌などの多くの疾患で有望な治療上のターゲットを表します。プローブおよびマクロファージ機能を操作する任意の貴重なアプローチは、RNAi による遺伝子サイレンシングただし、マクロファージ siRNA トランスフェクションが頻繁に技術的に挑戦すると考慮し、現時点では、マクロファージに siRNA に専念ほとんど方法論 。ここでは、大食細胞への siRNA のターゲット配信の手段としてポリエチレンイミン被覆された超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (PEI SPIONs) を使用してのプロトコルを提案する.プリンスエド ワード島 SPIONs は、バインドおよび Fe: siRNA の重量比が 4 になったら完全に siRNA を凝縮、上記が可能です。生体外で、これらのナノ粒子が効率的に提供 siRNA プライマリ マクロファージとマクロファージのような未加工 264.7 のセル行の transfection のため最適な用量での妥協のセル実行可能性なしに、最終的には、彼らを誘導します。siRNA を介したターゲット遺伝子の沈黙。体外siRNA トランスフェクションに使用されている、離れて PEI SPIONs、また体内のマクロファージに siRNA を配信する有望なツールです。その磁気特性と遺伝子サイレンシングの能力の機能の組み合わせの観点から全身投与のペイ-スパイ/siRNA 粒子は、マクロファージの機能を調節するのみならず、マクロファージをイメージして追跡を有効にするを期待されています。PEI SPIONs が大食細胞への siRNA 配信簡単、安全、かつ効果的 nonviral プラットフォームを表します本質的の in vitroとin vivoの両方。
Introduction
マクロファージは、さまざまな量とはいえ体のすべての組織に分布する自然免疫系細胞の種類です。様々 なサイトカインや他のメディエーターを生産することによって、彼らは、微生物病原体の侵入に対する生体防御、損傷組織の修復、1組織の恒常性を維持するために重要な役割を果たします。その重要性のためマクロファージ継続的に集中的な研究の対象とされています。しかし、にもかかわらずその、遺伝子機能研究の有病率、siRNA による遺伝子サイレンシングはためマクロファージでは成功しにくいこれらの細胞、特に、プライマリ マクロファージ-transfect に困難が多い。これは毒性細胞膜は化学的に最もよく確立されたトランスフェクション アプローチに関連付けられている時 (例えばポリマーと脂質) の比較的高度に起因することができますまたは物理的に (例えば、電気穿孔法によると遺伝子銃) 中断 siRNA 分子マクロファージの生存率2,3を大幅に削減、膜を通過させる。さらに、マクロファージが専用食細胞分解酵素が豊富です。これらの酵素は、siRNA、特定遺伝子の siRNA は、細胞3,4に配信されている場合でも、その沈黙の効率を弱体化の整合性を損なうことができます。したがって、効果的なマクロファージ標的 siRNA 送達は配信4整合性および siRNA の安定性を保護する必要があります。
ますます機能不全マクロファージが開始し、自己免疫疾患、動脈硬化、癌などの特定の一般的な臨床疾患の進行に関与していることは明らかです。このためと、例えば、siRNA、マクロファージの機能を調節することは、これら疾患5,6,7を治療するための魅力的な方法論として発展しています。多くの進歩を遂げて、siRNA を用いた治療戦略の主要な挑戦は全身投与の siRNA とマクロファージは、望ましくない副作用につながる不十分な siRNA 吸収の悪い細胞の特異性。最適な細胞選択性に乏しいし、頻繁にオフ対象薬物ロードのナノ粒子 (NPs)、細網内皮系によってキャプチャされるの彼らの自発的な傾向により、副作用につながる無料核酸治療薬と比較してください。大食細胞は生体内で、最小限の副作用8と治療効果の向上を可能にする、受動的ターゲティングを設計することができます。無機ナノキャリア、様々 なリポソームや高分子9現在 NPs RNA 分子の配信のために探検が含まれます。その中でも、ポリエチレンイミン (PEI)、カチオン性高分子結合し、安定した NPs に核酸を凝縮できるのタイプは容量9,10を提供する最高の RNA を示しています。PEI は、核酸の酵素的及び非酵素的分解を防ぐ、セル膜を渡る彼らの転送を仲介する、自分の細胞内放出を促進します。当初 DNA 配信試薬として導入されたが、プリンスエド ワード島その後体内siRNA 配信、いずれかのローカルまたは全身9,10の魅力的なプラットフォームとなることを示した。
超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (SPIONs) は、生物医学、その磁気特性、生体適合性、生物学的に重要なオブジェクト、高表面面積、体積比に匹敵するサイズのために偉大な約束を示していると容易に適応病原体の添付ファイル11面。例えば、造影剤とマクロファージによる急速な吸収としてその潜在的なユーティリティのため SPIONs は、イメージ組織マクロファージ12好きな臨床ツールとして浮上しています。文献にはためのキャリアとして SPIONs のいくつかのレポートが含まれています SPIONs は核酸配信車11,13,14,15、我々 の知識としては広く研究もされている中マクロファージ標的 siRNA 送達。SPIONs による遺伝子デリバリーの彼らの表面は親水性カチオン性ポリマー、負荷電の核酸静電魅了できテザーの層でコーティング通常。その表面が低分子量 (10 kDa) 分岐プリンスエド ワード島 (PEI SPIONs) と変更された SPIONs を合成する方法を紹介します。これらの磁気 nanoplatforms の採用 siRNA は、細胞への siRNA トランスポートを有効にするプリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合を形成を凝縮していますし。我々 は、細網内皮のシステム16の細胞によって SPIONs の自発的な貪食能を理由バインディングの強力な能力と相まって、PEI SPIONs に siRNA の効率的な輸送に適したレンダリングしますペイによる核酸を凝縮マクロファージ。ここで表示されるデータは、PEI スパイ/siRNA による遺伝子サイレンシング文化だけでなく、体内のマクロファージの可能性をサポートします。
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Protocol
含む生きた動物は動物に従って実行されたすべてのメソッドは気し、中国・東南大学のガイドラインを使用します。
1. プリンスエド ワード島 SPIONs の作製
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オレイン酸変性 SPIONs の作製
- した FeCl3•6H2O および FeSO4•7H2O N2の保護の下で水に溶解します。
- ビーカーにした FeCl3•6H2O の 28 g と 20 g の FeSO4•7H2O に 80 mL の脱イオン水を追加します。ガラス管を通して水に N2を導入して固形物が溶解するまで攪拌します。
- アンモニア水 (28%) の 40 mL の添加に続いて 800 の rpm の撹拌速度の 72 ° C に反応混合物を加熱します。5 分間かき混ぜます。
- 上記の溶液に滴下オレイン酸の 9 mL を追加し、72 ° C、3 h でかき混ぜます。
- 部屋の温度 (RT) に得られた溶液を冷却します。磁気分離によるソリューションを沈殿させます。
- SPIONs 3 を含む沈殿物を洗うエチルアルコールを絶対 x、その後、N-ヘキサン 100 mL で沈殿物。
- した FeCl3•6H2O および FeSO4•7H2O N2の保護の下で水に溶解します。
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ジメルカプトコハク酸変性 SPIONs の作製
- オレイン酸 (OA) の 800 mg を追加-N-ヘキサン 200 mL に分散 SPIONs を変更し、60 ° C の水浴中で 3 首フラスコにアセトン 200 mL に分散したジメルカプトコハク酸 (DMSA) 400 mg
注: 前の手順から得られる OA 変更スパイの濃度を決定するには、スパイの分散の少量 (1 mL など) を取る N-ヘキサンを揮発し、結果の粉の重量を量る。 - 1,000 rpm で攪拌、還流と上記の溶液に滴下トリエチルアミンの 200 μ L を追加します。
- 撹拌し、還流の 5 h は後に、、磁気分離による黒い沈殿物を取得します。
- 水酸化テトラメチル アンモニウムを用いた水溶液の pH を調整することによって脱イオン水中の親水性の SPIONs を均一分散させます。
- オレイン酸 (OA) の 800 mg を追加-N-ヘキサン 200 mL に分散 SPIONs を変更し、60 ° C の水浴中で 3 首フラスコにアセトン 200 mL に分散したジメルカプトコハク酸 (DMSA) 400 mg
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SPIONs-PEI の準備
- PEI ソリューション (10 kDa) 2 時間 1,000 rpm で機械的攪拌下で 500 mL 三首フラスコ内に滴下 DMSA 変更スパイ コロイド溶液を追加 (WFe: Wペイ= 1:3)。
注: 電荷とプリンスエド ワード島 SPIONs のサイズは Wペイする WFeの比率によって異なります。WFe: Wプリンスエド ワード島比 1:3 は PEI SPIONs siRNA 配信に適したを合成するための良い出発点にすることができます。 - 100 kDa の分子量カットオフと 15 mL の内容を持つ限外ろ過チューブに得られた溶液を追加します。その後、残りの溶液が 1 mL になるまで 10 分間 5,400 × g で遠心します。ボリューム 15 mL を再び作るし、上記の手順 10 を繰り返しますソリューションに脱イオン水を追加 x 最終製品を入手します。その後、0.22 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルターし、4 ° C で最終的な製品をストア
- フェナントロリン17を用いた比色法によるプリンスエド ワード島 SPIONs の Fe の濃度を決定します。1 mg Fe/mL の濃度に無菌純水で PEI SPIONs を希釈し、4 ° C で保存
- プリンスエド ワード島スパイ ソリューション (1 mg Fe/mL) の 10 μ L を脱イオン水に 1 mL に希釈します。次に、動的光散乱装置による流体サイズ、ゼータ電位をテストします。
注: についての範囲で PEI SPIONs を準備する 30-50 nm。このサイズの範囲で siRNA 結合と細胞内取り込みに及ぼす NP サイズは重要であると表示されません。PEI SPIONs 軸受の平均電位以上 37 mV は、トランスフェクションの線量範囲に有毒であることし、安全性を確保するための細胞毒性の試金を実行必要があります。表面電荷とナノ粒子のサイズは、プリンスエド ワード島のコンテンツを調整することによって目的の範囲内で制御できます。
- PEI ソリューション (10 kDa) 2 時間 1,000 rpm で機械的攪拌下で 500 mL 三首フラスコ内に滴下 DMSA 変更スパイ コロイド溶液を追加 (WFe: Wペイ= 1:3)。
2. 準備中とプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA NPs の Agarose ゲル電気泳動
- 最終濃度 20 μ M (0.26 μ g/μ L) を生成するための水の RNase フリーで siRNA を希釈します。
- 0、1、2、4、および 8 というラベルの付いた 5 つの RNase フリー遠心チューブを準備します。ラベルは、異なる Fe: siRNA の重量比を表します。ピペット 3 μ L のすべてのチューブ (siRNA/チューブの ~0.8 μ g) に siRNA ソリューション。
- プリンスエド ワード島 SPIONs の形でそれぞれ 0、1、2、4、および 8、ラベルの付いたチューブに Fe の 6.4 μ g、3.2、1.6 0.8 0 を追加します。各管の総サンプル ボリューム未満 20 μ L をまま。上下に軽くピペッティングで混ぜます。
- プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合体の形成を許可する 30 分間常温混合物を孵化させなさい。この期間の間に 3% の agarose 高純度 agarose のゲルを作る。
注: (たとえば、5 または 6) 他の Fe: siRNA 比追加ペイ-スパイ-sirna 複合は準備およびテストが可能します。 - 6 x 5 μ L のサンプルごとの DNA の読み込みバッファーの 1 μ L を追加し、慎重に混ぜます。すべてのサンプルをロードし、ブロモフェノールの青ゲルの長さの 3 分の 2 まで移行まで 5 V/cm で電気泳動を実行します。エチジウム ブロマイド (EB) 15 ~ 20 分でゲルを染色します。
注: 作りたて電気泳動バッファーと EB 液使用する必要があります。 - UV のイメージング システムの下で siRNA バンドを視覚化します。PEI SPIONs と錯体を形成する siRNA で Fe: siRNA 比を確認し、その結果、無料 siRNA を表すバンドが遅滞または検出されません。
3. RAW264.7 マクロファージのIn Vitroトランスフェクション
- マウスのマクロファージ様 RAW264.7 細胞 DMEM を使用して 10 cm 皿中含む 10% 牛胎児血清 (FBS) 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 100 μ g/mL ストレプトマイシンあたり 100 U/mL ペニシリンあたりを完了します。
- トランスフェクション前日細胞から培地を吸引、リン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4) でそれらをすすいでください。10 cm 皿に 0.25% トリプシンの 1 mL を追加します。5% CO2インキュベーターで 37 ° C で約 5-10 分のための RAW264.7 細胞を trypsinize します。
- ときに細胞の大半をデタッチ (5-10 分) 後、トリプシンを不活化する料理に DMEM 完全培地 5 mL を追加します。単一セルの細胞塊の分散を上下にピペットで移しなさい。
- 細胞懸濁液を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。それは清ルート削除で 3 分間 300 × g で遠心します。
- 新鮮な DMEM 完全培地 5 mL で細胞を再懸濁し、セルをカウントします。
- プレート 9 × 104セルごと完全 DMEM 培地 2 mL で 6 ウェル プレートでよく、37 ° c 24 時間約 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
メモ: 異なるサイズのプレートを使用している場合は、細胞のトランスフェクション時に 80% の confluency に到達できるように相対的な表面積に比例してめっきセル密度を調整します。 - セル密度が 80% と、細胞からメディアを取り出して、ウェルあたり DMEM 完全培地 1 mL を置き換えます。プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合が用意されている (約 30 分) の使用のため準備ができているまでプレートをインキュベーターに戻ります。
- プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合の準備: プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合トランスフェクション実験に必要な量を計算します。1.5 mL 遠心チューブ RNase フリー、指定された Fe: siRNA の比率で siRNA を PEI SPIONs の適切な量をミックスします。例えば、4 の Fe: siRNA 比率で fe 100 μ g を含むペイ-スパイ/siRNA NPs を準備する 100 に追加 μ (1 mg Fe/mL) PEI SPIONs sirna (0.26 μ g/μ L)、96 μ L にはマイクロ ピペットをゆっくり混合すること続きます。室温 30 分間インキュベートします。
注: 任意の付随的損失の勘定合計の最終的な質量を超える 10% は、プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合体のボリュームを準備します。低鉄: siRNA 比、する siRNA 分子は PEI SPIONs に完全に読み込まれ、潜在的な細胞毒性を最小限に抑えるためしたがって、PEI SPIONs の少量を使用できますでペイ-スパイ-sirna 複合体を作る。Fe: siRNA 比の最適化のためのパイロット実験 (遅滞ゲルの試金) が必要です。 - インキュベーター (ステップ 3.7) から 6 ウェル プレートを取り出してください。各ウェルに滴下ペイ-スパイ-sirna 複合体の必要なボリュームを追加し、均一な配分を確保するように慎重にプレートを旋回します。細胞摂取または遺伝子ノックダウン効率 (1-3 d) の評価まで、インキュベーターにプレートを返します。
注: ~ 15 μ g 鉄/mL の濃度でペイ-スパイ/siRNA 株マクロファージが潜在的な細胞毒性を最小限に抑えながらトランスフェクション効率を最大化します。
4. 実験的関節炎ラットにおけるマクロファージへの siRNA の全身配信
- 7 週齢は、特定の病原体フリー男性 Wistar ラットを取得します。7 d 使用前のラットを慣らすし、十分な食料と水を提供します。上記18としてラットにアジュバント関節炎 (AA) を誘導します。
- プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合 3.8 の手順で説明するように準備します。
- AA ラット経由尾静脈にプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA NPs (0.3 mg/kg の siRNA の) を挿入します。細胞内取り込みを介して、例えば、フローサイトメトリー、組織体内を介して、例えば、リアルタイム蛍光イメージング システム、評価や治療効果に基づいて、例えば、臨床的、組織学的、およびレントゲン写真希望の時間に分析は、18 ををポイントします。
注: 細胞およびティッシュの体内研究目的の NPs 内の単回投与でラットを扱う治療学 3 週連続週 × テスト 1 NPs でラットを注入します。
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Representative Results
サイズとゼータ 29 48 nm の範囲、PEI SPIONs このプロトコルで準備の潜在性 (多分散性インデックス: 0.12 - 0.23) と 30 48 mV、それぞれ。12 ヶ月以上明らかな集計なしの 4 ° C で水に安定していた。彼らの siRNA の結合能を評価するには、PEI SPIONs Fe: siRNA 重量比はさまざまな siRNA と混合。図 1は、Fe: siRNA の重量比に達する 4 から無料 siRNA のバンドは完全に行方不明、PEI SPIONs に成功した siRNA バインドを意味を示します。バイオ医療応用でプリンスエド ワード島の主要な関心事はその毒性の高分子量および高用量に特に強い正の電荷の結果であります。図 2 a、プリンスエド ワード島-SPIONs、ゼータとの潜在的な示すように、30.5 と 37 の mV は 30 μ g 鉄/mL、二倍の濃度 (15 μ g/mL の Fe) より高い通常セルの transfection のため使用は低濃度で明らかな毒性を表わさなかった。しかし、48 のゼータ電位と PEI SPIONs mV が低用量の検討 (10 μ g 鉄/mL) でも有毒。したがって、PEI SPIONs 電荷依存毒性を持っています。カチオンがマクロファージ19NP 取り込みの重要ではないので我々 はお勧め平均電位 37 より高くないとペイ SPIONs siRNA バインディングがある程度料を減少させるが、mV が siRNA 転送に使用されると18細胞毒性を軽減します。
大食細胞への siRNA 配信 PEI SPIONs の潜在的なアプリケーションをテストするための in vitroトランスフェクションはマウスのマクロファージ細胞株 RAW 264.7 を行った。フローサイトメトリーによる解析、細胞の 90% 以上は 15 μ g 鉄/mL (図 2 b) に蛍光に分類されたプリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合を導入させた。トランスフェクション効率に関しては、プリンスエド ワード島-スパイ/siRNA NPs が、後者の条件下で形成された NPs は、サイズが小さく、弱い正電荷の 4 と 8、Fe: siRNA 重量比で形成間実際に違いはありません。siRNA の少ない量は、パーティクルごとに読み込まれました。プルシアン ブルー染色による細胞内面化にプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA 濃度の影響を検討しました。図 2のように、青い斑点が transfected セル内 15 μ g/mL の Fe ではっきりと見えるが、7.5 μ g 鉄/mL、最小検知.興味深いことに、32 μ g/mL の Fe にプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA 濃度増加しなかった染色強度おそらくペイ-スパイ/siRNA 取り込み周り 15 μ g/mL の Fe 濃度で飽和したので。さらに、siRNA 転送を仲介する PEI SPIONs の能力はプライマリ マクロファージ18の裏付けし、ここで紹介した方法は、ラット腹腔マクロファージ、RAW264.7 と同等の高い siRNA トランスフェクション効率セルです。SiRNA にエンドサイトーシス小胞から脱出できることを意味非特異的な siRNA (図 2 D) に比べてターゲット mRNA レベルの重要な減少を示した特定の siRNA をかくまっている PEI SPIONs をトランスフェクトした腹腔内マクロファージの細胞質と RNAi 機械。
我々 は以前も18アジュバント関節炎ラットにおける全身投与のペイ-スパイ-sirna 複合体体内の細胞内取り込みを検討しました。貪食マクロファージとリンパ球 T nonphagocytic ペイ-スパイ/siRNA トランスフェクション効率を分析しました。図 3に示すように、CD11b + 細胞は CD3 陽性細胞すべてペイ-スパイ/siRNA NPs が優先的にマクロファージ18をターゲットを示す臓器の任意の時点でより効率的にプリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合を取り上げた。特に、NPs の高度な集積が観察された炎症性関節18、PEI スパイは siRNA が病因にリンクされている関節リウマチにおける治療の全身の配信のための魅力的なプラットフォームであることが示唆されました。マクロファージの機能不全とどのローカル siRNA 管理はありません病気の複数の臓器の関与のための好みの選択です。
図 1: さまざまな Fe: siRNA (w/w) 比でアガロース電気泳動ペイ-スパイ-sirna 複合体形成します。0 Fe: siRNA 比は、PEI SPIONS なしの無料の siRNA のデュプレックスを表します。平均サイズと無料のペイ SPIONs ここで使用のゼータ電位が 30 nm と 45 mV。siRNA でした完全にバインド PEI SPIONs Fe: siRNA 比 4 に達すると、上記の平均サイズは 48 の PEI SPIONs を使用して前回の結果と一致して nm と 30.5 mV18のゼータ電位。薄弱バンド (ペイ-スパイ-sirna 複合) の欠如に EB siRNA の到達不能染色、強力な siRNA バインディングの表示および/またはペイ SPIONs の凝縮能力の間に反映するかもしれません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: PEI スパイとプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA NPs の生物学的特性です。(A) このパネルはセル実行可能性の試金を示しています。未加工 264.7 のセルは PEI SPIONs 異なるゼータ電位を軸受の指定された用量 16 h の扱われた、MTS アッセイを行った。細胞生存率がコントロール (粒子の露出なし) に対して正常化しました。データは、重複する井戸の平均 ± SD です。(B) このパネルは、未加工 264.7 のセルでペイ スパイ/Cy3 siRNA の取り込み、フローサイトメトリーによる解析を示しています。セルそれぞれ 15 μ g 鉄/mL (上部パネル) または 5 μ g PEI SPIONs Fe: siRNA (w/w) 比は 4 と 8、Cy3 標識 siRNA との複合体の Fe/mL (下段) で 24 時間培養。(NC) の非特異的 siRNA は、非-蛍光 siRNA を表します。M2: ゲート領域;Pe h: Cy3 蛍光強度。プリンスエド ワード島-SPIONs ここで使用の siRNA トランスフェクション効率 (37.8 nm、48 mV) の平均サイズは 48 の PEI SPIONs を使用して以前の研究に類似していた nm と 30.5 mV18のゼータ電位。(C) このパネルは、細胞の鉄沈殿物の可視化によるプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA 取り込みの分析を示しています。7.5、15、および 32 μ g 鉄/mL PEI SPIONs を添加して未加工 264.7 のセル (48 nm、30.5 mV) siRNA との複合体 (Fe: siRNA = 8) プルシアン ブルーで染色。スケール バーは、20 μ m です。(D) このパネルは、PEI SPIONs によって提供される siRNA のサイレンシングの効率の体外検証を示しています。SiRNA を対象とした特定ラット IL-2 受容体/15 β 鎖が PEI SPIONs に読み込まれた (48 nm、30.5 mV) Fe: siRNA = 8、ラット腹腔マクロファージに transfected。NC siRNA は、コントロールとして使用されました。サイレンシング効果を定量的 PCR で評価しました。15 μ g/mL の鉄の錯体を用いた細胞培養。データは、帳票の井戸の平均 ± SD です。パネル D は段らから変更されています。出版社の許可を得て18 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
プリンスエド ワード島-スパイ/siRNA NPs の細胞内取り込み体内図 3:.3 関節炎ラットを PEI スパイ配合 Cy3 siRNA 0.3 mg/kg の単回投与と静脈内投与 (48 nm、30.5 mV)。PBS 投与したラットは、コントロールとして使用されました。血液、脾臓、肝臓、腎臓、および炎症性関節は、注射後 2、8、24 h で収集されました。抗 CD3 (A) と (B) 抗 CD11b 抗体を用いたフローサイトメトリーによる NPs PEI スパイ/Cy3 siRNA の細胞内取り込みを評価しました。割合は、Cy3 siRNA CD3 ゲート + または CD11b + 細胞内取り込みです。ここに示した結果は、2 つの独立した実験の代表です。この図は、段らから変更されています。出版社の許可を得て18 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
マクロファージは、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム、脂質種などの一般的に使用される nonviral アプローチを使って耐火物。ここでマクロファージ siRNA を使って信頼性と効率的な方法について説明しました。現在のプロトコルを使用して、以上マクロファージのような未加工 264.7 のセル (図 2 b) とラット腹腔マクロファージ18の 90% ことができることをトランスフェクトした siRNA 細胞生存率の有意な障害なし。このメソッドは、酸化鉄のコアと PEI のシェルから成るナノキャリアは配信プラットフォーム ペイ-スパイに依存します。つまり、プロトコルの最初のキーのステップは PEI SPIONs siRNA 配信に適した合成。通常、PEI コーティング SPIONs から用意されてオレイン酸コーティング SPIONs、オレイン酸が直接交換 SPIONs の表面から PEI またはその誘導体15、配位子交換法による正荷電を持つ親水性の NPs を生成します。表面。ここで紹介する場合、SPIONs の表面に覆われたオレイン酸は水溶性ジメルカプトコハク酸によって置き換えられましたし、静電相互作用によるスパイ表面、プリンスエド ワード島に積まれ。このメソッドは、穏やかな、簡単に、大量に準備し、合成の NPs は、水20の優れた安定性。プリンスエド ワード島は、細胞毒性、毒性が強くその分子量21と相関が知られています。安全性の確保、PEI SPIONs を合成する場合の重要な考慮事項は、これらの粒子はこのプロトコルで 10 kDa である低分子量のペイが塗られます。PEI の望ましくない毒性影響が媒介主にその正電荷;したがって、PEI SPIONs のゼータ電位の測定が不可欠であると値が 37 より高くならない mV。PEI コンテンツを減らすだけでは、正電荷の減少を実現できます。この siRNA デリバリー システムの成功のアプリケーションの別の重要なステップは、ゲルの遅滞による Fe: siRNA 比の最適化です。分子はプリンスエド ワード島 SPIONs へのバインディングのまだ対応する siRNA の下低 Fe: siRNA 比でペイ-スパイ-sirna 複合にする合理的なようです。この状況では、その潜在的な細胞毒性を最小限に抑える、PEI SPIONs の少量を使用できます。
目的のサイレンシング効率または治療効果が生成されない場合に、蛍光に分類された siRNA 搭載キャリアを使用して流れ cytometry または蛍光顕微鏡によるトランスフェクション効率を確認してください。また、このプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA の取り込みは、セル鉄の単一顆粒の検出に十分な敏感なは従来プルシアン ブルー染色により調べることができます。トランスフェクション効率が確かに低い場合、細胞密度、トランスフェクションやプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA 粒子の線量などのトランスフェクション条件を最適化する必要があります。細胞の継代数は、トランスフェクション22の効率性も影響します。ほとんどの場合、不十分なサイレンシング効果が生じない不足のペイ-スパイ/siRNA 通風管によって現在のプリンスエド ワード島スパイ システムは、マクロファージに効果的な siRNA 転送を容易に実証されているよう。時に、同じ遺伝子をターゲットといくつかの Sirna を組み合わせたノックダウン効率を高めるための良い戦略をすることができます。それは、RNAi は一般的にトランスフェクションの 24 時間内で発生しますが、発症と遺伝子サイレンシングの継続時間が対象の離職率、希釈率と sirna、長寿、培地の血清濃度も依存ということは注目に値する。したがって、時間のコースの実験は最大効果2,22の時点を正確に判断する必要があります。生体内で申請、治療効果によっても異なるかどうか、およびどの程度、siRNA のターゲット疾患表現型; に寄与したがって、適切な siRNA のターゲットの選択は、期待される結果にとって重要です。
マクロファージに siRNA を提供するためのこのプロトコルのいくつかの利点があります。(1) の方法が容易に行えるし、大量に PEI SPIONs を生産する安価な方法で、NPs 生産は、12 ヶ月以上の耐水性 4 ° C で保持している場合(SPIONs のマクロファージの貪食 2) 自然で高いトランスフェクション効率、効果的な PEI によるスパイ siRNA 転送が容易になります。未加工 264.7 のセルおよびラット腹腔マクロファージのほかこのアプローチが他のマクロファージ細胞株およびプライマリ マクロファージに適用限り transfection のため線量の最適化が期待されます。(3) siRNA トランスフェクションは速く、他のマクロファージ トランスフェクション方法は時間がかかると Nucleofector デバイス2必要です nucleofection などに比べ簡単に実施できます。(4) ペイ スパイは特定疾患モデルにおけるマクロファージ標的の全身投与による siRNA 配送のための理想的な車をすることができます。マクロファージは、開発と各種の慢性炎症性疾患として腫瘍の進行に重要な役割を再生します。これらの病気の 1 つの顕著な組織学的特徴、漏れの内皮細胞と異常な血管です。したがって、強化された透磁率と保持の効果のため全身投与薬ロード NPs 罹病組織に蓄積する傾向があるおよび強化された特異性につながるローカルの大食細胞によって容易にキャプチャされた、副作用を低減し、改善治療効果。アジュバント関節炎ラットのモデルで静脈内に注射のペイ-スパイ-sirna 複合によってとられた CD11b + 細胞の ~ 40% 最初の 24 時間中に注入18後。対照的に、カチオン性リポソームは、マウスの全身投与による siRNA の配信のためのキャリアとして使用された、関節の CD11b + セルの 5% 未満は siRNA リポプレックス23を捕捉されました。さらに、磁気物性によりアプリケーション外部磁場のさらに標的臓器のペイ-スパイ-sirna 複合体の蓄積を容易にして自分の細胞内取り込みを増加します。注目すべきは、このような siRNA ロード NPs モニター治療効果の診断情報を提供するためにマクロファージの機能を調整するためだけではなくイメージング マクロファージも使用ことができます12患者の臨床転帰を予測します。
ただし、このプロトコルに関連する制限があります。プリンスエド ワード島スパイ システムは、投与による siRNA デリバリーのための狭い範囲を表わします。最大吸収量は、RAW264.7 細胞は 15 μ g 鉄/mL (図 2 bおよび2 C) の濃度でペイ-スパイ/Sirna にさらされたときに発生しました。Fe/mL 細胞内取り込み (図 2) の増加で起因しなかったが、それどころか、プリンスエド ワード島の固有の毒性による細胞死を誘導のリスクを高める可能性があります 32 μ g にプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA 濃度を増加させます。その一方で、Fe/mL 明らかに RAW264.7 細胞 (図 2 bおよび2 C) 吸収を削減 5 または 7.5 μ g にプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA を減少します。したがって、培養マクロファージの transfection のため最適なプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA 濃度が ~ 15 μ g 鉄/mL (井戸に最終濃度) であることを提案します。もう一つの制限を考慮する必要があるマクロファージ活性にプリンスエド ワード島 SPIONs の可能な効果であります。ナノ粒子は、免疫応答24、合成するための方法論もとその表面改質、表面電荷、サイズ、形状、によってを引き起こす可能性があります。Mulens アリアらは最近、マクロファージ活性化25をペイ コート SPIONs にトリガーを報告しました。紹介 PEI スパイ合成法は、Mulens アリアらのそれから著しく違います、現在のプロトコル トリガーに基づく PEI SPIONs の準備かどうかしたがって、マクロファージ活性化を待ってさらに調査。ただし、明確にこの問題に対処するため我々 はお勧め、PEI スパイ スクランブル siRNA、車両自体 (PEI スパイのみ) 複合体に加えて現在のプロトコルを使用するときに別のコントロールとして使用できます。最後に、このプロトコルは DNA のサイズが比較的大きいため配信のため適していません。
要約すると、我々 は大食細胞で siRNA トランスフェクション用車両としてペイ コート SPIONs を使用する方法をここで紹介。これらの NPs は、不死化マクロファージ細胞株にだけでなく、プライマリの大食細胞の in vitro、siRNA を効率的に配信し、機能的誘導ジーンサイレンシングの transfection のため最適な用量でセル実行可能性に影響を与えることがなくできます。また、PEI SPIONs イメージする大食細胞への siRNA 配信生体内で使用すると同様に変調、マクロファージが機能不全が開発し、多くの慢性炎症性疾患の進行に貢献して癌。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、中国の国家自然科学基金 (81772308) とキー研究開発中国プログラム (第 2017YFA0205502) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , Springer. 123-143 (2009).
- Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
- Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
- Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
- Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
- Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
- Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
- Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
- Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
- Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
- Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
- Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
- Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
- Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
- Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
- Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
- Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
- Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
- Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
- Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
- Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).
