Nerv stamcellers differentiering av en One-step kalla atmosfärsplasma behandling In Vitro
Summary
Detta protokoll syftar till att ge detaljerade experimentella steg i en kall atmosfärsplasma behandling på neurala stamceller och immunofluorescens upptäckt för differentiering förbättring.
Abstract
Utvecklingen av fysiska plasma-teknik, kall atmosfäriska plasmor (CAPs) har undersökts allmänt i sanering, cancerbehandling, sårläkning, behandling rotfyllning, etc., bildar ett nytt forskningsfält kallas plasma medicin. Att vara en blandning av elektriska, kemiska och biologiska reaktiva arter, CAPs har visat sin förmåga att förbättra nerv stamceller differentiering både in vitro- och in-vivo och är att bli en lovande väg för neurologisk sjukdomsbehandling i framtiden. Den mycket mer spännande nyheten är att använda CAPs kan förverkliga ett steg, och säkert regisserad, differentiering av neurala stamceller (Karolina) för vävnad transport. Här visar vi detaljerade experimentella protokoll använder en self-made CAP jet-enhet för att förbättra NSC differentiering i C17.2-Karolina och primära råtta neurala stamceller, och att observera cell ödet av inverterad samt fluorescensmikroskopi. Med hjälp av immunofluorescens färgning teknik, Vi hittade både de Karolina visade en accelererad differential än den obehandlade gruppen och ~ 75% av Karolina differentieras selektivt efter nervceller, som är främst mogen, kolinerga och motor neuroner.
Introduction
Dirigerad differentiering av Karolina in en viss utvecklingslinje för vävnad transport anses vara en av de mest lovande behandlingar för neurodegenerativa och neurotraumatic sjukdomar1. Exempelvis önskas catecholaminergic dopaminerga neuron särskilt i Parkinsons sjukdom (PD) behandling. Traditionella metoder för att förbereda önskad cellerna för transport har dock många nackdelar, såsom kemisk toxicitet, ärrbildning, eller andra, som i hög grad hämmar tillämpningar av Karolina i regenerativ medicin2. Därför är det mycket nödvändigt att hitta en ny och säkert sätt för NSC differentiering.
Plasma är den fjärde delstaten frågor, följande fasta, flytande och gas, och det utgör mer än 95% av frågor i hela universum. Plasma är elektriskt friläget med obundna positiva/negativa och neutrala partiklar och genereras vanligtvis av en hög spänning urladdning i labbet. Under de senaste två decennierna, har tillämpningen av plasma i biomedicin uppmärksammats enormt världen över som utvecklingen av kall atmosfärstryck plasma-teknik. Tack vare detta technic, stabilt låg temperatur plasma kan genereras i den omgivande luften på atmosfär utan arc bildande och består av olika reaktiva arter, såsom reaktiva kväve arter (RNS), reaktiva syreradikaler (ROS), ultraviolett (UV) strålning, elektroner, joner och elektriska fält3. CAPs har unika fördelar för mikroorganismen inaktivering, cancerbehandling, sårläkning, behandling av hudsjukdomar, cellproliferation och cell differentiering4,5,6,7. I tidigare arbete visade vi att kalla atmosfärsplasma jet kan förbättra differentieringen av Karolina i både murina neurala stamceller C17.2 (C17.2-Karolina) och primära råtta neurala stamceller, uppvisar en stor potential att bli ett kraftfullt verktyg för den riktade differentiering av Karolina8. Även om mekanismen av CAP förbättring av NSC differentiering inte är helt klarlagt ännu, nr genereras av CAPs har visat sig vara en viktig faktor i processen. I detta arbete, vi strävar efter att tillhandahålla en detaljerad experimentellt protokoll för att använda ett atmosfäriskt tryck helium och oxygen plasma jet för behandling av Karolina i vitro, cell förberedelse och förbehandling, morfologi observation av inverterade mikroskopet, och Fluorescence mikroskopi observation av immunofluorescens färgning.
Protocol
Representative Results
Discussion
C17.2-Karolina är en typ av förevigade neurala stamceller linje från neonatal mus cerebellär korniga lagret celler, utvecklat av Snyder och andra10,11. C17.2-Karolina kan differentieras till nervceller, astrocyter och oligodendrocyter och används allmänt i neurovetenskap12. I vår tidigare studie kunde CAPs förbättra differentieringen av C17.2-Karolina till nervceller. En proof-of-principle studie genomfördes också använda prim?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av programmet Scholar Huazhong, oberoende innovationsfonden av den Huazhong universitet av vetenskap och teknik (nr 2018KFYYXJJ071) och den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (nr 31501099 och 51707012).
Materials
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
