Summary
Visualización y medición del crecimiento de raíz en situ es extremadamente difícil. Se presenta un método rhizobox personalizable para seguir el desarrollo de la raíz y proliferación en el tiempo en respuesta al enriquecimiento de nutrientes. Este método se utiliza para analizar maíz diferencias genotípicas en la plasticidad de la raíz en respuesta a una fuente de nitrógeno orgánico.
Abstract
Las raíces son notoriamente difíciles de estudiar. El suelo es una barrera visual y mecánica, lo que hace difícil rastrear raíces en situ sin cosecha destructiva o equipo costoso. Presentamos un método rhizobox personalizable y asequible que permite la visualización no destructiva de crecimiento de las raíces en el tiempo y está particularmente bien adaptado al estudio de la plasticidad de la raíz en respuesta a parches de recursos. El método se validó mediante la evaluación de maíz variación genotípica en las respuestas de plasticidad a parches que contienen residuos de leguminosa marcado con N 15. Métodos se describen para obtener mediciones representativas de desarrollo en el tiempo, medir la densidad de longitud de raíz en parches que contienen el recurso y el control, calcular las tasas de crecimiento de la raíz y determinar recuperación de 15N por la planta raíces y brotes. También se discuten las posibles aplicaciones futuras del método, ventajas y advertencias. Aunque debe tenerse cuidado para asegurar que las condiciones experimentales no sesgar los datos de crecimiento de raíz, el protocolo de rhizobox presentado produce resultados confiables si lleva a cabo con suficiente atención al detalle.
Introduction
Aunque a menudo pasado por alto en comparación con sus contrapartes sobre tierra, las raíces juegan un papel crítico en la adquisición de nutrientes de plantas. Dado el coste de carbono substancial de raíz construcción y mantenimiento, las plantas han desarrollado mecanismos para desarrollar raíces sólo forraje es donde vale la pena la inversión. Sistemas de la raíz puede así eficiente y dinámica de la mina parches de recursos por proliferación de hotspots, regular las tasas de absorción y nutrientes rápidamente translocan al floema para más transporte1. Respuestas de plasticidad pueden variar ampliamente entre planta especies o genotipos2,3 y dependiendo de la forma química de los nutrientes implicados4,5. Variación en la plasticidad de la raíz se debe explorar más lejos, como entender las respuestas de la raíz compleja para recursos de suelos heterogéneos podrían informar a reproducción y estrategias de gestión para aumentar la eficiencia de uso de nutrientes en la agricultura.
A pesar de su necesidad y relevancia para los sistemas de la planta de comprensión, visualización y cuantificación de la plasticidad de la raíz a escalas relevantes plantea desafíos técnicos. Excavación de la corona de la raíz de la tierra ("shovelomics"6) es un método común, pero raíces finas explotan pequeños poros entre agregados de suelo y excavación conduce inevitablemente a un cierto grado de pérdida de estas raíces frágiles. Además, cosecha destructiva hace imposible seguir los cambios en un sistema de raíz en el tiempo. In situ métodos imagenológicos como la tomografía computarizada de rayos x permiten la visualización directa de los recursos de suelo y raíces en la alta resolución espacial7, pero son costosos y requieren de equipo especializado. Experimentos de cultivo hidropónicos evitar limitaciones relacionadas con la extracción de raíces del suelo, pero arquitectura y morfología de la raíz se diferencian en medios acuosos con respecto a las limitaciones mecánicas y Biofísica complejidad de suelos8,9. Finalmente, funciones y procesos de la rizosfera pueden integrarse con plasticidad del desarrollo en estos medios artificiales.
Presentamos un protocolo para la construcción y uso de rhizoboxes (contenedores rectangulares estrechas, cara claro) como un método de bajo costo, adaptable para caracterizar el crecimiento de la raíz en el suelo con el tiempo. Marcos diseñados especialmente fomentan raíces crecer preferentemente contra la parte trasera debido al Gravitropismo, aumentar la precisión de las mediciones de longitud de raíz. Rhizoboxes se utilizan para estudiar el crecimiento de las raíces y rizosfera interacciones10,11,12, pero el método presentado aquí ofrece una ventaja en la simplicidad con su diseño del solo-compartimiento y barato materiales y está diseñado para estudiar las respuestas de la raíz a los nutrientes localizadas. Sin embargo, el método también podría ser adaptado para el estudio de una variedad de otros procesos como la competencia intra/intraespecífica raíces y rizosfera, distribución espacial de la actividad enzimática, compuestos químicos y microbios. Aquí, se investigan las diferencias genotípicas entre híbridos de maíz en respuesta a parches de 15leguminosas marcados con N residuos y resaltar resultados representativos para validar el método de rhizobox.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. elaboración de los separadores, frontal y traseras
- Preparar los paneles delanteros y traseros.
- Corte dos pedazos de acrílico grueso claro 0,635 cm a 40,5 cm de ancho por 61 cm de largo por caja o comprar piezas pre-cortadas (véase Tabla de materiales).
- Usando una broca de taladro diseñada para acrílico, perforaciones de 0,635 cm de diámetro de 1,3 cm de los bordes laterales en 2.5, 19, 38 y 53,3 cm desde la parte superior. Perfore agujeros de 1,3 cm desde el borde inferior en 2.5, 20.3 y 38 cm desde el lado izquierdo (figura 1).
Nota: Es más eficiente usar un taladro para una pila de hojas de seis a diez en un momento, pero también se puede utilizar un taladro de mano. - Quitar cualquier revestimiento protector de acrílico y limpiar suavemente los paneles antes de montar las cajas.
Figura 1: distribución de orificios perforados. Los agujeros son perforado 1,3 cm de los bordes laterales en 2.5, 19, 38 y 53,3 cm de la tapa y 1,3 cm desde el borde inferior en 2.5, 20.3 y 38 cm desde el margen izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Preparar a los espaciadores laterales e inferiores.
- Corte tres espaciadores por caja de polietileno de alta densidad (HDPE) o compra dos distanciadores laterales corta (0,635 cm de espesor, ancho 2,5 cm, 57 cm de largo) y parte inferior corta un espaciador (0,635 cm de espesor, 40,5 cm de largo y 2,5 cm de ancho). Consulte la tabla de materiales.
- Alinee a los separadores entre los paneles anterior y posterior a lo largo de los lados y la parte inferior de la caja. Usando un taladro de mano o taladro, perfore los orificios existentes en el frente y detrás otra vez para que los orificios de pasan a través de las tres capas limpiamente.
- Mantenga las capas colocar con pinzas o mediante la instalación de una combinación de tornillos, tuercas y arandelas en cada recién perforado agujero (ver paso 3.1).
2. instalación de una tira de guata de poliéster en la parte inferior de la caja
Nota: Esto evitará que suelo y el agua se filtre a través de las uniones entre los espaciadores.
- Corta poliester bateo en 2,5 cm de ancho por tiras de 40,5 cm de largo (véase la Tabla de materiales).
- Con la parte trasera plana y los separadores en la parte superior de la mentira, ponen el bateo directamente sobre el separador de la parte inferior y sujetarlo con el panel superior (figura 2).
Figura 2: ensamblado rhizobox con bateo de. Una estrecha franja de bateo en la parte inferior de la rhizobox evita que escaparse hacia fuera el suelo y arena. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. montaje de la Rhizoboxes
- Montar el rhizoboxes con tornillos de hilo 20 (3,2 cm de longitud por 0,635 cm de diámetro), arandelas (0,635 cm de diámetro interno) y las tuercas hexagonales (de tamaño para ajustar los tornillos, véase Tabla de materiales.
- Apriete cada tornillo a través de una arandela, panel frontal, espaciador, panel trasero, arandela y tuerca hexagonal. Asegúrese de que los tornillos estén muy apretados; Si la caja está montada libremente, el suelo se derramará a través de espacios entre los paneles y los espaciadores laterales.
Nota: Acrílico se rasguña fácilmente, y los rasguños pueden interferir con las mediciones de root, así manejar las cajas ensambladas con cuidado. Evite apilables cajas a menos que el material de protección se coloca entre ellos. - Preparar a dos espaciadores de parche (espaciadores que se utilizará para crear los parches de tratamiento y control) por caja. Cortar a los espaciadores de polietileno de alta densidad (HDPE) hojas o comprarlas precortadas (espesor 0,635 cm, 3,8 cm de ancho, 28 cm de largo; véase Tabla de materiales). Taladre un agujero de 0,635 cm de diámetro en cada separador, 2 cm de la tapa a lo largo de la línea media (figura 3).
Figura 3: parche espaciadores. Tornillos a través de las tiras del centro de HDPE mantienen caiga en la caja. El rhizobox se llena con tierra alrededor de los espaciadores, el suelo se humedece y los separadores se eliminan para dejar vacíos parches de tratamiento y control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Fije un tornillo con una tuerca de cada para que el espaciador puede introducirse parcialmente en el rhizobox hasta que el tornillo le impide ir más lejos (figura 3).
Nota: Cuando el suelo es humedecido por los espaciadores y los separadores se eliminan, seguirán siendo dos espacios vacíos pueden llenarse con los sustratos apropiados para la revisión de tratamiento que contienen nitrógeno y parche de control.
4. edificio PVC marcos para apoyar la Rhizoboxes en un ángulo
Nota: Cuando la caja se coloca en un ángulo, Gravitropismo animará a las raíces para crecer contra la parte trasera para que todas las raíces son visibles para el seguimiento. El cloruro de polivinilo (PVC) dimensiones en figura 4 resultado en un marco que mantiene el rhizobox en un ángulo aproximado de 55 ° en el Banco.
- 13 piezas de 1,3 cm de diámetro PVC por la caja de corte: 2 × 44 cm longitud, 3 tiras de cm × 42, 2 tiras de x 36,3 cm, 2 tiras de × 25.4 cm y 4 tiras de × 3.8 cm (véase Tabla de materiales).
Nota: Una tronzadora es altamente recomendado para eficiencia y cortes incluso. - Use codos de 2 vías de 4 ×, 2 × 3 vías codos y uniones en T 4 (véase Tabla de materiales) para montar la caja como se muestra en la figura 4.
Nota: Los marcos deben ser estables sin pegamento adicional, pero el pegamento del PVC se puede utilizar si es necesario.
Figura 4: estructura para apoyar rhizoboxes. La ligera montura está hecha de PVC cortado a la longitud especificada y conectado mediante el tipo conjunto indicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. coser fundas protectoras para reflejar la luz y el calor
Nota: Raíces evitar luz, así que estos casos excluyen la luz para asegurarse de que observó las respuestas de plasticidad de raíz son conducidas por la fuente de nutrientes en los parches y no por evitar la luz. Tela ligera privación también reduce la temperatura interior de la rhizoboxes, ayudando a evitar el estrés por calor.
- Cortar la tela de la privación de luz (material especializado que es blanco por un lado y negro por el otro) en piezas aproximadamente 95 cm de ancho y 69 cm de largo (véase Tabla de materiales). Se requiere una sola pieza por caja.
- Doblar cada pieza por la mitad a lo largo del borde largo para formar una manga de 47,5 cm x 69 cm. Utilizando una aguja de máquina de coser para dril de algodón, hilo de acolchar resistente y una costura estrecha, coser a lo largo de la parte inferior y 3/4 de la vía por el lado de la manga. Prender las esquinas superiores con un perno de seguridad.
6. preparación de suelo 1:1 (V/V): sustrato para llenar las Rhizoboxes de arena
- Recoger aproximadamente 1.000 cm3 de suelo de campo (desde el sitio de interés) por la caja. Secar el suelo a peso constante en bandejas poco profundas a 60 ° C.
Nota: Suelo para este experimento fue recogida inmediatamente después de la cosecha en un campo de maíz orgánico administrados de 0\u201210 cm de profundidad. - Moler el suelo con un mortero y una maja para pasar a través de un tamiz de 2 mm. Medir la densidad aparente del suelo pesando un volumen conocido de suelo.
- Obtener la arena (como la arena de juego, que económicamente puede comprarse en una ferretería; véase Tabla de materiales) y medir la densidad a granel.
- Medir volúmenes iguales de arena y tierra en un recipiente y mezclar bien. Utilice un embudo para llenar la caja lenta y uniformemente a 2,5 cm desde la parte superior, sin agitar la caja para hacer el sustrato a colocar. Medir este volumen del sustrato; debe ser aproximadamente de 1.272 cm3.
- Multiplicar la densidad aparente de la arena por mitad de este volumen para obtener la masa de la arena necesaria para cada caja. Hacer lo mismo con la densidad aparente del suelo para obtener la masa de suelo necesaria para cada caja.
Nota: Para el suelo del campo y arena utilizados en este experimento, este era 976 g de arena y 774 g de suelo, pero estas cantidades variarán dependiendo de la densidad aparente del suelo utilizado. - Etiqueta un gran plástico bolsa por rhizobox pesar las masas apropiadas de arena y tierra en la bolsa y homogeneizar bien.
- Analizar este tipo de suelo 1:1- y sustrato para contenido de nutrientes y la abundancia natural de 15N (δ15N).
7. sustrato preparación para el tratamiento y revisiones de Control
- Dos pequeños zip-top bolsas de plástico por rhizobox, uno para el parche de tratamiento y uno para el parche de control de la etiqueta. Pesar 30 g de suelo: arena de sustrato de cada bolsa grande (paso 6.6) en las dos bolsas pequeñas correspondientes.
- Mezclar el sustrato con una fuente de nitrógeno marcado con N 15para el parche de tratamiento. Para esto, pesar 1 g de residuos de planta marcada con N 15u otra fuente de N (la cantidad se puede ajustar como deseado) en cada bolsa de tratamiento (pequeña bolsa) y mezclar bien.
Nota: Para este experimento, se utilizó una mezcla de 15trébol marcado con N y el residuo de la vicia. Semillas de trébol y vicia fueron plantadas en una mezcla 1:1 de arena y vermiculita y cultivadas bajo condiciones de invernadero. Las plantas fueron regadas diariamente con agua desionizada y dos veces por semana con la fuerza de 1/100 de Long Ashton solución13 que contiene fuentes de nitrógeno marcado con N 15. Toda biomasa aérea se cosechó en cuatro semanas después de la siembra, secada y molida para pasar por un tamiz de 2 mm. Si se elige un alimento diferente, especialmente si ese elemento es móvil en el suelo, experimentos piloto para probar la lixiviación se anima. Formas de liberación lenta de nutrientes podrían ser utilizadas o un diseño de rhizobox diferente podía ser elegido para restringir la lixiviación (por ejemplo, en compartimientos separados10) si es necesario.
8. Rhizobox con el sustrato y establecer el tratamiento y Control de carga parches
- Pesan cada rhizobox vacío y registrar los pesos para su uso posterior.
- Inserte a dos espaciadores de parche (ver paso 3.2) en un rhizobox hasta que el tornillo se les impide ir más allá. Marcar la profundidad de la parte inferior con una marca de luz en el lado de la rhizobox (figura 3) y retire a los espaciadores.
- Usando un embudo con una abertura de madre que es tan estrecho como la apertura de rhizobox, llenar el rhizobox de la correspondiente bolsa grande de sustrato a la profundidad marcada. Mover el embudo hacia adelante y hacia atrás lentamente y uniformemente para que el sustrato llena uniformemente y no crear canales de flujo preferencial.
- Cuando el sustrato alcanza la profundidad marcada, coloque a los espaciadores en 5 cm de cada lado de la caja. Continúe llenando el cuadro hasta que el nivel de sustrato aproximadamente 5 cm de la parte superior de la caja (debe ser substrato restante en la bolsa).
- Moje bien alrededor de cada espaciador.
Nota: En este experimento, esto se logró mediante la entrega de 50 mL de agua a través de emisores de goteo insertado entre el borde externo de cada espaciador y el lado de la rhizobox, verter 50 mL de agua entre los dos espaciadores. Riego lento es necesario para humedecimiento uniforme. - Retire a los espaciadores mientras el suelo está húmedo, dejando una cavidad vacía para los parches.
- Una película de transparencia hacia el exterior de cada rhizobox de la cinta (véase Tabla de materiales). Marque un lado como tratamiento y como control y llenar los parches de las bolsas apropiadas utilizando el embudo. Trazar los límites de cada mancha en la transparencia con marcador permanente.
- Se llenan lo rhizobox uniformemente el sustrato restante. Seguimiento de la parte superior del sustrato en la transparencia.
- Repita para el resto rhizoboxes. Guardar todas las bolsas para cosecha.
9. incluso de riego 60% capacidad de retención de agua
Nota: Esta cantidad de humedad del suelo se encontró para evitar que las plantas experimentan sequía mientras que previene el desarrollo de condiciones anóxicas o crecimiento de las algas.
- Medir la capacidad de retención de agua (WHC) del sustrato14.
- Calcular el peso ideal de cada caja; Aquí se define como la suma del peso de la rhizobox vacío combinado con el peso del sustrato en el 60% de capacidad de retención de agua.
- Multiplicar el WHC (gramos de agua / g de sustrato seco) por 0,6 para obtener la masa de agua llevó a cabo en el sustrato 60% CPM. Añadir esta masa a la masa de sustrato seco y la masa de la fuente 15N.
- Añadir el peso vacío de cada caja al número obtenido anteriormente.
- Pesar las cajas una vez que han sido llenados. Restar el peso de cada caja (en g) en este punto de su peso ideal (en g) calculado en el paso 9.2. Este volumen (en mL) de agua desionizada (DI) agua lentamente y uniformemente.
Nota: Este paso puede hacerse utilizando riego por goteo o riego a mano. Si riego a mano, deje que el agua infiltre completamente antes de añadir más para evitar canales de flujo preferencial y las condiciones de humedad de suelo heterogéneo.
10. germinación y trasplante de semillas
- Si utiliza controles, apartar los rhizoboxes.
- Superficie-esterilizar semillas de maíz removiendo 1 minuto en el 5% de NaOCl, después enjuague bien en agua desionizada.
Nota: En este experimento, se utilizaron semillas de seis diferentes genotipos de maíz para investigar diferencias genotípicas en la plasticidad de la raíz. - Germinar semillas esterilizadas colocándolos sobre un tejido de laboratorio húmedo (por ejemplo, Kimwipe) adentro platos de Petri y cubriendo con otro paño húmedo. No debe ser cualquier agua estancada. Lugar de Petri en un lugar oscuro para 48\u201272 h hasta que la radícula apenas comienza a emerger.
- Use una espátula estrecha para cavar un agujero de 2,5 cm de profundidad en el centro de cada rhizobox. Trasplante de una semilla germinada en el agujero, asegurando que la radícula está orientada directamente hacia abajo.
Nota: Si la radícula es inclinarse hacia cualquiera de los dos patch, la comparación de las tasas de crecimiento de la raíz será parcial. - Rastrear la ubicación de la semilla en la transparencia.
- Cubra la semilla y el agua con hasta 50 mL de agua desionizada.
11. las plantas crecimiento
- Cultivar plantas durante 25 días (o tan largo como se desee), manteniendo 60% CPM durante el período de crecimiento. Controlar el crecimiento de las raíces rastreando las raíces.
- Pesar cada caja todos los días de 3\u20124 y agua hasta que quede de 5 g de su peso ideal. Interrumpir el riego de la rhizoboxes cuatro días antes de la cosecha para facilitar la separación de los paneles. Eliminar las malas hierbas a mano con frecuencia para que sólo las raíces de plantas de interés están presentes.
- Traza las raíces visibles cada días de 3\u20124 con un marcador permanente colores claramente distinguibles para cada día de seguimiento.
Nota: Marcadores de diferente diámetro pueden utilizarse para las raíces primarias y laterales, si lo desea. Puede ser útil para definir criterios para el seguimiento de raíz desde el principio puesto que un grado de subjetividad está implicado, especialmente si varios investigadores serán raíces de seguimiento o si las raíces de diferentes órdenes o diámetro deben ser distinguidos con diferentes marcadores. En este experimento, la precisión de rastreo raíces visibles en sólo un lado de la caja fue probada por remontar las raíces visibles en ambos lados y comparar la longitud de la raíz total medido en las transparencias escaneadas a la longitud de la raíz total medido por lavado y exploración de las raíces. La correlación entre la longitud de la raíz rastreado y analizado fue significativa si se utilizan sólo la transparencia posterior o ambas transparencias. Por lo tanto, es posible trazar sólo raíces visibles en la parte trasera.
12. cosecha de brotes y obtención de muestras de suelo y raíz para análisis
- Pone la rhizobox primera plana y quitar todos los tornillos.
- Las muestras de brotes de la cosecha. Clip de brotes en la base, enjuague la suciedad con agua desionizada y secar a 60 ° C. Dispara a moler con un mortero y una maja para pasar a través de un tamiz de 2 mm y pesan submuestras en cápsulas de estaño para análisis de isótopos (ver sección 14).
- Utilizando la transparencia como guía, corte alrededor de los parches de tratamiento y control con una maquinilla de afeitar. Utilice una espátula o cuchara para sacar las raíces y el suelo de rizosfera adherentes en la respectiva bolsa de tratamiento o control.
Nota: Mientras que muchos métodos existen para suelo de rizosfera separado el suelo bajo la influencia de la planta raíces15y la rizosfera se puede considerar un gradiente en lugar de una zona estrictamente delineada16, este método sigue el utilizado definición de suelo que se adhiere para sembrar raíces después de sacudir el17. - Primicia las restantes raíces y suelo en la tercera bolsa.
- Pasar el tratamiento, control y a granel las muestras a través de un tamiz de 2 mm para separar raíces de sustrato, quitar cualquier raíces visibles o fragmentos > 1 cm de longitud con una pinza fina. Mantener estas muestras separadas entre sí por un total de tres raíces y tres muestras de sustrato.
13. validación de registros de encabezamientos secundarios y estimación de tasas de crecimiento relativo de la raíz
- Tratamiento, control, la exploración y a granel las muestras y calcular la longitud de la raíz.
- Trabajando con una muestra a la vez, enjuague las raíces con cuidado con agua desionizada para eliminar cualquier sustrato restante. Colocar las muestras en una bandeja clara para que las raíces no se solapan.
- Análisis de muestras usando un escáner compatible con software de análisis de la raíz (por ejemplo, WinRhizo). Asegúrese de que el software está calibrado para distinguir confiablemente las raíces desde el fondo de la imagen.
- Utilice el software para medir la longitud de la raíz total y longitud de la raíz en las clases de interés (por ejemplo, < 0,2 mm, 0.2\u20120.4 mm, 0.4\u20120.8 mm, 0.8\u20121.6 mm, > 1,6 mm) de diámetro.
- Calcular raíz longitud densidad (RLD) para tratamiento y control de los parches y para cada rhizobox en su conjunto.
- Calcular el volumen de tratamiento y control de revisiones multiplicando el área de trazado en cada transparencia (ver paso 8.1) por 0,635 cm, la profundidad de la caja. Utilizar esos volúmenes para calcular la densidad de longitud de raíz en el tratamiento y control parches usando la longitud total de la raíz en cada parche (ver paso 13.1.3).
- Calcular el volumen de sustrato en cada rhizobox multiplicando el área trazado sobre la transparencia (ver paso 8.1) de 0,635 cm. calcular RLD en cuanto a los parches de tratamiento y control.
- Calcular el volumen de tratamiento y control de revisiones multiplicando el área de trazado en cada transparencia (ver paso 8.1) por 0,635 cm, la profundidad de la caja. Utilizar esos volúmenes para calcular la densidad de longitud de raíz en el tratamiento y control parches usando la longitud total de la raíz en cada parche (ver paso 13.1.3).
- Validar la raíz seguimiento método mediante la comparación de sistemas de la raíz explorados y localizar imágenes.
- Analizar cada transparencia y calcular la longitud total de la raíz utilizando el software. Guardar la imagen escaneada para el crecimiento de los cálculos del tipo.
- Suma las medidas de longitud de raíz total de tratamiento, control y a granel las muestras para cada caja (ver paso 13.1.3).
- Prueba las medidas digitalizadas y trazadas de longitud total de la raíz para ver si la correlación es estadísticamente significativa.
Nota: Si es así, se valida el método de trazado, y las tasas de crecimiento relativo se pueden calcular en cada momento. Si no, sólo los datos de escaneado radicular proporcionan una indicación exacta del crecimiento de la raíz. Este sería el caso si la metodología de seguimiento era incompatible o si las raíces no eran igualmente accesibles para todos los genotipos, por ejemplo.
- Si se validó el método de rastreo, calcular las tasas de crecimiento relativo de la raíz para cada rhizobox.
- Utilizar el software de análisis de raíz calibrado para distinguir entre los colores de trazo elegido para medir la longitud total de la raíz en el tratamiento, control y a granel las muestras en cada momento. Calcular la longitud de la raíz total acumulada en cada momento.
- Calcular las siguientes tasas de crecimiento relativo de la raíz (raízRGR) para cada rhizobox, así en cuanto a tratamiento y revisiones de control para cada tiempo intervalo t1-t2 .
Nota: Aquí L1 es la longitud de la raíz total del parche (suma acumulada de 11.3) en los días de1 t después del transplante (DAT) y L2es la longitud de la raíz total del parche en t2 DAT.
14. Análisis de 15N repartir entre raíz, brote y tratamiento de las muestras de suelo
- Raíces seco a 60 ° C, peso de biomasa y la rutina para pasar por un tamiz de 2 mm.
- Seco de submuestras de suelo, tratamiento a 60 º C.
- Paquete de raíces y el tratamiento en cápsulas de estaño como con los brotes.
Nota: Peso de la muestra Ideal por cápsula debe calcularse por separado para brotes, raíces y suelo basado en la estimada relación C/N del material para alcanzar la cantidad objetivo de N total para el análisis. Póngase en contacto con el centro de isótopos estables donde las muestras deben ser presentados para obtener más información. Para este experimento, la muestra peso calculadora proporcionada por la instalación de isótopo estable de UC Davis e instrucciones de preparación de la muestra fueron seguido18.
PRECAUCIÓN: Tenga especial cuidado al mezclar muestras uniformemente antes del envasado en cápsulas y preparar varias cápsulas por muestra. Si las muestras no se mezclan uniformemente, recuperación aparente de 15N puede superar la cantidad originalmente presente. - Analizar N total, δ15 y 15N de contenidos de cada sesión, la raíz y la muestra de suelo de tratamiento.
Nota: En este experimento, planta muestras fueron analizadas mediante combustión con un analizador elemental de PDZ Europa ANCA-GSL interconectado a un espectrómetro de masas PDZ Europa 20-20 isótopo cociente en la UC Davis estable isótopo (UCD SIF). Las muestras de suelo fueron analizadas con un analizador elemental Elementar Vario EL cubo interconectado a un PDZ Europa 20-20 isótopo cociente espectrómetro de masas en el SIF UCD. - Calcular la cantidad de 15N obtenida de la etiqueta en planta dispara y las muestras de raíz.
- En primer lugar, calcular la cantidad de 15N exceso atmosférica 15N en cada piscina, 15P *:
donde 15P es el contenido de 15N en % atómico de la piscina de interés. - En segundo lugar, calcular la cantidad de 15N exceso atmosférica 15N en la etiqueta, 15L *:
donde 15L es el contenido de 15N en % atómico de la fuente N etiquetada. - En tercer lugar, calcular la cantidad de N total en cada grupo, Np:
donde mp es la masa de la piscina (por ejemplo, total disparar seca o biomasa de la raíz) y el %p es el porcentaje de N de esa piscina. - Finalmente, utilizar los resultados de 14.5.1\u201214.5.3 en el Ndff ecuación19 para calcular la cantidad de N obtenida de la etiqueta, Nl:
Nota: La ecuación de Ndff se utiliza para determinar la cantidad de N de una fuente marcada que es recuperada por las plantas. Asume que no hay discriminación isotópica se produce durante la absorción de N por la planta y es generalmente válida para N fuentes enriquecido ~1\u201210%19.
- En primer lugar, calcular la cantidad de 15N exceso atmosférica 15N en cada piscina, 15P *:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las raíces crecieron preferentemente contra la parte trasera de la caja, según lo previsto. Longitud de la raíz trazado total en la parte posterior de la caja varió de 400 a 1.956 cm, en comparación con 93 758 cm en la parte frontal de la caja. Se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson pares entre la longitud de la raíz explorada y longitud de la raíz trazado en la parte frontal de la caja, la parte posterior de la caja, y la suma de la parte delantera y trasera se utiliza para determinar si rastrear con precisión refleja la longitud de la raíz total (n = 23, como la planta en una caja de muerto durante el experimento). Longitud de la raíz total escaneada fue correlaciona significativamente con la longitud de la raíz trazado en la parte posterior de la caja (figura 5A, p = 0.0059), frontal de la caja (figura 5B, p = 0.022) y suma de trasero y delantero (figura 5, p = 0.0036). localización sólo la parte posterior de la caja es así validado como una medida representativa del crecimiento de las raíces y reducir a la mitad el tiempo necesario para las raíces de la traza. Sin embargo, cabe señalar que trazo capta sólo el 21.6-54,6% de la longitud total de la raíz. Mientras que las raíces crecen preferentemente contra la superficie de la rhizobox, raíces laterales finas en particular pueden no ser visibles para el seguimiento. Seguimiento es adecuado para las comparaciones relativas de longitud de la raíz con el tiempo, especialmente temprano en el desarrollo, pero son preferible si el objetivo es cuantificar con precisión la longitud de raíz total recolección y análisis de sistemas de la raíz.
Figura 5: correlaciones entre trazado y analizan datos de longitud de raíz. A) trazo de longitud de la raíz se correlaciona significativamente con la longitud de la raíz explorada cuando sólo la parte delantera de la caja se trazó. B) rastrear las raíces de la parte posterior de la caja, donde la mayoría de las raíces era visible, mejorando el valor de R2 de la regresión contra la longitud de la raíz explorada trazar la parte delantera de la caja; otra vez, la correlación fue significativa. C) el método más preciso es raíces de traza en ambos lados de la caja, como se muestra por el mayor valor de R2 de los tres métodos y analizados de la correlación significativa con longitud de la raíz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las tasas de crecimiento de la raíz con el tiempo fueron similares entre cajas, como se muestra por laderas consistente al trazar el logaritmo natural de la longitud total de la raíz contra el tiempo (figura 6). Mientras que leve variabilidad es de esperarse, las tasas de crecimiento consistentes indican que condiciones experimentales eran uniformes para todas las cajas. Dramáticamente diferentes pistas indicarían que las plantas crecían a ritmos diferentes, lo que sugiere la necesidad de comprobar las diferencias en variables tales como temperatura o humedad.
Figura 6: tasas de crecimiento de la raíz con el tiempo. Pendientes similares de raíz longitud vs tiempo entre rhizoboxes indican que las raíces crecieron a tasas iguales. Pendientes no uniforme podrían indicar que las condiciones experimentales varían entre rhizoboxes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Raíces de todos los genotipos maíz proliferaron en parches que contienen residuo de la cosecha de cubierta etiquetado N 15. ANOVA de dos vías con el tipo de parche y genotipo como fijo factores (n = 23) reveló que la densidad de longitud de raíz era superior en tratamiento de parches de control utilizando datos escaneados de la raíz (Figura 7a, p = 0.013) así como datos de trazado de la raíz (figura 7b, p = 0,005). RLD no fue significativamente diferente entre genotipos en cualquiera de los casos.
Figura 7: densidad por genotipo y raíz de datos tipo de longitud de la raíz un) Datos escaneados de la raíz demostraron que todos los genotipos (A-F) proliferaron en la revisión de tratamiento (T), y las diferencias genotípicas no fueron significativas. b) cosecha y datos escaneados raíz confirmaron el efecto significativo de residuos de leguminosa y no genotipo (A-F), densidad de longitud de parches de la raíz. Letras A-F representan seis diferentes genotipos y barras de error representan el error estándar. C: control; T: tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Diámetro de la raíz puede utilizarse para hacer inferencias sobre la función de la raíz y el volumen de ventas. Raíces finas están más probables que las raíces laterales que se desarrollan rápidamente y proliferan en respuesta a puntos de acceso de recursos, mientras que las más grandes raíces gruesas son más propensos a ser raíces axiales duraderas, lento para responder. Sistemas de la raíz explorados se analizaron la proporción de raíces en cada clase de diámetro: < 0,2 mm, 0.2-0.4 mm, 0.4-0.8 mm, 0,8-1,6 mm, y > 1,6 mm y cada clase de tamaño se evaluó las diferencias genotípicas. Genotipos con más raíces finas en parches de tratamiento pueden indicar una respuesta más eficaz de la proliferación. ANOVA unidireccional con genotipo como un factor fijo (n = 23) reveló que genotipos no difieren en la longitud de la raíz en cada clase de tamaño para el sistema raíz general (figura 8a), parches de tratamiento (figura 8b), ni control de parches (figura 8 c). La mayoría de las raíces fueron raíces finas (< 0,2 mm).
Figura 8: proporción de raíces en las clases de diverso diámetro por genotipo y lugar. un) en cada rhizobox (sin parches de tratamiento y control), la mayoría de las raíces eran fina (< 0,2 mm de diámetro). Genotipos no difirió en la proporción de raíces en cada clase de diámetro. b) en parches de tratamiento, la longitud de la raíz por clase de tamaño además disminuyó con el aumento de diámetro a través de genotipos. c) Control de parches fueron caracterizados por los mismos patrones. Letras A-F representan seis diferentes genotipos y barras de error representan el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Etiqueta N fue superior en sesión de las muestras de raíz a través de genotipos según ANOVA de dos vías con el tipo de muestra y genotipo como factores fijos (n = 23, figura 9), que muestra que 77-81% de N tomado de la revisión del tratamiento fue desplazado desde las raíces a brotes durante el experimento. ANOVA unidireccional (n = 23) demostró que δ15N de raíz y disparar muestras no variaron por genotipo.
Figura 9: nitrógeno Obtenido de residuos de leguminosa en raíces y brotes en la cosecha. Todos los genotipos fueron igualmente efectivos en tomar N del parche que contiene residuos de leguminosa marcado con N 15. La mayoría de N tomado de la revisión fue desplazada desde las raíces a brotes. Letras A-F representan seis diferentes genotipos y barras de error representan el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El rhizoboxes que se describe en este protocolo se puede utilizar para responder preguntas variadas en raíces y rizosfera y han encontrado diversas aplicaciones en otros lugares10,20,21,22,23 , 24 , 25. otros investigadores han captado imágenes de Time-lapse de rhizoboxes21,25,26, algunos usando automatizado sistemas22,27. Estos métodos deben utilizarse para análisis cuantitativos de longitud de la raíz y la arquitectura no es posible con métodos de rastreo. Rhizoboxes también se han utilizado para visualizar las comunidades microbianas con técnicas fluorescentes en situ del hibridación (pescado) y micro-autorradiografía (MAR)21,22, o capturar espacialmente explícito modelos de recursos de agua y nutrientes con la proyección de imagen RGB24 o actividad de la enzima extracelular con zymography11,30. El rhizoboxes presentados aquí son únicos de diseños anteriores en que son relativamente grandes, lo que es posible estudiar especies con sistemas de raíz extensos; tienen un diseño simple del solo-compartimiento; uso de materiales disponibles, de bajo costo; y están especialmente diseñados para el estudio de manchas localizadas. La versatilidad de este protocolo de rhizobox podría permitir a modificar para requisitos particulares para una gama de otras aplicaciones en las interacciones de la rizosfera y la plasticidad de la raíz. Otros nutrientes podrían sustituir nitrógeno en los parches. Nutrientes inmóviles como el fósforo se someta a menor lixiviación, es probable que lo que un buen ajuste para este enfoque. Las rhizoboxes también se adaptan bien a las comparaciones del suelo de rizosfera y a granel, como la zona de influencia de la raíz (una definición larga para la rizosfera15) puede ser más claramente delineada que en estudios de pot y separada del suelo a granel con una maquinilla de afeitar en la cosecha. Adaptación de este método para estudiar procesos de rizosfera se abre una nueva amplia gama de maneras de extender el protocolo, incluyendo estudio de ambas interacciones abióticas y bióticas23.
El método rhizobox presentado aquí es adecuado para medirlas diferencias relativas entre genotipos o especies en crecimiento de la raíz en desarrollo, caracterizando las relaciones entre rasgos de raíz y explorar los efectos de las características del suelo en el crecimiento de la raíz . Ciertos pasos del Protocolo de son particularmente importantes porque afectan factores con influencia desproporcionada en el crecimiento de la raíz: humedad, densidad y pendiente del suelo. Uniformemente e igualmente a través de riego cajas es fundamental dada la influencia de la humedad del suelo sobre la raíz crecimiento patrones1,31. Experiencias piloto demostraron que a través de los emisores del goteo de agua se convirtió en distribuido uniformemente después de 24-48 h por capilaridad; sin embargo, variabilidad entre emisores en el volumen de agua descargada durante un período de riego dado era demasiado alta para recomendar este método utilizando nuestro arreglo. Riego de mano lenta y uniformemente fue la mejor de las técnicas de prueba, pero otros métodos de riego son ciertamente posibles. Riego para un peso previamente calculado asegura que todas las cajas mantienen el mismo contenido de humedad de suelo, evitando la variabilidad en el crecimiento de las raíces debido a estrés de agua32. El peso del vacío rhizoboxes puede variar significativamente, por lo que es importante calcular los pesos ideales para cajas individuales.
Como con la humedad, incluso densidad del sustrato a lo largo de la rhizobox el establecimiento es fundamental para medir las respuestas de proliferación de raíz. Las raíces crecen más extensivamente en suelo menos densa33 y compactación puede crear canales para el flujo preferencial de agua, afectando más recursos distribución y raíz crecimiento patrones34. Secado y tamizado de suelo de campo, fondo mezcla de arena y tierra y mover el embudo hacia adelante y hacia atrás lentamente y uniformemente ayudan a crear una matriz homogénea de crecimiento de la raíz.
Un número de componentes dentro de esta experiencia dependerá de las preguntas de investigación de interés, así como las especies de tipo y de la planta de suelo utilizadas en el estudio. La proporción de arena al suelo deba ser ajustado para los suelos de textura diferente, para asegurar que el sustrato se humedece uniformemente sin agrupar. Experiencias piloto que demostraron un suelo 1:1 (v/v): mezcla de arena fue superior a las mezclas 1:2 o 1:3 para el suelo utilizado en este experimento, un franco arenoso muy fino. Las dimensiones de la rhizoboxes y la duración del experimento pueden ajustarse dependiendo de la pregunta de investigación, características de la raíz y especies vegetales de interés. El maíz es una especie de planta crecimiento relativamente rápido; por lo tanto seleccionamos dimensiones rhizobox más grandes en comparación con otros estudios de rhizobox20,35 para proporcionar un volumen suficiente de suelo que permite el experimento continuará por la duración óptima como las plantas se convierten cada vez más rootbound con el tiempo. Por último, el ajuste de modelos estadísticos para el crecimiento de la raíz visible y trazado debe ser determinado para cada estudio y especies de interés, tal vez con experiencias piloto. Crecimiento de la raíz visible puede seguir una curva de saturación en vez de un modelo lineal25,36, y la pendiente de la regresión de visibles en las raíces cosechadas varía por especie de planta21.
Las raíces tienen una tendencia inherente a perseguir la gravedad y evitar luz37, pero debe tenerse cuidado para asegurar que el gravitropismo y evitar la luz no sesgar datos de crecimiento de raíz. Si bancos de invernadero están inclinadas ligeramente, por ejemplo, raíces crecerán hacia abajo de la pendiente en lugar de responder a parches de nutrientes. Del mismo modo, gradientes de luz en el invernadero podrían causar cambios en el crecimiento del brote y las raíces que crecen preferentemente en un lado si las rhizoboxes no se mantienen completamente a oscuras. Los casos de privación de luz presentados en el protocolo son un medio eficaz de reducir incidentes ligeros, pero otros métodos tales como el rhizoboxes de embalaje en papel de aluminio también puede funcionar.
El método no destructivo rhizobox presentado facilita el rastreo de las raíces en situ sobre tiempo38 y puede ser implementado por un estudiante graduado con conocimientos básicos de herramientas eléctricas. Como tal, ofrece ventajas sobre los destructivos métodos de captura como shovelomics6, que son los más adecuados al estudio de arquitectura de la raíz madura pero no permiten mediciones repetidas de un mismo sistema de la raíz con el tiempo y MRI o radiografía computada tomografía39,40, que permite imágenes de alta calidad de las interacciones de la raíz-sustrato, pero requiere equipo costoso. Sin embargo, no es sin limitaciones. Construcción de la rhizoboxes puede ser muy lento y que factores tales como humedad, densidad aparente, pendiente y la luz son tan uniformes como sea posible, como se describe anteriormente, es no trivial. No obstante, dado el suficiente tiempo y atención al detalle, el rhizoboxes entregar resultados confiables y puede ser reutilizadas para muchos experimentos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer los revisores anónimos por sus comentarios, como J.C. Cahill y Tan Bao de orientación inicial en el desarrollo del Protocolo de rhizobox. La financiación fue proporcionada por la Fundación para la alimentación y la agricultura investigación, nosotros Departamento de Agricultura (USDA) Instituto Nacional de alimentación y la agricultura, agrícola estación experimental proyecto CA-D-PLS-2332-H, a A.G. y por la UC Davis Departamento de la planta Ciencias a través de una beca para J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.27 cm diameter PVC pipe | JM Eagle | 530048 | 305 cm per box, cut into lengths as specified in the protocol |
| PVC side elbows | Lasco | 315498 | 2 per box |
| PVC 90-degree elbows | Charlotte | PVC 02300 0600 | 4 per box |
| PVC T joints | Charlotte | PVC 02402 0600 | 4 per box |
| Extruded acrylic panes | TAP Plastics | N/A | 2 per box, 0.64 cm thick x 40.5 cm wide x 61 cm long |
| HDPE spacers (sides) | TAP Plastics | N/A | 2 per box, 0.64 cm thick x 2.5 cm wide x 57 cm long |
| HDPE spacers (bottom) | TAP Plastics | N/A | 1 per box, 0.64 cm thick x 2.5 cm wide x 40.5 cm long |
| HDPE spacers (patch) | TAP Plastics | N/A | 2 per box, 0.64 cm thick x 3.8 cm wide x 28 cm long |
| Polyester batting | Fairfield | #A-X90 | 2.5 cm x 40.5 cm strip per box |
| 20-thread screws | N/A | N/A | 3.2 cm long, 0.64 cm diameter |
| Washers | N/A | N/A | 0.64 cm internal diameter |
| Hex nuts | N/A | N/A | sized to fit the screws |
| Light deprivation fabric | Americover, Inc. | Bold 8WB26.5 | 1 piece 95 cm wide and 69 cm long per box |
| Sand | Quikrete | No. 1113 | |
| Field soil | N/A | N/A | |
| Transparencies for tracing | FXN | FXNT1319100S | One per side of the box to be traced |
References
- Hodge, A. Roots: The Acquisition of Water and Nutrients from the Heterogeneous Soil Environment. Progress in Botany 71. , 307-337 (2010).
- Grossman, J. D., Rice, K. J. Evolution of root plasticity responses to variation in soil nutrient distribution and concentration. Evolutionary Applications. 5 (8), 850-857 (2012).
- Melino, V. J., Fiene, G., Enju, A., Cai, J., Buchner, P., Heuer, S. Genetic diversity for root plasticity and nitrogen uptake in wheat seedlings. Functional plant biology. , Available from: http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201600101375 (2015).
- Zhang, H., Forde, B. G. An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture. Science. 279 (5349), 407-409 (1998).
- Hodge, A., Stewart, J., Robinson, D., Griffiths, B. S., Fitter, A. H. Competition between roots and soil micro-organisms for nutrients from nitrogen-rich patches of varying complexity. Journal of Ecology. 88 (1), 150-164 (2000).
- Trachsel, S., Kaeppler, S. M., Brown, K. M., Lynch, J. P. Shovelomics: high throughput phenotyping of maize (Zea mays L.) root architecture in the field. Plant and Soil. 341 (1-2), 75-87 (2011).
- Rogers, E. D., Monaenkova, D., Mijar, M., Nori, A., Goldman, D. I., Benfey, P. N. X-ray computed tomography reveals the response of root system architecture to soil texture. Plant Physiology. , (2016).
- Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Effect of mechanical constraint on nodal and seminal root system of maize plants. Comptes Rendus De L Academie Des Sciences Serie Iii-Sciences De La Vie-Life Sciences. 321 (1), 63-71 (1998).
- Lin, Y., Allen, H. E., Di Toro, D. M. Barley root hair growth and morphology in soil, sand, and water solution media and relationship with nickel toxicity. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (8), 2125-2133 (2016).
- Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
- Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
- Vollsnes, A. V., Futsaether, C. M., Bengough, A. G. Quantifying rhizosphere particle movement around mutant maize roots using time-lapse imaging and particle image velocimetry. European Journal of Soil Science. 61 (6), 926-939 (2010).
- Hewitt, E. J. Sand and Water Culture Methods Used in the Study of Plant Nutrition. , Commonwealth Bureau. London. (1966).
- Choudhary, M. I., Shalaby, A. A., Al-Omran, A. M. Water holding capacity and evaporation of calcareous soils as affected by four synthetic polymers. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 26 (13-14), 2205-2215 (1995).
- Bakker, P. A. H. M., Berendsen, R. L., Doornbos, R. F., Wintermans, P. C. A., Pieterse, C. M. J. The rhizosphere revisited: root microbiomics. Frontiers in Plant Science. 4, 2013 (2013).
- McNear, D. H. Jr The Rhizosphere - Roots, Soil, and Everything In Between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
- Ortas, I. Determination of the extent of rhizosphere soil. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 28 (19-20), 1767-1776 (1997).
- UC Davis Stable Isotope Facility. Carbon (13C) and Nitrogen (15N) Sample Preparation. , Available from: https://stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15nsamplepreparation.html (2018).
- Barraclough, D. 15N isotope dilution techniques to study soil nitrogen transformations and plant uptake. Fertilizer research. 42 (1-3), 185-192 (1995).
- Belter, P. R., Cahill, J. F. Disentangling root system responses to neighbours: identification of novel root behavioural strategies. AoB PLANTS. 7, (2015).
- Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Functional Plant Biology. 39 (11), 891-904 (2012).
- Adu, M. O., Yawson, D. O., Bennett, M. J., Broadley, M. R., Dupuy, L. X., White, P. J. A scanner-based rhizobox system enabling the quantification of root system development and response of Brassica rapa seedlings to external P availability. Plant Root. 11, 16-32 (2017).
- Neumann, G., George, T. S., Plassard, C. Strategies and methods for studying the rhizosphere-the plant science toolbox. Plant and Soil. 321 (1-2), 431-456 (2009).
- Bodner, G., Alsalem, M., Nakhforoosh, A., Arnold, T., Leitner, D. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (126), e56251-e56251 (2017).
- Kuchenbuch, R. O., Ingram, K. T. Image analysis for non-destructive and non-invasive quantification of root growth and soil water content in rhizotrons. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 165 (5), 573-581 (2002).
- Dresbøll, D. B., Thorup-Kristensen, K., McKenzie, B. M., Dupuy, L. X., Bengough, A. G. Timelapse scanning reveals spatial variation in tomato (Solanum lycopersicum L.) root elongation rates during partial waterlogging. Plant and Soil. 369 (1-2), 467-477 (2013).
- Wu, J., et al. RhizoChamber-Monitor: a robotic platform and software enabling characterization of root growth. Plant Methods. 14 (1), 44 (2018).
- Rogers, S. W., Moorman, T. B., Ong, S. K. Fluorescent In Situ Hybridization and Micro-autoradiography Applied to Ecophysiology in Soil. Soil Science Society of America Journal. 71 (2), 620-631 (2007).
- Eickhorst, T., Tippkötter, R. Detection of microorganisms in undisturbed soil by combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and micropedological methods. Soil Biology and Biochemistry. 40 (6), 1284-1293 (2008).
- Spohn, M., Kuzyakov, Y. Distribution of microbial- and root-derived phosphatase activities in the rhizosphere depending on P availability and C allocation - Coupling soil zymography with 14C imaging. Soil Biology and Biochemistry. 67, 106-113 (2013).
- Lv, G., Kang, Y., Li, L., Wan, S. Effect of irrigation methods on root development and profile soil water uptake in winter wheat. Irrigation Science. 28 (5), 387-398 (2010).
- Asseng, S., Ritchie, J. T., Smucker, A. J. M., Robertson, M. J. Root growth and water uptake during water deficit and recovering in wheat. Plant and Soil. 201 (2), 265-273 (1998).
- Hernandez-Ramirez, G., et al. Root Responses to Alterations in Macroporosity and Penetrability in a Silt Loam Soil. Soil Science Society of America Journal. 78 (4), 1392-1403 (2014).
- Zhang, Y. L., Wang, Y. S. Soil enzyme activities with greenhouse subsurface irrigation. Pedosphere. 16 (4), 512-518 (2006).
- Robinson, D., Hodge, A., Griffiths, B. S., Fitter, A. H. Plant root proliferation in nitrogen-rich patches confers competitive advantage. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 266 (1418), 431-435 (1999).
- Lobet, G., Draye, X. Novel scanning procedure enabling the vectorization of entire rhizotron-grown root systems. Plant Methods. 9, 1 (2013).
- Swarup, R., Wells, D. M., Bennett, M. J. Root Gravitropism. Plant Roots: The Hidden Half. , (2013).
- Smit, A. L., Bengough, A. G., Engels, C., van Noordwijk, M., Pellerin, S., van de Geijn, S. C. Root Methods: A Handbook. , Springer Science & Business Media. (2000).
- van Dusschoten, D., et al. Quantitative 3D Analysis of Plant Roots Growing in Soil Using Magnetic Resonance Imaging1[OPEN]. Plant Physiology. 170 (3), 1176-1188 (2016).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 17 (2015).
