Denne trinvise protokol indeholder en detaljeret beskrivelse af eksperimentel opsætning og dataanalyse til vurdering af inflammatoriske respons i hiPSC-ECs og analyse af leukocyt adhæsion under fysiologiske flow.
Endotelceller (ECs) er essentielle for reguleringen af inflammatoriske respons af enten begrænse eller lette leukocyt rekruttering i berørte væv via en vel karakteriseret kaskade af Pro selvklæbende receptorer, som er upregulated på den leukocyt celleoverfladen på den provokerende trigger. Inflammatoriske respons varierer mellem enkeltpersoner i befolkningen og den genetiske baggrund kan bidrage til disse forskelle. Menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) har vist at være en pålidelig kilde til ECs (hiPSC-ECs), der således repræsenterer en ubegrænset kilde til celler, der fange genetiske identitet og eventuelle genetiske varianter eller mutationer af donor. hiPSC-ECs kan derfor bruges til modellering af inflammatoriske respons i donor-specifikke celler. Inflammatoriske respons kan modelleres ved at bestemme leukocyt adhæsion til hiPSC-ECs under fysiologiske flow. Denne trinvise protokol indeholder en detaljeret beskrivelse af eksperimentel opsætning og dataanalyse til vurdering af inflammatoriske respons i hiPSC-ECs og analyse af leukocyt adhæsion under fysiologiske flow.
Inflammation spiller en central rolle i mange patologiske tilstande, herunder hjerte-kar- og neurodegenerative sygdomme, sepsis og bivirkninger svar (ADR). Endotelceller (ECs) spiller en vigtig rolle i reguleringen af inflammatoriske respons via induktion af Pro selvklæbende receptorer, som E-selectin, intercellulære vedhæftning molekyle-1 (ICAM-1) og vaskulære celle vedhæftning molekyle-1 (VCAM-1) på deres overflade 1 , 2. mikrovaskulære ECs i forskellige væv er kendt for at udstille heterogenitet i inflammatoriske respons3,4. Derudover kunne genetiske baggrund eller visse genetiske sygdomme medføre forskelle i inflammatoriske respons mellem enkeltpersoner; Det er derfor vigtigt at have adgang til ECs fra forskellige individer. For nylig, menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs)5, der kan udledes fra stort set enhver enkeltperson, viste sig at fungere som en pålidelig og vedvarende kilde til ECs6,7,8, 9. derfor, vurdering af inflammatoriske respons og leukocyt ansættelse i hiPSC-ECs er værdifuld, ikke kun for modellering af visse genetiske sygdomme, men også at give indikationer af indbyrdes individuelle variation og bruge som et redskab til personlig medicin i fremtiden.
Flow assays være et nyttigt redskab til at studere endotel-leukocyt interaktion. Fremskridt i mikrofluid enheder aktiverer reproduktion af fysiologiske væskestrøm betingelser med præcis styring af vaskulære bed-specifikke shear stress niveauer. Live imaging giver mulighed for overvågning af kaskade af begivenheder i leukocyt opsamling, rullende, kravle, vedhæftning og transmigration. Flere flow assays til at studere endotel-leukocyt interaktion er blevet udviklet, men de alle udnytte primære ECs10,11,12,13. Her vil vi beskrive detaljeret analyse til vurdering af human leukocyt adhæsion til hiPSC-ECs under fysiologiske flow. I denne procedure beskriver vi optimeret betingelserne for hiPSC-EF stimulation med pro-inflammatoriske stimuli, såsom tumor nekrose faktor alfa (TNFα), dissociation, såning i en mikrofluid chip med otte parallelle kanaler. Vi beskriver en trinvis protokol for perfusion af hiPSC-ECs med suspension af fluorescently mærket leukocytter i mikrofluid chips, live celle imaging og automatiseret optælling af vedhængende leukocytter.
Denne protokol er nyttige for vurderingen af inflammatoriske respons i hiPSC-ECs i stof screening, sygdom modellering og personlig regenerativ medicin.
Denne protokol beskriver karakterisering af hiPSC-EF behandling med pro-inflammatoriske stimuli, såsom TNFα, funktionel vurdering af leukocyt adhæsion til hiPSC-ECs i flow analyse ved hjælp af live imaging og automatiseret optælling af vedhængende leukocytter.
Overnight stimulation af hiPSC-ECs med TNFα resulterer i det aflange udseende, der typisk angiver en aktiveret pro-inflammatoriske fænotype i ECs. Stadiet optimering udtryk niveauer af E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 skal verificeres ved FACs7,8, og primære menneskelige umbilical vene ECs (HUVECs) er tilrådeligt at være medtaget som positive kontroller.
Optimal hiPSC-ECs dissociation og såning tæthed skal nås for at opnå en sammenflydende éncellelag uden at danne celle klumper og kanal træsko. Det er afgørende at genopslæmmes leukocytter lige før perfusion for at undgå celle nedbør og opretholde en konstant koncentration når boltpistoler hver kanal. Humant perifert blod leukocytter, monocytter og neutrofile kan bruges, eller etableret monocytic cellelinjer, såsom THP-1 eller HL-60 kan bruges som et alternativ.
Under montagen af opsætningen af mikrofluid og under flow-analysen er det afgørende at undgå luftbobler fra at blive fanget i mikrofluid rør og kanaler, som de kan resultere i detachement af hiPSC-ECs og/eller vedhængende leukocytter. Væske til væske grænseflade eller indarbejdelse af ekstra vask trin under udarbejdelsen af opsætningen af mikrofluid kunne bidrage til at undgå luftbobler.
Det er tilrådeligt, at protokollen er drevet af to operatører hvor man forbereder cellerne og for det andet forbereder mikrofluid system og flow assay. Dette sikrer, at ECs er forgyldt mikrofluid chips inden for en konstant tidsvindue inden forarbejdning og forbedrer nøjagtigheden og reproducerbarhed af resultaterne. Desuden giver dette også opsætning af blindet forsøg at undgå bias i resultaterne.
For vellykket celle opdagelse hos den automatiserede billedbehandling pipeline, er det vigtigt at erhverve billeder i fokus med en høj signal-støj-forhold og for at undgå autofluorescence af ikke-specifikke objekter, såsom celle klumper. Er minimal og maksimal grænserne for den typiske størrelse af vedhængende leukocytter, der skal identificeres korrekt specifikation af afgørende betydning. Man kan vurdere den typiske størrelse af leukocytter ved hjælp af en line måling værktøj i ImageJ. For eksempel, i vores analyse brugte vi den vifte af 9 – 15 pixel, hvilket svarer til den fysiske størrelse af 10.3 – 17,1 µm (figur 4 c). Når du bruger en forkert vifte, fx 3-15 pixel (3.4 – 17,1 µm), en enkelt leukocyt identificeres ikke som én celle, men snarere dens subpart er identificeret som separate objekter (figur 4D). Dette fører til falsk antallet af objekter kan identificeres.
Mange objekter af en lav intensitet og mindre areal end leukocytter kan påvises ved hjælp af metoden forudsat adaptive tærskel. Dette kan tage plads på grund af autofluorescence eller nogen andre uspecifikke fluorescerende signaler. Disse ikke-specifikke objekter, kan hvis deres område er lavere end den typiske område af en enkelt leukocyt, ikke desto mindre, filtreres ved at definere den minimalt accepterede areal (fig. 4 c).
Flow analysen beskrives her tillader direkte vurdering af leukocyt adhæsion til en EF-éncellelag, belyse samspillet mellem disse to celle typer, men tager ikke hensyn til andre celler typer, såsom pericytes, der er til stede i det vaskulære væg og måske også deltage i reguleringen af leukocyt ekstravasation15. Integrere en 3D kultur mikromiljø med andre celletyper kunne forbedre fysiologiske relevansen af systemet. På trods af disse begrænsninger giver flow analyse til vurdering af inflammatoriske respons beskrevet her et værdifuldt værktøj til grundlæggende karakterisering og sygdom modellering ansøgninger af hiPSC-ECs.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende de følgende tilskud: European Research Council (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Holland orgel-on-Chip initiativ, en NWO Gravitation projekt finansieret af Ministeriet for uddannelse, kultur og videnskab af regeringen i Nederlandene (024.003.001).
Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
Name | Company | Software version | Comments |
Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |