Este protocolo passo a passo fornece uma descrição detalhada da instalação experimental e análise de dados para a avaliação das respostas inflamatórias em hiPSC-ECs e a análise da adesão de leucócitos sob fluxo fisiológico.
Células endoteliais (ECs) são essenciais para a regulação de respostas inflamatórias por limitar ou facilitar o recrutamento de leucócitos nos tecidos afetados, através de uma cascata bem caracterizada de pro-adesivo receptores que são upregulated no superfície de pilha de leucócitos após o gatilho inflamatória. Respostas inflamatórias diferem entre os indivíduos na população e o fundo genético pode contribuir para essas diferenças. Células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) foram mostradas para ser uma fonte confiável de ECs (hiPSC-ECs), representando assim uma fonte ilimitada de células que captam a identidade genética e quaisquer variantes genéticas, ou mutações do doador. hiPSC-ECs, portanto, podem ser usados para modelagem de respostas inflamatórias em células específicas do doador. Respostas inflamatórias podem ser modeladas, determinando a adesão de leucócitos para o hiPSC-ECs sob fluxo fisiológico. Este protocolo passo a passo fornece uma descrição detalhada da instalação experimental e análise de dados para a avaliação das respostas inflamatórias em hiPSC-ECs e a análise da adesão de leucócitos sob fluxo fisiológico.
Inflamação desempenha um papel central em muitas condições patológicas, incluindo cardiovasculares e as doenças neurodegenerativas, sepse e respostas adversas da droga (ADRs). Células endoteliais (ECs) desempenham um papel essencial na regulação da resposta inflamatória através da indução de pro-adesivo receptores, tais como a molécula de adesão intercelular, E-selectina-1 (ICAM-1) e células vasculares adesão molécula-1 (VCAM-1) na sua superfície 1 , 2. ECs microvascular em tecidos diferentes são conhecidos por apresentar heterogeneidade nas respostas inflamatórias3,4. Além disso, o fundo genético ou certas condições genéticas podem resultar em respostas inflamatórias as diferenças entre os indivíduos; Portanto, é importante ter acesso para ECs de indivíduos diferentes. Mais recentemente, humanas pluripotentes induzidas as células-tronco (hiPSCs)5, que pode ser derivado de virtualmente qualquer indivíduo, foram mostrados para servir como uma fonte confiável e renovável de ECs6,7,8, 9. por conseguinte, a avaliação das respostas inflamatórias e recrutamento de leucócitos em hiPSC-ECs é valiosa, não só para a modelagem de certas doenças genéticas, mas também para fornecer indicações de variabilidade inter-individual e usar como uma ferramenta para medicina personalizada no futuro.
Ensaios de fluxo fornecem uma ferramenta útil para estudar a interação leucócito-endotélio. Avanços em dispositivos microfluídicos permitem a reprodução das condições de fluxo de fluido fisiológico com controle preciso dos níveis de tensão de cisalhamento vascular cama específicos. Imagem ao vivo permite o monitoramento da cascata de eventos de captura de leucócitos, rolando, rastejando, adesão e transmigração. Desenvolveram-se vários ensaios de fluxo para estudar a interação leucócito-endotélio, no entanto, todos eles utilizam primário ECs10,11,12,13. Aqui, nós descreveremos detalhadamente o ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos humanos para hiPSC-ECs sob fluxo fisiológico. Neste procedimento, descrevemos as condições otimizadas de estimulação hiPSC-CE com estímulos pró-inflamatórios, tais como o fator de necrose tumoral alfa (TNFa), dissociação, semeadura em um chip microfluidic com oito canais paralelos. Descrever um protocolo passo a passo para a perfusão de hiPSC-ECs com a suspensão dos leucócitos fluorescente etiquetadas em chips microfluídicos, vivemos a imagem latente da pilha e automatizado de contagem de leucócitos aderentes.
Este protocolo é útil para a avaliação das respostas inflamatórias em hiPSC-ECs na despistagem de drogas, modelagem de doença e medicina regenerativa personalizada.
Este protocolo descreve a caracterização de tratamento hiPSC-CE com estímulos pró-inflamatórios, tais como TNFa, avaliação funcional da adesão de leucócitos para hiPSC-ECs no ensaio de fluxo usando imagens ao vivo e automatizado de contagem de leucócitos aderentes.
Estimulação durante a noite de hiPSC-ECs com TNFa resulta na aparência alongada que normalmente indica um fenótipo pró-inflamatórias registrado em ECs. Durante a fase de otimização, expressão níveis de E-selectina, ICAM-1, VCAM-1 devem ser verificados pela FACs7,8e veia umbilical humana primária ECs (HX) são aconselháveis para ser incluído como controles positivos.
HiPSC-ECs ideal dissociação e densidade de semeadura devem ser alcançados para atingir uma monocamada confluente sem formar aglomerados de células e obstruções do canal. É essencial para re-suspender o direito de leucócitos antes da perfusão, a fim de evitar a precipitação de célula e manter uma concentração constante, quando a análise de cada canal. Leucócitos do sangue periférico humano, como monócitos e neutrófilos podem ser usados, ou estabeleceram linhas de célula monocítica, tais como THP-1 ou HL-60 pode ser usado como uma alternativa.
Durante a Assembleia da instalação do microfluídicos e durante o ensaio de fluxo, é extremamente importante para evitar bolhas de ar sendo presos no microfluidic tubos e canais que podem resultar no destacamento de hiPSC-ECs e/ou leucócitos aderentes. Interface líquido-para-líquido ou incorporação das etapas adicionais de lavagem durante a preparação da instalação do microfluidic poderia ajudar a evitar bolhas de ar.
É aconselhável que o protocolo é dirigido por dois operadores onde um prepara as células e o segundo prepara-se o ensaio de fluxo e sistema de microfluidic. Isso garante que a ECs são banhados em lascas microfluidic dentro de uma janela de tempo constante antes da transformação e melhora a precisão e a reprodutibilidade dos resultados. Além disso, isso também permite a criação de experimentos cegos evitar distorções nos resultados.
Para detecção de célula bem sucedido com a imagem automatizada pipeline de processamento, é importante para adquirir imagens em foco com uma alta relação sinal-ruído e evitar autofluorescência de objetos não-específicos, tais como aglomerados de células. De importância crucial é a correta especificação dos limites mínimos e máximas do tamanho típico de leucócitos aderentes que precisam ser identificados. Pode-se estimar o tamanho típico de leucócitos usando uma ferramenta de medição da linha no ImageJ. Por exemplo, em nossa análise, usamos a escala de 9 – 15 pixels que corresponde ao tamanho físico do µm 10.3-17,1 (Figura 4). Ao usar uma escala errada, por exemplo, 3 – 15 pixels (3.4 – 17,1 µm), um único dos leucócitos é identificado não como uma célula, mas prefiro suas subpartes são identificados como objetos separados (Figura 4). Isso leva ao número falso de objetos a ser identificado.
Muitos objetos de uma baixa intensidade e menor área de superfície de leucócitos podem ser detectados usando o método fornecido limiarização adaptativa. Isto pode demorar lugar devido a autofluorescência ou quaisquer outros sinais fluorescentes não-específica. No entanto, esses objetos não-específica, se sua área é menor do que a área típica de um único dos leucócitos, podem ser filtrados definindo a área de superfície minimamente aceita (Figura 4).
O ensaio de fluxo descrito aqui permite a avaliação direta da adesão de leucócitos de uma monocamada de CE, elucidar a interação entre estas duas células tipos, mas não leva em conta outras células, tais como pericitos que estão presentes na parede vascular e tipos podem também participar na regulação do extravasamento de leucócitos15. Integrar um microambiente cultura 3D com outros tipos de células poderia melhorar a relevância fisiológica do sistema. Apesar dessas limitações, o ensaio de fluxo para a avaliação das respostas inflamatórias descrito aqui fornece uma ferramenta valiosa para a doença e caracterização básica aplicações de modelagem de hiPSC-ECs.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostaria de reconhecer as seguintes subvenções: Conselho Europeu de investigação (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Holanda órgão-em-microplaqueta iniciativa, um projeto de gravitação NWO financiado pelo Ministério da educação, cultura e ciência do governo dos Países Baixos (024.003.001).
Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
Name | Company | Software version | Comments |
Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |