Este protocolo paso a paso proporciona una descripción detallada de la disposición experimental y análisis de datos para la evaluación de las respuestas inflamatorias en hiPSC-ECs y el análisis de la adherencia del leucocito bajo flujo fisiológico.
Las células endoteliales (ECs) son esenciales para la regulación de las respuestas inflamatorias por limitar o facilitar el reclutamiento de leucocitos en tejidos afectados por una cascada bien caracterizado de receptores Pro-adhesivos que alza en el superficie de la célula del leucocito a la activación inflamatoria. Las respuestas inflamatorias difieren entre individuos de la población y el fondo genético puede contribuir a estas diferencias. Las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) han demostrado ser una fuente confiable de ECs (hiPSC-ECs), lo que representa una fuente ilimitada de células que captan la identidad genética y cualquier variantes genéticas o mutaciones del donante. hiPSC ECs por lo tanto pueden utilizarse para el modelado de las respuestas inflamatorias en células de donantes específicos. Las respuestas inflamatorias se pueden modelar mediante la determinación de adherencia del leucocito a las ECs hiPSC bajo flujo fisiológico. Este protocolo paso a paso proporciona una descripción detallada de la disposición experimental y análisis de datos para la evaluación de las respuestas inflamatorias en hiPSC-ECs y el análisis de la adherencia del leucocito bajo flujo fisiológico.
La inflamación juega un papel fundamental en muchas condiciones patológicas, incluyendo cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas, sepsis y respuestas adversas (ADRs). Las células endoteliales (ECs) juegan un papel esencial en la regulación de las respuestas inflamatorias a través de la inducción de receptores Pro-adhesivos, como la molécula 1 de adhesión E-selectina, intercelular (ICAM-1) y vasculares de la célula molécula 1 de adhesión (VCAM-1) en su superficie 1 , 2. ECs microvascular en diferentes tejidos se sabe que presentan heterogeneidad en las respuestas inflamatorias3,4. Además, antecedentes genéticos o ciertas condiciones genéticas podrían dar lugar a las diferencias en las respuestas inflamatorias entre individuos; por lo tanto es importante tener acceso a ECs de diferentes individuos. Más recientemente, humanas pluripotentes inducidas células (hiPSCs)5, que se pueden derivar de cualquier individuo, fueron demostrados para servir como una fuente confiable y renovable de ECs6,7,8, 9. por lo tanto, la evaluación de las respuestas inflamatorias y reclutamiento leucocitario en hiPSC-ECs es valiosa, no sólo para el modelado de ciertos trastornos genéticos, sino también para proporcionar indicios de variabilidad interindividual y utilizar como una herramienta para medicina personalizada en el futuro.
Análisis de flujo proporcionan una herramienta útil para estudiar la interacción leucocito endotelial. Los avances en dispositivos microfluídicos permiten la reproducción de las condiciones de flujo de fluidos fisiológicos con un control preciso de los niveles de tensión de esquileo de específicos de la cama vascular. En proyección de imagen permite el control de la cascada de eventos de captura del leucocito, rodar, gatear, adhesión y transmigración. Se han desarrollado varios ensayos de flujo al estudio de la interacción de leucocitos endoteliales, sin embargo, todos ellos utilizan primaria ECs10,11,12,13. Aquí describiremos en detalle el análisis para la evaluación de la adherencia del leucocito humano a hiPSC-ECs bajo flujo fisiológico. En este procedimiento, se describen condiciones optimizadas de estimulación CE hiPSC con estímulos proinflamatorios, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), disociación, siembra en un chip de microfluidos con ocho canales paralelos. Describir un protocolo paso a paso para la perfusión de ECs hiPSC con la suspensión de leucocitos fluorescencia etiquetadas en chips de microfluídica, vivimos la proyección de imagen de la célula y automatizado de recuento de leucocitos adherentes.
Este protocolo es útil para la evaluación de las respuestas inflamatorias en hiPSC-ECs en detección de drogas, modelos de enfermedad y medicina regenerativa personalizada.
Este protocolo describe la caracterización del tratamiento CE hiPSC con estímulos proinflamatorios, como el TNFα, evaluación funcional de la adherencia del leucocito a hiPSC-ECs en el análisis del flujo usando proyección de imagen de vivo y automatizado de conteo de los leucocitos adherentes.
La estimulación de hiPSC-ECs con TNFα resultados en el aspecto alargado que normalmente indica un fenotipo pro-inflamatorias activado en ECs. Durante la etapa de optimización, expresión niveles de l-selectina, ICAM-1, VCAM-1 deben ser verificados por FACs7,8y la vena umbilical humana primaria ECs (HUVECs) son recomendables para ser incluidos como controles positivos.
Disociación de óptima hiPSC-ECs y densidad de siembra deben alcanzarse para lograr una monocapa confluente sin formar grumos de células y obstrucciones del canal. Es fundamental para volver a suspender el derecho de leucocitos antes de perfusión para evitar la precipitación de la célula y mantener una concentración constante cuando ensayando cada canal. Leucocitos de sangre periférica, tales como monocitos y neutrófilos pueden ser utilizados, o líneas de célula monocítica, establecieron como THP-1 o HL-60 podría ser utilizado como una alternativa.
Durante el montaje de la instalación de microfluidos y durante el análisis del flujo, es fundamental para evitar burbujas de aire de quedar atrapado en la tubería de microfluidos y canales ya que en el desprendimiento de hiPSC ECs o leucocitos adherentes. Interfaz de líquido a líquido o incorporación de los pasos de lavado adicional durante la preparación de la configuración de microfluidos podría ayudar a prevenir las burbujas de aire.
Es recomendable que el protocolo está a cargo de dos operadores donde uno prepara las células y el segundo prepara el ensayo de flujo y sistema de microfluidos. Esto asegura que el ECs se platean en chips de microfluídica dentro de un intervalo de tiempo constante antes del procesamiento y mejora la precisión y la reproducibilidad de los resultados. Además, también permite establecer experimentos ciegos para evitar sesgos en los resultados.
Para la detección de acertado de la célula con la canalización de proceso de imagen automatizada, es importante para adquirir imágenes en foco con un alto cociente signal-to-noise y evitar autofluorescence de objetos inespecíficos, tales como grupos de células. De crucial importancia es la correcta especificación de los límites mínimos y máximos del tamaño típico de los leucocitos adherentes que necesitan ser identificadas. Uno puede estimar el tamaño típico de los leucocitos en una herramienta de medición de línea de ImageJ. Por ejemplo, en nuestro análisis, hemos utilizado el rango de 9 – 15 píxeles que se corresponde con el tamaño físico de 10.3 – 17,1 μm (figura 4). Cuando se utiliza un rango de mal, por ejemplo, 3 – 15 pixeles (3.4-17,1 μm), se identifica un solo leucocito no como una célula, sino más bien sus subpartes se identifican como objetos separados (figura 4). Esto conduce al falso número de objetos a ser identificado.
Muchos objetos de baja intensidad y menor área de superficie de leucocitos pueden detectarse mediante el método de umbralización adaptativa proporcionada. Esto puede tomar lugar por autofluorescencia o cualquier otras señales fluorescentes no específicos. Sin embargo, estos objetos no específica, si su área es menor que el área típica de un leucocito solo, pueden ser filtrados por definir la superficie mínimamente aceptada (figura 4).
El análisis de flujo se describe aquí permite la evaluación directa de la adherencia del leucocito a una monocapa de CE, dilucidar la interacción de estas dos células tipos, pero no toma en cuenta otros tipos, como pericitos que se presentan en la pared vascular y puede también participar en la regulación de la extravasación de leucocitos15. Integración de un microambiente cultura 3D con otros tipos de células podría mejorar la importancia fisiológica del sistema. A pesar de estas limitaciones, el análisis del flujo para la evaluación de las respuestas inflamatorias descrito aquí proporciona una valiosa herramienta para enfermedad y caracterización básica aplicaciones de modelado de hiPSC-ECs.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean reconocer las siguientes becas: Consejo Europeo de investigación (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Países Bajos iniciativa de órgano-on-Chip, un proyecto de nuevo orden mundial gravitación financiado por el Ministerio de educación, cultura y ciencia del gobierno de los países bajos (024.003.001).
Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
Name | Company | Software version | Comments |
Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |