Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door high-throughput DNA sequentiebepaling (ChIP-seq) van bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Dit protocol is geschikt voor zowel mapping histone modificaties en genoom-brede lokalisatie van niet-Histon proteïnen van belang in vivoonderzoeken.
Meest cellulaire processen worden gereguleerd door transcriptionele modulatie van de specifiek gen programma’s. Dergelijke modulatie wordt bereikt door de gecombineerde acties van een breed scala van transcriptiefactoren (TFs) en cofactoren bemiddelen transcriptionele activering of repressie via veranderingen in de structuur van de chromatine. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een nuttige moleculaire biologie benadering van toewijzing histone modificaties en profiling transcriptie factoren/cofactoren binden aan DNA, waardoor een momentopname van de dynamische nucleaire veranderingen tijdens verschillende biologische processen.
Studeren transcriptionele verordening in adipeus weefsel, monsters die zijn afgeleid uit in vitro celculturen van vereeuwigd of primaire cellijnen zijn vaak favoriet in ChIP tests vanwege de overvloed van de grondstof en verminderde biologische variabiliteit. Deze modellen zijn echter een beperkte opname van de staat van de werkelijke chromatine in levende organismen. Dus, is er behoefte aan een kritische geoptimaliseerde protocollen op te voeren ChIP adipeus weefselmonsters afgeleid van diermodellen.
Hier beschrijven we een protocol voor efficiënte ChIP-seq van zowel histone modificaties en niet-Histon eiwitten in bruin vetweefsel (BAT) geïsoleerd van een muis. Het protocol is geoptimaliseerd voor het onderzoeken van genoom-brede lokalisatie van proteïnen van belang en epigenetische markers in de BAT, oftewel een morfologisch en fysiologisch verschillend weefsel onder vet depots.
Terwijl het witte vetweefsel (WAT) is gespecialiseerd voor energieopslag, verdrijft bruin vetweefsel (BAT) energie in de vorm van warmte vanwege zijn vermogen om te zetten van koolhydraten en lipiden in thermische energie via mitochondriaal ontkoppelingseiwit1. Vanwege deze gespecialiseerde functie is het depot BAT vereist voor onderhoud van lichaamstemperatuur in fysiologische omstandigheden en in reactie op koude blootstelling. Terwijl gen expressie veranderingen tijdens BAT differentiatie en op thermogene stress zijn uitvoerig bestudeerd in vivo en in vitro, zijn de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze veranderingen meestal ontleed in vereeuwigd cellijnen en primaire pre-adipocytes, met uitzondering van verschillende in vivo onderzoek2,3,4,5.
Regulering van de specifiek gen expressie programma’s via transcriptionele verordening wordt bereikt door gecoördineerde veranderingen in chromatine structuur via verschillende transcriptie factoren en factoren samen acties. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een waardevolle moleculaire biologie-aanpak voor onderzoek naar de aanwerving van deze factoren tot DNA en profilering van de bijbehorende wijzigingen in de chromatine landschap. Sleutelfactoren voor het welslagen van ChIP experimenten omvatten optimalisaties van crosslinking voorwaarden en schuintrekken consistentie van de chromatine gedurende verschillende monsters, beschikbaarheid van voldoende grondstof, en, vooral, de kwaliteit van de antilichamen. Bij het uitvoeren van ChIP uit hele weefsels, het is ook belangrijk om te overwegen de heterogeniteit van de monsters en optimaliseren van het protocol ter verbetering van de efficiëntie van isolatie van de kernen, met de laatste wordt een bijzonder gevoelige stap bij het werken met vetweefsel moet het verhoogde vetgehalte. In feite, moleculaire isolatie technieken uit hele obesitas depots worden bemoeilijkt door de aanwezigheid van hoge niveaus van triglyceriden, en protocollen moeten worden geoptimaliseerd om de verhoging van het bedrag van de chromatine isolatie. Ten slotte, als high-throughput sequencing wordt uitgevoerd na ChIP-DNA isolatie, de sequencing diepte is van cruciaal belang voor het bepalen van het aantal pieken die vol vertrouwen worden gedetecteerd.
Hier verwijzen we naar de arbeidsvoorwaarden en de algemene richtsnoeren voor de ChIP-seq experimenten aanbevolen door de ENCODE en modENCODE consortia6 voor beste praktijken, en richten we ons op een stapsgewijze beschrijving van een protocol dat is geoptimaliseerd voor ChIP-seq van BAT. Het beschreven protocol zorgt voor efficiënte isolatie van de chromatine van vetweefsel sequentiebepaling van het genoom-brede uitvoeren voor DNA-bindende factoren met welomschreven pieken evenals Histon merken met meer diffuus signalen.
Het protocol beschreven hier vertegenwoordigt een waardevol instrument voor het uitvoeren van ChIP lymfkliertest weefsel, specifiek geoptimaliseerd voor bruin vetweefsel. Een van de grotere uitdagingen bij het uitvoeren van ChIP van weefsel is een voldoende aantal cellen herstellen tijdens de bereiding. Scheren van de VLEERMUIS met behulp van een weefsel homogenizer mixer in combinatie met RVS kralen in plaats van een canonieke glas stamper aanzienlijk vermindert het aantal cellen verloren wegens ongebroken weefsel. Bove…
Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
Stainless Steel Beads 3.2mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
1.5 ml Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
HiSeq 2000 | Illumina |