Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering av 3D hvit fettvev struktur med hele-mount flekker

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58683
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 3, 4, 1,2,5
1Translational Medicine Program, The Hospital for Sick Children, 2Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 3Neurosciences & Mental Health Program, The Hospital for Sick Children, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, Smart-Aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 5Banting and Best Diabetes Centre, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Fokus for studien er å vise hele-mount immunostai- og visualisering teknikken som en ideell metode for 3D-bildebehandling av fettvev arkitektur og cellular komponenten.

Abstract

Fettvev er et viktig metabolsk organ med høy plastisitet og svarer til miljømessige stimuli og næringsstoffer status. Som sådan, er ulike teknikker utviklet for å studere morfologi og biologi av fettvev. Men er konvensjonelle visualisering metoder begrenset til å studere vevet i 2D deler, unnlater å fange 3D arkitektur hele orgel. Her presenterer vi hele-mount flekker, en immunohistochemistry metode som beholder intakt fettvev morfologi med minimal behandlingstrinnene. Dermed opprettholdes konstruksjoner av adipocytter og andre cellulære komponenter uten forvrengning, oppnå mest representative 3D-visualisering av vev. I tillegg kan hele-mount flekker kombineres med avstamning sporing metoder for å bestemme cellen skjebne beslutninger. Denne teknikken har imidlertid noen begrensninger til å gi nøyaktig informasjon om dypere deler av fettvev. For å overkomme denne begrensningen, kan hele-mount flekker videre kombineres med vev clearing teknikker for å fjerne opaqueness av vev og tillater fullstendig oversikt over hele fettvev anatomi bruker lys arks fluorescerende mikroskopi. Derfor kan en høyere oppløsning og mer nøyaktig gjengivelse av fettvev strukturer hentes med kombinasjonen av disse teknikkene.

Introduction

Fettvev er et viktig organ for energilagring og er preget av dynamisk ombygging og nesten ubegrenset utvidelse1. I tillegg til energi homeostase spiller fettvev også en viktig rolle i hormon sekresjonen over 50 endotelial å modulere hele kroppen metabolsk funksjon2. Fettvev har en variert arkitektur består av forskjellige celletyper inkludert eldre adipocytter, fibroblaster, endotelceller, immunceller og adipocyte stamfar celler3. Nyere studier har vist at fedme og andre metabolsk dysfunksjon kan betydelig endre fettvev funksjon og dens microenvironment, som inkluderer men er ikke begrenset til utvidelse av adipocytter, infiltrasjon av inflammatoriske celler (f.eks makrofager), og vaskulær dysfunksjon3.

Konvensjonelle morfologiske teknikker som histology og og kryosnitt vise flere begrensninger i å studere adipose biologi som lange kjemisk behandling skritt, som kan føre til vev krymping og struktur forvrengning3, 4. Videre er disse 2D teknikkene ikke nok å observere intercellulære interaksjoner utøves av ulike celletyper, som delene innhentet er begrenset til mindre regioner av hele vev3. Forhold til konvensjonelle metoder for fluorescerende bildebehandling, hele-mount flekker ikke krever flere invasiv trinn, som innebygging, skjæring og dehydrering; Dermed unngår dette problemet minskende antistoff spesifisitet. Som sådan, er det en enkel og effektiv metode for bildebehandling fettvev, med bedre bevaring av adipocyte morfologi og generelle fettvev struktur5. Derfor hele-mount flekker som en rask og rimelig immunolabeling teknikk var etablert fettvev 3D arkitektur1,6,7,8.

Men til tross for bevaring av fettvev morfologi med bruk av hele-mount flekker er denne teknikken fremdeles ikke kan visualisere indre strukturer under lipid overflaten av vev. Flere nyere studier9,10 har etablert vev clearing teknikker kombinert med hele-mount immunolabeling1,6 å gi omfattende 3D-visualisering i fettvev. Spesielt var tett nevrale og blodkar nettverk visualisert i nyere studier9,10,11,12 med 3D-volum imaging. Faktisk er studere nevrale og vaskulær plastisitet av fettvev under ulike fysiologiske forhold viktig å studere sin biologi. Immunolabeling-aktivert tredimensjonale imaging av løsemiddel klarert organer (iDISCO +) vev clearing er en prosess består av metanol forbehandling, immunolabeling, og clearing av vev opaqueness med organisk kjemiske reagenser diklormetan (DCM ) og dibenzyl Eter (DBE)13,14. Ved å gjøre fettvev helt gjennomsiktig, kan en mer nøyaktig gjengivelse av anatomi i vevet som blodkar og nevrale fibre fås9,10. IDISCO + har fordeler i at det er kompatibelt med forskjellige antistoffer og fluorescerende journalister11,14, og det har demonstrert suksess i flere organer og selv embryoes14. Men er den viktigste begrensningen en lang incubation periode, der 18 til 20 dager kreves for å fullføre hele eksperimentet.

Et annet viktig program for hele-mount flekker er visualisering av cellen skjebne i kombinasjon med en slektslinje sporing system. Avstamning sporing er merking av et bestemt gen/indikator i en celle som kan sendes videre til alle datter celler og er bevart over tid15. Som sådan, er det et kraftig verktøy som kan brukes til å avgjøre skjebnen til en celle avkom15. Siden 1990 grobunn-LoxP rekombinant systemet har blitt en kraftig metode for avstamning sporing i levende organismer15. Når en mus linje som uttrykker grobunn, en DNA recombinase enzym, er krysset med en annen mus linje uttrykke reporter som er til en loxP-STOP-loxP sekvens, er reporter protein uttrykt15.

For hele-mount flekker, er bruk av fluorescerende multicolor journalister egnet for imaging av fettvev fordi det gir minimale forstyrrelser med intracellulære aktiviteter adipocyte16. Men flekken tradisjonelle journalister vanligvis cytoplasma, gjør det vanskelig å spore slektslinje hvit adipocytter, som har begrenset cytoplasmatiske innhold17. Du løser dette problemet, er bruken av membran-bundet fluorescerende tdTomato/membran eGFP (mT/mG) reporter markør et ideelt verktøy. Membran målrettede tdTomato uttrykkes i grobunn-negativ celler18. På grobunn excision oppstår bytte til uttrykk for membran målrettede eGFP, gjør denne reporteren egnet for sporing slektslinje adipocyte progenitors17,18 (Supplerende figur 1).

Formålet med denne utredningen er å gi en detaljert protokoll for hele-mount flekker og viser hvordan den kan kombineres med andre teknikker å studere utviklingen og fysiologi av fettvev. To eksempler på programmer som er beskrevet i denne protokollen er bruken med 1) multicolor reporter musen linjer å identifisere ulike opprinnelsen til adipocytter og 2) vev fjerne for å ytterligere visualisere den nevrale arborization i hvit fettvev (WAT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle dyr protokoller ble godkjent av dyr omsorg komiteen av The Center for Phenogenomics (TCP) likedannet standarder for kanadiske Rådet for Animal Care. Mus ble opprettholdt på 12-h lys/mørke sykluser og leveres med gratis tilgang til vann og mat. 7 mnd gamle C57BL/6J mannlige mus ble brukt i hele-mount flekker eksperimentet.

Merk: Avsnitt 1 til 2 er i kronologisk rekkefølge, del 3 er et valgfritt trinn rett etter avsnitt 1. Del 4 kan utføres for å analysere adipocyte størrelse og blodkar tetthet etter ferdigstillelse av inndeling 2.

1. materialet forberedelse og vev isolasjon

  1. Forberede frisk 1% paraformaldehyde (PFA) fortynnet i 1 x fosfat bufret saltløsning (PBS) i vev fiksering. Forberede 0,3% ikke-ionisert surfactant fortynnet i 1 x PBS (heretter kalt PBS-0.3T) for påfølgende vev vaske trinnene.
    Merk: For hvert vev, forberede ca 1,5 mL 1% PFA å sikre fullstendig nedsenking. Fiksering volum kan økes eller senkes avhengig vev.
    Advarsel: Dette trinnet er farlige, som PFA er korrosiv og giftige. Bruk personlig verneutstyr (f.eks nitrilhansker, laboratoriefrakk, sko, vernebriller) og håndtak i avtrekksvifte.
  2. Avlive dyrene etter en godkjent prosedyre (f.eks, cervical forvridning og/eller karbondioksid kvelning). Uten forsinkelse, dissekere ønskede fettvev depoter (f.eks, inguinal hvit fettvev eller perigonadal hvit fettvev)18.
  3. Med disseksjon saks, kuttet vev på en 100 x 15 mm2 Petriskål i stykker ca 0,5-1 cm i størrelse og fordype seg i microcentrifuge rør fylt med 1% PFA. Hold på is.

2. hele-mount farging av hvite fettvev

  1. Etter disseksjon er fullført, flytte vevsprøver i 1% PFA fra isen romtemperatur (RT) 1t, og deretter overføre vev til en 12 - eller 24-godt celle kultur plate for raskere vask.
  2. Vask vev med PBS-0.3T, 3 ganger i 5 min hvert RT på en shaker skråstilt på 22 °, med 20-25 vippes per min som hastighet.
    Merk: Bruk dette tilt og hastighet for alle etterfølgende trinnene med bruk av en shaker.
    Merk: Hvis bruker en multicolor reporter musen linje som mT/mG og ekstra antistoff flekker er ikke nødvendig, vevet er klar for mikroskopi etter trinn 2.2.
  3. Legg til 0,5-1 mL blokkerer buffer (5% dyr serum fortynnet i PBS-0.3T). Sette platen på shaker og Inkuber 1t i RT.
  4. Sug opp den blokkerende løsningen og legge primære antistoffer fortynnet i PBS-0.3T med 1% dyr serum.
  5. Sted plate på en shaker på 4 ° C over natten.
  6. Neste dag, vaske vev med PBS-0.3T 3 ganger for 5 minutter hver i RT.
  7. Bruk passende sekundære antistoffer fortynnet i PBS-0.3T. Legg til 0,5-1 mL sekundære antistoff løsninger i hver brønn. Pakk platen i aluminiumsfolie og ruge det på en shaker i 1 time ved RT.
    Merk: Fortynne sekundære antistoffer i mørket for å forhindre photobleaching.
  8. Sekundær antistoff inkubasjon vaskes med PBS-0.3T to ganger i 5 min, hvert RT. Image prøvene hvis en nøytral lipid flekk ikke er ønskelig. Hvis visualisering av lipid dråper er nødvendig benytter den nøytrale lipid flekken, vask med 1 x PBS (uten ikke-ioniske surfactant) to ganger, i 5 min.
  9. Etter vask trinnene, ruge med nøytral lipid flekken fortynnet med fortynningsfaktoren for 1:1500 i 1 x PBS i 30 min i RT. Vev er nå klar for mikroskopi. Fremtidige bildebehandling, kan vev bli lagret i denne løsningen i 4 ° C.
    Merk: Imaging kvaliteten reduseres over tid; Derfor er den beste tiden for bildebehandling innen 1 eller 2 dager.
  10. Ved hjelp av pinsett, Legg vevet flatt på en 24 x 60 mm² glass dekkglassvæske og plassere den på en invertert AC confocal laser mikroskop systemet.
  11. Hvis farging av kjerner med DAPI er ønskelig, kan du legge til 1-2 dråper av montering medium som inneholder DAPI helt Senk vevet og forhindre at det tørker.
  12. For å få bilder av hele-mount farget vev på flere fokal fly, utføre Z-stabler på 100-150 μm i dybden med 4-6 μm trinn-størrelse på ønsket forstørrelse.

3. vev Clearing og Immunolabeling bruker iDISCO +

Merk: Denne protokollen er basert på tidligere publiserte prosedyrer9,10,19.

  1. Fiksering og metanol pre-behandling
    1. Inkuber vev i 4% PFA fortynnet i 1 x PBS på 4° C over natten i 2 mL microcentrifuge rør.
      Merk: La vev i 2 mL rør for alle følgende behandlinger til bildebehandling.
    2. Neste dag, vaske vev i 1 x PBS tre ganger i 1 time hver på en shaker på RT.
      Merk: Dette trinnet kan være en pause poeng å forlate prøven overnatting på RT eller 4 ° C.
    3. Tørke vev på RT i 20%, 40%, 60% og 80% metanol, deretter 1t hver. Tørke i 100% metanol i RT for 1 time, deretter overføre vev til frisk 100% metanol og ruge ved 4 C i 1 time.
      Merk: Fortynne metanol i destillert vann. Under metanol inkubasjonen er det ikke nødvendig å sette eksempler på en shaker så lenge vevsprøver er nedsenket.
      Advarsel: Dette trinnet er farlige, metanol er giftig. Det er meget brannfarlig over åpen flamme. Bruk personlig verneutstyr (f.eks nitrilhansker, laboratoriefrakk vernebriller) og håndtere i avtrekksvifte. Lagre metanol tenningen og en brennbar sikkerhet regjering.
    4. Bleach vev med 5% hydrogen peroxide (H2O2, 1-volum av 30% H2O2 fortynnet i 5 mengder 100% metanol) natten på 4 ° C.
      FORSIKTIG: 30% Hydrogenperoksid er veldig farlig på huden og øyekontakt. Bruk personlig verneutstyr (f.eks nitrilhansker, laboratoriefrakk vernebriller) og håndtere i avtrekksvifte.
    5. Rehydrate vev på RT i 80%, 60%, 40% og 20% metanol og 1 x PBS, deretter 1 time hver.
    6. Vask med 0,2% ikke-ionisert surfactant fortynnet i 1 x PBS to ganger, 1 h hver på en shaker på RT.
  2. Immunolabeling
    Merk: Fyll opp 2 mL rør som inneholder vevet til toppen av røret med løsningen i hvert trinn for å hindre vev oksidasjon snarest immunolabeling begynner, før tømming er fullført.
    1. Permeabilize vev av rugende dem i en løsning av 1 x PBS, 0,2% ikke-ionisert surfactant, 20% dimethyl sulfoxide (DMSO) og 0,3 M glysin på 37 ° C på en inkubert tabletop orbital shaker i 2 dager.
      Merk: Den maksimale inkubasjonstiden tiden for 37 ° C permeabilization trinn er 2 dager.
    2. Blokkere vev i en løsning av 1 x PBS, 0,2% ikke-ionisert surfactant, 10% DMSO, 5% esel serum og 1% Fc blokk på 37 ° C på en inkubert tabletop orbital shaker i 2 dager.
      Merk: Den maksimale inkubasjonstiden tiden for blokkering trinn er 2 dager.
    3. Inkuber vev i primære antistoffer rundt i en løsning av 1 x PBS, 0,2% polysorbat 20, 10 µg/mL heparin, 5% DMSO og 5% esel serum på 37 ° C på en inkubert tabletop orbital shaker i 4 dager.
    4. Vask med 1 x PBS, 0,2% polysorbat 20 og 10 µg/mL heparin på en shaker på RT fem ganger, hver 1t.
      Merk: Dette trinnet kan være en pause poeng å la prøver over natten i RT.
    5. Inkuber vev med sekundær antistoff i en løsning av 1 x PBS, 0,2% polysorbat 20, 10 µg/mL heparin og 5% esel serum på 37 ° C på en tabletop orbital shaker i 4 dager.
      Merk: Fra trinn 3.2.5, alle prøver må være pakket med aluminiumsfolie å hindre photobleaching sekundære antistoff.
    6. Vask vev i en løsning av 1 x PBS, 0,2% polysorbat 20 og 10 µg/mL heparin på en shaker i RT fem ganger, 2 h hver.
      Merk: Dette trinnet kan være en pause poeng å la prøvene natten RT.
  3. Vev clearing av hvite fettvev og volum bildebehandling
    1. Tørke vev finnes i 2 mL rør incubating inne 20%, 40%, 60% og 80% metanol, deretter hver i 1 time ved RT. Deretter tørke eksemplene i 100% metanol to ganger på RT.
      Merk: Dette trinnet kan være en pause poeng å forlate prøver i 100% metanol overnatting på RT.
    2. Inkuber vev med en blanding av 2 mengder DCM 1 volum av metanol for 3t på RT på en shaker.
      Merk: DCM er flyktige. Kontroller at rørene er tett forseglet for å hindre fordampning.
      Advarsel: Dette trinnet er farlig. DCM er giftig ved innånding. Langvarig eksponering kan forårsake kjemiske forbrenninger. Bruk personlig verneutstyr (f.eks nitrilhansker, laboratoriefrakk, sko, vernebriller). Bruk avtrekksvifte.
    3. Inkuber vev i 100% DCM to ganger, i 15 min hver på en shaker på RT.
    4. Inkuber 100% DBE i RT til bildebehandling og for eksempel lagring. Før bildebehandling, invertere rør flere ganger for å blande løsninger.
      Merk: Fylle rør med DBE å hindre oksidasjon, som kan føre til mislykket vev clearing. Ikke riste rør under DBE inkubasjon.
      Advarsel: Dette trinnet er farlig. DBE er giftig. Det kan forårsake irritasjon i øynene og huden. Bruk personlig verneutstyr (f.eks nitrilhansker, laboratoriefrakk vernebriller) og håndtere i avtrekksvifte.
    5. Bilde av hele Vevsprøve med lys mikroskop som tilsvarer brytningsindeks av organisk løsemiddel DBE. Utføre Z-stabling ønsket forstørrelse og trinn-størrelse for hele vevet.

4. eksempler på dataanalyse fra hele-mount farget vev bilder ImageJ

Merk: Se https://imageJ.nih.gov/ij/download.html for nedlasting og installasjon instruksjoner.

  1. Kvantifisering av blodkar (utfyllende figur 2)
    1. Importere de lagrede bildene av bare kanalen med blod fartøy immunostaining på ImageJ.
      Merk: Bilder for kvantifisering bør være konsekvent flekker prosedyre og bilde oppkjøpet tilstand. Identiske reagenser bør brukes. Eksponeringstid, bør intensitet og forstørrelse også være tilsvarende i bildebehandling prosessen20.
    2. Konvertere image fargen til svart-hvitt for blod fartøy tetthet kvantifisering. Gjør fanen "Bilde" , velg "Juster" , deretter alternativet "farge terskelen" . I "terskelen farge" vise, velg "Mørk bakgrunn"20 og velg "B & W" under "terskelen farge".
    3. For å måle andelen området av blod fartøy signal bakgrunn, velger du kategorien "Analysere" , deretter kommandoen "analysere partikler" . Under visningen av "analysert partikler", velg "klare resultater" og "Oppsummer" . Klikk "OK".
    4. Kopier og lim inn verdien for prosent området under kategorien Sammendrag i et regneark for analyse. Prosentandelen av området angir blodkar tetthet. Gjenta trinn 4.3.1–4.3.4 for hvert enkelt bilde.
  2. Kvantifisering av adipocyte størrelse21 (utfyllende Figur 3)
    1. Importere den lagrede bilder av adipocytter på ImageJ.
    2. Hvis du vil angi størrelsen på bildet, måle lengden av skalaen i piksler av sporing en linje til skala med en kjent distanse på bildet ved hjelp av lineær markeringsverktøyet. Velg "Angi skala" kategorien "Analysere" . Avstanden mellom linjen som ble sporet før beregnes automatisk i piksler.
    3. "Angi skala" Vis-boksen vises. Angi kjent distanse og måleenhet. Velg "Global" bruke skalaen innstillingen for alle importerte bilder og klikk "OK".
    4. Velg området som metoden for måling, under fanen "Analysere" Velg "Angi mål" . Det vises en liste over forskjellige alternativer for målinger. Velg alternativet "Området" og klikk "OK".
    5. Med Frihånd markeringsverktøyet, spore omkretsen av hver adipocyte rundt. Under fanen "Analysere" , velg "Tiltak (Ctrl + M)" , og området av adipocyte vises. Gjenta denne fremgangsmåten for andre adipocytter i bildet.
      Merk: For å sikre nøyaktighet i målingene, kan du bruke flere bilder for kvantifisering.
    6. Kopier og lim området målene til et regneark for ytterligere dataanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På grunn av skjørhet av fettvev, kan metoder som involverer flere behandlingstrinnene og snitting føre til skjemmende fettvev morfologi3 (figur 1A). Men kan hele-mount flekker beholde morfologi av adipocytter, sikrer nøyaktig tolkning av resultater (figur 1B).

Over fiksering av fettvev fører til bindemiddel-indusert autofluorescence. Som vist i figur 2A, overlappe grønne og røde kanaler flekker for tyrosin hydroksylase (TH) og PECAM-1 signaler, henholdsvis i identiske områder av vev, som angir at autofluorescence kan ha oppstått på grunn av over fiksering i PFA for 3 dager. Derimot figur 2B viser et representativt bilde av hele-mount flekk når riktig fiksering utføres, signalet for TH flekker forekommer i forskjellige områder i forhold til PECAM-1 signal, demonstrere at signalet ikke er autofluorescence og er faktisk et positivt signal.

Hele-mount flekker er en viktig visualiseringsverktøy for grobunn-loxP-baserte avstamning sporing av adipocytter15, med mT/mG er ideelle reporter systemet18. Ng2, en markør for adipocyte stamfar celle befolkningen, er en plasma membran proteoglycan. I dette systemet celler Ng2-Cre-positiv uttrykke m-GFP, mens m-tomat uttrykkes i Ng2-Cre-negativ celler (Figur 3).

Fettvev er et utrolig dynamisk orgel, utvider og krymper under forskjellige fysiologiske forhold og krav20. Imaging hele-mount farget fettvev tillater kvantifisering imorphological endringer under forskjellige eksperimentelle forhold. Spesielt er fettvev svært Stangeriaceae, er formidling metabolske homeostase på raske endringer i energi nivå1. For eksempel C57BL/6J mus som gjennomgå 24 h faste viser betydelig mindre adipocyte størrelse (Figur 4), som angir lipolyse, og en trend i utvidede blodårer kompakthet sammenlignet med kontinuerlig matet mus (figur 5). ImageJ programvare ble benyttet for å kvantifisere størrelsen på adipocytter og blodkar tetthet, som beskrevet ovenfor.

Vev fjerne er en relativt ny teknikk utviklet for å fjerne opaqueness av fettvev tillate visualisering dypt inne i vev volum9,10 (figur 6). Hele-mount flekker på innskuddet IWAT bruke AC confocal mikroskopi bare viste sparsom sympatisk gir, siden nervefibre under overflaten av vevet ikke kan bli visualisert (figur 7A). Imidlertid kan tette nevrale arborization observert etter vev clearing og immunolabeling med bruk av iDISCO + samt bruk av lys arks fluorescerende mikroskopi (LSFM) (figur 7B).

Figure 1
Figur 1: sammenligning av fettvev morfologi med konvensjonelle morfologiske teknikker og hele-mount flekker teknikk. (A) H & E farget fettvev på en parafin-embedded delen (venstre), med svart pilspisser som angir forvrengt regioner i adipocytter. Lektiner (karbohydrater bindende protein, hvite piler) fluorescerende farge injeksjon, immunofluorescent flekker F4/80 (macrophage markør, gul pilspisser) og DAPI kjerner farging av fettvev på cryosection (til høyre). (B) hvit fettvev visualisering bruker hele-mount flekker trinn-størrelse på 5 μm. Totalt Z stabel dybden fanget er rundt 100 μm. Adipocyte lipid dråper var farget med nøytral lipid flekker (grå), og blodkar var farget med PECAM-1. Bildet ble tatt med mikroskopi trinn-størrelse på 5 μm for Z-stabling (rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: visualisering av nevrale fibre og blodkar bruker hele-mount farget fettvev. (A) representant bilder mikroskopiske av uønskede resultater fra hele-mount farget PWAT på grunn av over fiksering i PFA for 3 dager. Overlappende signaler er angitt med hvite pilspisser. (B) representant mikroskopiske bilder av et positivt resultat fra hele-mount farget IWAT fra kontroll musen. Bildene ble tatt på 100 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Avstamning sporing bruke mT/mG system i fettvev. Representant bilder grobunn-positive (mG) og grobunn-negativ (mT) celler i IWAT av en Ng2-grobunn; mT/mG musen. Bildene ble tatt på 200 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: visualisering og måling av adipocyte størrelse. (A) representant bilder av adipocytter i PWAT matet og 24-timers fasted C57BL/6J mus med nøytral lipid flekker. Bildene ble tatt på 200 x forstørrelse. (B) Adipocyte størrelse sammenligning mellom matet og 24-h fasted C57BL/6J mus benytter ImageJ programvare. Verdiene uttrykkes som betyr ± SEM; 2-tailed unpaired Student t-test; p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: visualisering og kvantifisering av blod fartøy. (A) representant bilder av blodkar i matet og 24-timers fasted C57BL/6J mus ved hjelp av PECAM-1 antistoff. (B) sammenligning av blod fartøy mellom matet og 24-timers fastet C57BL/6J mus benytter ImageJ programvare. Verdiene uttrykkes som betyr ± SEM; 2-tailed unpaired Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Clearing av fettvev med metoden iDISCO +. Før clearing er vevet ugjennomsiktig. Vev blir helt gjennomsiktig i slutten av vevet fjerne trinnene.

Figure 7
Figur 7: Hele-mount farget IWAT sammenlignet med vev klarert IWAT bruker iDISCO + metoden. (A) visualisering av nevrale fibre med TH antistoff (1:500) i hele-mount farget IWAT på 100 x forstørrelse med AC confocal mikroskopi trinn-størrelse på 5 μm. Totalt Z stabel dybden fanget er rundt 100 μm. (B) visualisering av nevrale fibre med TH antistoff (1:200) i hele-mount farget IWAT med iDISCO + protokollen på 1.6 X forstørrelse med LSFM med en trinn-størrelse 4 μm. Totalt Z stabel dybden fanget er rundt 8 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: skjematisk diagram for mT/mG avstamning sporing systemet. Et dobbelt fluorescerende system som benytter membran målrettede eGFP og membran målrettede tdTomato. Før grobunn rekombinasjon uttrykkes mT globalt. Når cellen uttrykker grobunn, mT kassetten er forbrukeravgift og mG uttrykkes permanent. pA representerer polyadenylation sekvenser etter stopp codon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: program av ImageJ programvare å kvantifisere prosent området av blod fartøy. (A) "Bilde" kommandoer og alternativer for å konvertere et bilde til en svart-hvitt-terskel farge. (B) Sammendrag måling av prosentandel av fartøyet kommandoen "Analysere partikler". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur 3: program av ImageJ programvare å kvantifisere adipocyte området. "Analysere" kategorien: "Angi skala" og "Measurement" kommandoer for å måle området i adipocyte(s). Resultatene viser området for hver adipocyte målt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om konvensjonelle teknikker som histology og cryosection fordeler for å observere intracellulær struktur, gir hele-mount flekker et annerledes perspektiv i fettvev forskning, som muliggjør 3D-visualisering av mobilnettet arkitekturen av minimalt prosesserte vev.

For å utføre hele-mount flekker, bør følgende forslag tas i betraktning. Forskjellige fettvev depoter kan gi ulike immunostai-resultater; dermed bør av fettvev depot brukes fastsettes først. For eksempel, er brun fettvev (BAT) tettere forhold til hvit fettvev (WAT) på grunn av mindre, multilocular adipocytter21. Dette økt tetthet av BAT gjør det vanskelig for antistoffer mot gjennomsyre gjennom vev. I tillegg er størrelsen på fettvev også avgjørende for riktig antistoff flekker, siden for store/tykk vev kan også føre til utilstrekkelig antistoff penetrasjon. Derfor når skaffe fettvev under dyr disseksjon, skal for perigonadal fettvev brukes, siden dette er den tynneste regionen og kan gi tilstrekkelig antistoff gjennomtrenging og konsekvente data. Alternativt, for tettere vev, bruk av en fluorescerende reporter musen linje, som mT/mG, kan tillate for bedre visualisering av merket av interesse, siden dette unngår problemet av utilstrekkelig antistoff penetrasjon. Deretter 1% PFA brukes for vev fiksering å bevare den naturlige fordelingen av proteiner og sikre vev permeabilization og antistoff penetrasjon22,23. Men kan over fiksering redusere antigen anerkjennelse og produsere autofluorescence24. Dette skyldes reaksjonen aldehyd grupper på PFA og andre aldehyd inneholder bindemiddel og vev komponenter, som skaper fluorescerende forbindelser24. For å unngå behovet for et antigen-henting skritt, er det anbefalt å la vev i et bindemiddel i bare en time ved romtemperatur og begynner de neste trinnene så snart fiksering er fullført7. Som mange andre immunolabeling teknikker er titrating antistoff konsentrasjonen et viktig trinn i feilsøkingen å sikre ønsket signal.

Det er faktisk flere begrensninger i hele-mount flekker til tross for den nevnte betydningen og fordeler. Hele-mount flekker har strenge krav om vev type og størrelse, fordi utilstrekkelig antistoff gjennomtrenging og ujevn flekker kan oppstå i tykkere vev som muskler og leveren. Også er hele-mount flekker ikke den mest nøyaktige fremstillingen av visse antistoffer som tyrosin hydroksylase (TH), en markør for det sympatiske nervesystemet, som dekningen er ofte maskert av tett lipid innhold i fettvev (figur 7). I tillegg utgjorde ujevn overflate fettvev også en utfordring for AC confocal imaging, siden signalene på forskjellige lag av fettvev ikke kan være lett fanget på et enkelt bilde. Derfor kvantifiseringen signal intensitet i profilen oppnådd fra hele-mount flekker avkastning inkonsekvente resultater for hele-nerve fiber arborization. For PWAT er vanligvis minst lipid-tett; Derfor kan bedre bilder fås fra dette området. Men om dette området er representant for hele vev for immunostaining i alle typer antistoffer vil kreve ytterligere undersøkelse.

Ved å gjøre vev optisk gjennomsiktig, reduserer en avregning metoden lysspredning, aktivere visualisering av dyp struktur25. iDISCO + er en billig protokoll nylig utviklet at kombinerer hele-mount immunolabeling med volum avbildning av ulike store ryddet vev9. Endret iDISCO + metoder med LSFM demonstrert av nyere studier9,10 observert tett dendrittiske arborization på WAT som ikke kan ses med konvensjonelle immunolabeling og AC confocal mikroskopi. Konvensjonelle AC confocal imaging bruker en tenkelig strålen system og pinhole for laserskanning. Skannehastighet og gjennomtrengende dybde er begrensninger av mikroskopet; Dermed er 3D vev dynamics ofte savnet. I kontrast, har lys arks mikroskopi åpenbare fordelene ved at den bruker ark-skanning og bare lyser en optisk del om gangen, fange alle fluorescens molekyler i denne delen. Videre er fluorophores i andre deler ikke spent, forebygge Foto-bleking og fototoksisk26. Dermed kan mengden av nerve gir i fettvev mer nøyaktig vurderes med iDISCO + og LSFM. Til tross for dette finnes det noen begrensninger på bruken av iDISCO + og LSFM. For eksempel bør brukere merke som bare kanaler i rødt og langt rødt kanalen er kompatibel med iDISCO +, fordi lengre bølgelengder av lys er bedre i stand trenge eksempel27. I tillegg er autofluorescence i blå-grønne spekteret ganske høy i store vevsprøver, så imaging i de røde og langt rødt spectra vil redusere eventuelle autofluorescence som oppstår14. I forhold til transgene fluorescerende reporter mus, kan iDISCO + brukes å visualisere reporter proteiner. Men bør immunolabeling av fluorescerende reporteren med en sekundær antistoff utføres, som endogene signalet kan svekkes i vevet fjerne prosessen14. Likevel, denne teknikken er svært verdifull for studerer sympatiske nervesystemet fettvev interaksjoner og undersøker adipose plastisitet under ulike fysiologiske og metabolske forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra naturvitenskap og Engineering Research Council (NSERC) Canada, Pilot og mulighetsstudie studier Grant av Banting & beste Diabetes sentrum (BBDC), SickKids oppstart fondet til H-K. S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) gjennom de National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap, IKT og fremtid planlegger å J-RK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LipidTox Life Technologies H34477
PECAM-1 primary antibody Millipore MAB1398Z(CH)
TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody Millipore AB152, AB1542
DAPI stain BD Pharmingen 564907
Nikon A1R confocal microscope Nikon Confocal microscope
Ultramicroscope I LaVision BioTec Light sheet image fluorescent microscope
Alexa Fluor secondary antibodies Jackson ImmunoResearch Wavelengths 488, 594 and 647 used
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 BioSciences 553141
Dichloromethane Sigma-Aldrich 270997
Dibenzyl-ether Sigma-Aldrich 33630
Methanol Fisher Chemical A452-1
30% Hydrogen Peroxide BIO BASIC CANADA INC HC4060
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Glycine Sigma-Aldrich J7126
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Lectin kit I, fluorescein labeled VECTOR LABORATORIES FLK-2100
F4/80 Bio-Rad MCA497GA
VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI VECTOR LABORATORIES H-1500
Paraformaldehyde (PFA)
Phosphate Buffer Saline (PBS)
Triton-X
Tween
Animal serum (goat, donkey)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
  2. Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
  3. Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
  4. Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
  5. Berry, R. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
  6. Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
  7. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
  8. Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
  9. Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
  10. Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
  11. Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
  12. Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
  13. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
  16. Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
  17. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  19. Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
  20. Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
  21. Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
  22. Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
  23. Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
  24. UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
  25. Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
  26. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).

Tags

Biologi problemet 141: hvit fettvev hele-mount flekker adipose visualisering immunolabeling vev clearing immunolabeling-aktiverte tredimensjonale imaging løsemiddel klarert organer (iDISCO +)
Visualisering av 3D hvit fettvev struktur med hele-mount flekker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, Y., Yeung, J. L. H., Lee, J.… More

Jiang, Y., Yeung, J. L. H., Lee, J. H., An, J., Steadman, P. E., Kim, J. R., Sung, H. K. Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining. J. Vis. Exp. (141), e58683, doi:10.3791/58683 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter