Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58689
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, 2ORAU/ORISE

Summary

هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لمعالجة الترميز (مرناً) وانخفاض غير الترميز جلوبين (نكرنا) مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي من عينة واحدة من دم كله.

Abstract

حلول مبتكرة وقوية على نحو متزايد تقنيات التسلسل الجيل القادم وقد فتحت آفاقاً جديدة في القدرة على دراسة التعبير الجيني الأساسية المتصلة بالعمليات البيولوجية للفائدة. ليس فقط تسمح هذه الابتكارات الباحثين مراعاة التعبير من تسلسل مرناً أن التعليمات البرمجية للجينات أن الدالة effect الخلوية، ولكن أيضا جزيئات الحمض النووي الريبي (نكرنا) غير الترميز التي تظل غير مترجمة، ولكن لا تزال لديها مهام تنظيمية. على الرغم من أن الباحثين لديها القدرة على مراقبة التعبير مرناً ونكرنا، قد جرت العادة لدراسة التركيز على واحدة أو أخرى. ومع ذلك، عند الدراسات المهتمة بالتعبير مرناً ونكرنا، مرات عديدة يستخدمونها عينات منفصلة دراسة الترميز أو غير الترميز الكشف بسبب الاختلاف في الاستعدادات مكتبة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى الحاجة إلى مزيد من العينات التي يمكن أن تزيد من الوقت والمواد الاستهلاكية، والإجهاد الحيوانية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه قد يسبب الباحثين أن تقرر إعداد العينات لتحليل واحد فقط، وعادة ما تكون مرناً، مما يحد من عدد الأسئلة البيولوجية التي يمكن أن تحقق. ومع ذلك، تمتد نكرناس فئات متعددة مع الأدوار التنظيمية التعبير مرناً أثر ذلك. لأن نكرنا الهامة للعمليات البيولوجية الأساسية واضطراب في هذه العمليات في أثناء الإصابة، يجوز، ولذلك تقدم أهدافا جذابة للمداواة. يوضح هذه المخطوطة بروتوكول معدل لتوليد مرناً والحمض النووي الريبي غير الترميز التعبير المكتبات، بما في ذلك الجيش الملكي النيبالي الفيروسية، من عينة واحدة من الدم كله. الأمثل لهذا البروتوكول، تحسين نقاء الحمض النووي الريبي وزيادة ربط لانتعاش الكشف ميثليته وأغفلت حجم التحديد، للسماح بالتقاط أكثر الأنواع الجيش الملكي النيبالي.

Introduction

تسلسل الجيل القادم (خ ع) برز كأداة قوية لتحقيق التغيرات التي تحدث على مستوى الجينوم من الكائنات البيولوجية. إعداد نموذج لأساليب خ ع يمكن أن تختلف تبعاً للكائن الحي، ونوع الأنسجة، والأهم من ذلك الأسئلة الباحثون حريصون على العنوان. وقد تحول العديد من الدراسات إلى خ ع كوسيلة لدراسة الاختلافات في التعبير الجيني بين الدول مثل الأشخاص الأصحاء والمرضى1،2،،من34. تأخذ تسلسل وضع على أساس جينوم كله ويسمح لباحث الاستيلاء معظم، أن لم يكن كل، المعلومات الجينومية لعلامة الوراثية خاصة في وقت تشير.

العلامات الأكثر شيوعاً للتعبير ولاحظ يتم الكشف رسول (مرناس). الإجراءات الأكثر استخداماً لمكتبات الاستعداد لتسلسل الحمض النووي الريبي هي الأمثل لاسترداد الجزيئات مرناً عن طريق استخدام سلسلة من تنقية والتشظيات ليجيشنز5،6. ومع ذلك، القرار المتعلق بكيفية بروتوكول المراد تنفيذها تعتمد على نوع العينة والأسئلة حول عينة وقال. وفي معظم الحالات يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع؛ حتى الآن، ليس كل جزيئات الحمض النووي الريبي تهم وفي حالات مثل دراسات التعبير مرناً وفرة مفرطة الحمض النووي الريبي الأنواع، مثل الكشف الريباسي (الرنا الريباسي) تحتاج إلى إزالة لزيادة عدد النصوص القابلة للاكتشاف المقترنة مرناس. الأسلوب الأكثر شعبية وتستخدم على نطاق واسع لإزالة جزيئات الرنا الريباسي الوفيرة هو الحد من بوليادينيلاتيد الجيش الملكي النيبالي النصوص المشار إليها ك نضوب بوليا7. يعمل هذا الأسلوب أيضا لتحليل التعبير مرناً كما أنه لا يؤثر على النصوص مرناً. ومع ذلك، في الدراسات التي تهتم بالكشف غير الترميز أو الفيروسية، استنفاد بوليا كما يزيل هذه الجزيئات.

اختر العديد من الدراسات إلى التركيز على إعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي لدراسة أما التعبير مرناً (الترميز) أو فئة معينة من الرنا غير الترميز صغيرة أو كبيرة. على الرغم من أن هناك إجراءات أخرى8 مثلنا التي تسمح لإعداد العينة المزدوجة، إعداد دراسات عديدة المكتبات من عينات منفصلة لدراسات منفصلة عندما تكون متاحة. لدراسة مثل بلدنا، وهذا يتطلب عادة عدة عينات الدم زيادة الوقت والمواد الاستهلاكية، والإجهاد الحيوانية. وكان هدف دراستنا ليتمكن من استخدام الدم كله من الحيوانات للتعرف على والتحديد الكمي لفئات مختلفة من كلا مرناً، وأعرب عن الحمض النووي الريبي غير الترميز بين الصحة الإنجابية الخنزير صحية وشديدة العدوى والالتهاب الرئوي فيروس (إتش بي-برسف) تحدي الخنازير9،10 على الرغم من وجود عينة دم كله واحد فقط (2.5 مل) من كل خنزير. من أجل القيام بذلك، نحن بحاجة إلى تحسين استخراج نموذجية وبروتوكولات إنشاء مكتبة لتوليد البيانات المناسبة للسماح بتحليل كل من مرناً وغير الترميز الحمض النووي الريبي (نكرنا) التعبير11 من عينة واحدة.

هذا ما دفع حاجة إلى بروتوكول يسمح مرناً وغير الترميز تحليل الحمض النووي الريبي لمجموعات القياسية المتوفرة والأساليب لإنشاء مكتبة واستخراج الحمض النووي الريبي كانت موجهة أساسا مرناً واستخدام خطوة استنفاد بولي-أ12. هذه الخطوة أن جعلت من المستحيل لاستعادة الجيش الملكي النيبالي غير الترميز أو النصوص الفيروسية من العينة. ولذلك، هناك حاجة إلى أسلوب أمثل الذي يسمح لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع دون استنفاد نموذج بوليا. وقد تم تحسين الطريقة التي عرضت في هذه المخطوطة للسماح باستخدام الدم كله كنوع عينة وبناء المكتبات التسلسل مرناً ونكرناس من الأحجام الصغيرة والكبيرة على حد سواء. تم تحسين الطريقة للسماح لتحليل جميع الكشف الترميز غير قابلة للكشف، فضلا عن الاحتفاظ بالكشف الفيروسية ل التحقيق بعد13. في كل شيء، يسمح بروتوكول إعداد مكتبة الأمثل لدينا لتحقيق جزيئات الحمض النووي الريبي متعددة من عينة واحدة من دم كله.

وكان الهدف العام وراء استخدام هذا الأسلوب وضع عملية تسمح بجمع كل الترميز غير الجيش الملكي النيبالي ومرناً من عينة واحدة من الدم كله. وهذا يسمح لنا أن يكون مرناً ونكرنا، والجيش الملكي النيبالي الفيروسية لكل الحيوانات في دراستنا المصدر من نموذج واحد9. هذا، في نهاية المطاف، يسمح باكتشاف علمي أكثر دون تكاليف إضافية الحيوان ويعطي صورة أكثر اكتمالا للتعبير عن كل عينة الفردية. وصف الأسلوب يسمح لفحص المنظمين للتعبير الجيني، فضلا عن السماح لإتمام الدراسات الارتباطية مقارنة كلا مرناً وغير الترميز التعبير الجيش الملكي النيبالي باستخدام عينة واحدة من دم كله. دراستنا يستخدم هذا البروتوكول لدراسة التغيرات في التعبير الجيني والمنظمين جينية الممكنة في المصابة فيروسي الخنازير التجارية الذكور 9-الأسبوع القديمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بروتوكولات الحيوان أقرتها لجنة الاستخدام والمركز الوطني للأمراض الحيوانية (وزارة الزراعة-أرس-نادك) العناية بالحيوان.

1-جمع الدم الخنازير عينات

  1. جمع عينات الدم في أنابيب الجيش الملكي النيبالي. جمع ~2.5 مل أو أكثر إذا كانت أكبر مجموعة أنابيب متوفرة.

2-تجهيز الدم الخنازير عينات

  1. الطرد المركزي أنابيب الدم في 5,020 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية). إذا كان تجهيز تجميد عينات احتضان أنبوب في درجة حرارة الغرفة الحد الأدنى من ح 2 قبل الطرد المركزي.
  2. إزالة المادة طافية وإضافة 8 مل مياه خالية من رناسي لبيليه. إغلاق ودوامه بيليه حتى أنه هو حل واضح. الطرد المركزي أنابيب العينة في س 5,020 ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لاسترداد بيليه. تجاهل جميع المادة طافية والحفاظ على بيليه.

3-العضوية استخراج "مجموع الجيش الملكي النيبالي" و "رنا الصغيرة" (ميرنا طقم العزلة)

  1. تبدأ مجموع استخراج الحمض النووي الريبي قبل بيبيتينج ميليلتر 300 من المخزن المؤقت ملزم تحلل بيليه من الخطوة 2، 2.
  2. دوامة ونقل خليط جديد المسمى 1.5 مل أنبوبة الطرد المركزي. إضافة 30 ميليلتر من هوموجيناتي المضافة من الطقم. دوامة الأنبوب ومكان على الجليد لمدة 10 دقائق.
  3. إزالة الأنبوب وإضافة 300 ميليلتر من الحمض-الفينول: كلوروفورم كاشف من الطقم. دوامة أنبوب للمزيج. الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعناية إزالة المرحلة المائية (300-350 ميليلتر) إلى أنبوب جديد. ملاحظة المجلد للخطوة التالية.

4-مجموع الجيش الملكي النيبالي العزل الداخلي

  1. استناداً إلى مقدار الانتعاش مائي (300-350 ميليلتر) إضافة إلى 1.25 x حجم الإيثانول 100% (~ 375 ميليلتر) إلى المرحلة مائي. خلط العينة باستخدام ماصة.
  2. إنشاء أنابيب مجموعة جديدة تحتوي على خرطوشة تصفية لكل عينة. ماصة ~ ميليلتر 675 من خليط الإيثانول/ليستي على تصفية خرطوشة.
    ملاحظة: لا تقم بإضافة > 700 ميليلتر لتصفية خرطوشة في وقت واحد. لزيادة حجم تطبيق في الخلافة.
  3. الطرد المركزي بإيجاز (~ 15-20 ق) في 10,000 س ز لتمرير السائل من خلال عامل تصفية. لا تدور أصعب من ذلك.
  4. التدفق من خلال تجاهل، وإذا لزم الأمر، كرر الطرد المركزي مع خليط الإيثانول/ليستي المتبقية حتى كل ما تم تطبيقه. الاحتفاظ بالانبوب خرطوشة وجمع عامل التصفية نفسه للخطوة التالية.
  5. إضافة ميليلتر 700 1 الحل أغسل من الطقم إلى تصفية خرطوشة والطرد المركزي بإيجاز (~ 10 s) للانسحاب من خلال عامل تصفية. التدفق من خلال تجاهل والاحتفاظ بالانبوب خرطوشة وجمع نفس عامل التصفية.
  6. إضافة 500 ميليلتر من الحل أغسل 2/3. أجهزة الطرد المركزي استخلاص السائل من خلال تصفية خرطوشة. تجاهل في التدفق من خلال. كرر الخطوة الغسيل.
  7. نفس أنبوب ليزي، تدور خرطوشة تصفية 60 إضافية s لإزالة أي بقايا السائل من عامل التصفية. نقل الخرطوشة تصفية إلى أنبوب جمع طازجة.
  8. إضافة 100 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس ساخنة مسبقاً (95 درجة مئوية) إلى مركز تصفية خرطوشة. زيادة ونقصان لحوالي 20-30 ثانية بسرعة ماكس منضدية أجهزة الطرد المركزي.
    ملاحظة: الحمض النووي الريبي الوارد في النذرة ويمكن الآن مواصلة معالجتها أو تخزينها عند-20 درجة مئوية أو أقل. لم يتم تنفيذ تخصيب اليورانيوم للكشف الصغيرة.

5-جلوبين الحد (استناداً إلى بروتوكول الأمثل لعينات الدم كله الخنزير)14،15

ملاحظة: يقرأ جلوبين يتم تنفيذ الحد حيث أن المكتبات هي عدم المكتظة برسم خرائط للجينات جلوبين، مما سيؤدي إلى تخفيض عدد القراءات المتاحة لتعيين إلى جينات أخرى لزيادة الفائدة14،15 .

  1. التهجين مع جلوبين الحد أوليجوس
    1. تؤذي الجيش الملكي النيبالي (العينة 6 ميكروغرام الجيش الملكي النيبالي في الحد الأقصى لحجم ميليلتر 7) بيبيتينج العينة المستخرجة في أنبوب رقيقة الجدران رد فعل خالية نوكلاس 0.2 مل ووضع في cycler حرارية على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. مفتاح الجليد الأنابيب فورا بعد أول خطوة ديناتوري للجيش الملكي النيبالي الجودة المثلى. هناك حاجة إلى أي علاج الدناز.
    2. حين إعداد أنابيب باردة 400 ميليلتر من 10 × جلوبين الحد اليغو ميكس: 100 ميليلتر من كل من هذين HBA أوليجوس (-جاتكتككجاغكتككاجكتتاكغت 5 '-3'، 5 '-تكاكجاتكاجاجتكاججتجكا-3') في 30 ميكرومتر، هما سداسي البروم ثنائي الفينيل أوليجوس (5 '-أجججاكتاجتجتاكتجتججك-3'، و --جتكاجاجااااججكتككتككت 5 '-3') في 120 ميكرون كل رد فعل، مما أسفر عن تركيز 7.5 ميكرومتر HBA أوليجوس و 30 ميكرومتر سداسي البروم ثنائي الفينيل أوليجوس نهائي. إعداد المخزن المؤقت التهجين x oligo 10: 100 مم تريس-HCL، درجة الحموضة 7.6؛ 200 ملم بوكل.
    3. إعداد مزيج التهجين: 6 ميكروغرام من عينة الحمض النووي الريبي (حجم ميليلتر 7 كحد أقصى)، 2 ميليلتر من 400 ميليلتر من 10 × جلوبين الحد اليغو ميكس (تركيز نهائي 2 X)، 1 ميليلتر من x oligo 10 التهجين المخزن المؤقت (التركيز النهائي 1 x). إضافة المياه خالية من نوكلياسي إلى وحدة تخزين نهائي من 10 ميليلتر.
    4. تعيين ثيرموسيكلير على 70 درجة مئوية للحد الأدنى 5 بارد فورا إلى 4 درجات مئوية والشروع في "ح رناسي" الهضم.
  2. ح رناسي الهضم
    1. تمييع 10 x ح رناسي (10 ش/ميليلتر) إلى 1 × ح رناسي مع 1 × "ح رناسي" المخزن المؤقت.
      ملاحظة: رناسي المخزن المؤقت يأتي في العاشر 10، وسوف تحتاج إلى أن تضعف مع 1 x "ح رناسي" المخزن المؤقت إلى 1 x قبل استخدامها.
    2. إعداد "ح رناسي" رد فعل مزيج من خلال الجمع بين: 2 ميليلتر من 10 x رناسي المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من مثبط رناسي في 2 ميليلتر من 1 × ح رناسي، و 5 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس إلى حجم إجمالي 10 ميليلتر.
    3. مزيج دقيق العينات "الحد جلوبين" التهجين مع 10 ميليلتر "ح رناسي" رد فعل مزيج وهضم في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 10 باردة إلى 4 درجات مئوية.
    4. وقف الهضم عن طريق إضافة ميليلتر 1.0 يدتا 0.5 M لكل عينة وانتقل مباشرة إلى الخطوة تنظيف.
  3. رناسي ح يعامل تنظيف الجيش الملكي النيبالي إجمالي.
    1. نق "ح رناسي" معاملة الجيش الملكي النيبالي استخدام عدة تنظيف تنقية شطف السليكا-غشاء مطاطي طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. بريمكس المخازن المؤقتة: للمخزن المؤقت، والغسيل خفيف إضافة مل 44 من الإيثانول 100%.
    2. لا يتم تحويل العينة إلى أنبوب جديد. إضافة ميليلتر 80 من المياه خالية من رناسي و 350 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت. إضافة 250 ميليلتر من الإيثانول 100% المخفف الجيش الملكي النيبالي ومزيج جيد من قبل بيبيتينج.
      ملاحظة: عدم الطرد المركزي. الشروع فورا في خطوة 5.3.3.
    3. الآن نقل العينة ميليلتر 700 خرطوشة تصفية شطف وضعها في أنبوب جمع 2 مل للتدفق من خلال جمع. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥ س 8,000 ز. تجاهل في التدفق من خلال.
    4. كرر هذه العملية عن طريق وضع خرطوشة تصفية شطف في أنبوب جمع 2 مل جديدة. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت الغسيل خفيف لتصفية خرطوشة والطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥ س 8,000 ز كي يغسل الغشاء خرطوشة تصفية. تجاهل في التدفق من خلال. إعادة استخدام أنبوب جمع في خطوة 5.3.5.
    5. الآن باستخدام أنبوب العينة نفسها، إضافة آخر ميليلتر 500 من الإيثانول 80% إلى تصفية خرطوشة. هذا الوقت الطرد المركزي في أنبوب لمدة 2 دقيقة في ≥ س 8,000 ز. جمع عمود الدوران شطف للخطوة التالية وتجاهل أنبوب من خلال تدفق وجمع.
    6. وضع خرطوشة تصفية شطف من الخطوة الأخيرة في أنبوب جمع 2 مل جديدة. تحمل إجازة الغطاء فتح على تصفية خرطوشة، والطرد المركزي بالسرعة الكاملة لمدة 5 دقائق تجفيف الغشاء عمود الدوران ومنع الإيثانول أكثر. تجاهل الأنبوب من خلال تدفق وجمع.
      ملاحظة: لتجنب الأضرار بزاوية الأغطية للإشارة في اتجاه معاكس للدوار.
    7. اتخاذ خرطوشة تصفية المجفف ووضع في أنبوب جمع 1.5 مل جديدة. إضافة 14 ميليلتر من الماء خالية من رناسي لتصفية غشاء خرطوشة مع التأكد من إضافة المياه خالية من رناسي مباشرة إلى المركز. أجهزة الطرد المركزي ل 60 s بأقصى سرعة الوت الجيش الملكي النيبالي.
  4. تقييم الجودة لتخفيض جلوبين عينات الحمض النووي الريبي (الخطوة 6). الشروع في إعداد نموذج مرناً (الخطوة 7) والحمض النووي الريبي الصغيرة مكتبة إعداد (الخطوة 8)16،17.
    ملاحظة: عينات الحمض النووي الريبي خفضت جلوبين يمكن الآن تخزين في-20 درجة مئوية، ولكن ينصح بتخزين في-80 درجة مئوية للحفاظ على المدى الطويل.

6-تقييم للجيش الملكي النيبالي

  1. قياس تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي. فحص نسبة الطول الموجي نانومتر 260 و 280. وتعتبر نسب ~ 2 أو أكبر الصرفة للحمض النووي الريبي والقيم المنخفضة تشير إلى بعض التلوث. الصك الذي يستخدم هذه النسبة لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي نانوغرام/ميليلتر.
  2. تقييم جودة الجيش الملكي النيبالي باستخدام 1 ميليلتر (100 نانوغرام) من عينة على رقاقة إلكترونية مناسبة. يجب أن يكون المنتج النهائي رين ~ 2 أو أعلى وذروتها في ~ 280 nt مرناً واحد قراءة المكتبات؛ الجيش الملكي النيبالي مكتبات قمم صغيرة في 143 تتوافق مع ميرناس.

7-الذين تقطعت بهم السبل مجموع "إعداد عينة الحمض النووي الريبي" لمكتبات نكرنا طويلة ومرناً. 16

  1. ملاحظة: إحضار شطف المخزن المؤقت والرنا الريباسي حبات إزالة لدرجة حرارة الغرفة. قبل تسمية 0.2 مل رقيقة الجدران أنابيب PCR (كما يمكن استخدام لوحات). خطوات البروتوكول استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة16.
    1. بدء تشغيل مع 4 ميليلتر من الحمض النووي الريبي خفضت جلوبين. إضافة ميليلتر 6 المياه خالية من نوكلاس و 5 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم الرنا الريباسي 5 ميليلتر من الرنا الريباسي إزالة المزيج كل أنبوب (1ش أنبوب). "الماصة؛" لخلط وإعادة الغطاء. وضع في ثيرموسيكلير مع 100 درجة مئوية تسخينها غطاء لمدة 5 دقائق في 68° C. إزالة وترك في درجة حرارة الغرفة ل 60 ثانية.
    2. ريسوسبيند الرنا الريباسي إزالة حبات من دوامة؛ إضافة 35 ميليلتر من الخرز إلى أنبوب PCR (2nd) جديدة و "الماصة؛" عينة من أنابيب 1st على الخرز في أنابيب 2nd . احتضان 2nd PCR أنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. ضع على الوقوف المغناطيسية لمدة 7 دقائق.
      ملاحظة: خلط كل عينة جيدا قبل بيبيتينج لاستنفاد الرنا الريباسي الأمثل. رفع/خفض الأنبوبة في الحامل قد يساعد في الإسراع بعملية الفصل.
    3. الوقوف نقل المادة طافية من أنبوب بكر 2nd rd 3 مطابقة PCR أنبوب والمكان إلى المغناطيسي لحد أدنى من 60 س. تكرار نقل إلى أنبوب بكر جديدة فقط إذا لم يتم نقل الخرز إلى جانبي الأنبوب.
    4. حبات "تنقية عينة مزيج" من دوامة؛ إضافة ميليلتر 99 لكل أنبوبة بكر 3rd . السماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة مكان في موقف المغناطيسي للحد الأدنى 5 ضمان الخرز التحركات للجانبين. ماصة لتجاهل المادة طافية.
    5. إبقاء 3rd الأنبوبة على موقف المغناطيسية. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 70% في حين يجري الحرص على عدم تصدم الخرز. السماح للجلوس لمالا يقل عن 30 ثانية وماصة لتجاهل المادة طافية. كرر الخطوة.
    6. السماح بعينه لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الوقوف المغناطيسية. الطرد المركزي عدة شطف المخزن المؤقت ل 5 s في 600 x ز. إزالة أنبوب وإضافة 11 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف خلط دقيق. احتضان لمدة 5 دقائق على الأقل على الوقوف المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة ثم 2 دقيقة على مقاعد البدلاء.
    7. نقل ميليلتر 8.5 من المادة طافية من 3rd إلى جديدة (4ث) أنبوب PCR. إضافة ميليلتر 8.5 من مزيج "عالية" الوتي/رئيس الوزراء/جزء من الطقم. مزيج جيد. كاب ومكان في ثيرموسيكلير مع مياه دافئة قبل غطاء لمدة 8 دقائق في 94 درجة مئوية، وعقد في 4 درجات مئوية. إزالة وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز.
  2. توليف كدنا "حبلا الأولى"
    1. السماح بأول ميكس توليف حبلا من طقم للقدوم إلى درجة حرارة الغرفة والطرد المركزي في 600 × ز 5 س. نقل 50 ميليلتر من المنتسخة العكسية في مزيج توليف حبلا الأولى. يمكن إضافة المنتسخة العكسية أول حبلا التوليف بنسبة 1:9.
    2. "الماصة؛" 8 ميليلتر من المنتسخة العكسية مجتمعة/أولاً ستراند ميكس التوليف في أنبوب 4 بعينه. كاب والطرد المركزي 600 x ز لمكان س. 5 في ثيرموسيكلير مع غطاء دافئ قبل تعيين عند 100 درجة مئوية. تشغيل ل: 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية، 15 دقيقة في 42 درجة مئوية، 15 دقيقة في 70 درجة مئوية، ثم ضع في 4 درجات مئوية. هو الحجم النهائي ~ 25 ميليلتر كل بئر. الانتقال مباشرة إلى الخطوة التالية.
  3. توليف كدنا "حبلا الثانية"
    1. تحقيق نهاية إصلاح كاشف (خطأ) ومزيج حبلا الثانية (SSM) إلى درجة حرارة الغرفة، والطرد المركزي في ز 600 x عن 5 س. ERR ميكس مع المخزن المؤقت لاستثارة الساعة 01:50 إضعاف. زجاجتين أنبوبال 4 وإضافة 5 ميليلتر من ERR المخفف و 20 ميليلتر من إليه الضمانات الخاصة لكل منها؛ ماصة مزيج جيد. الحجم النهائي ~ 50 ميليلتر كدنا ds.
    2. كاب واحتضان في ثيرموسيكلير لمدة ساعة واحدة في 16 درجة مئوية. عند اكتمال الدورة إزالة قبعات والسماح للحضور إلى درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء أعلى.
  4. الخطوة تنظيف كدنا ds
    1. نبدأ بخلط الخرز التثبيت عكسها المرحلة الصلبة (سبري) باراماجنيتيك بدوامة. نقل 90 ميليلتر من الخرز للعينة في أنبوبال4 (كدنا ds) وخلط. الحجم النهائي احتضان السماح أنابيب ميليلتر. 140 الجلوس في درجة حرارة الغرفة 15 دقيقة على الوقوف المغناطيسي ل ~ 5 دقيقة. إزالة ميليلتر ~ 135 من المادة طافية من كل بئر. وينبغي أن هناك 5 ميليلتر ترك في كل بئر.
    2. اترك الأنبوب على الوقوف المغناطيسية وتغسل بإضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80%. السماح للجلوس ل 30 ثانية ثم إزالة وتجاهل طافية. كرر الخطوة الغسيل. ترك أنابيب على الوقوف المغناطيسية لمدة 15 دقيقة للسماح لتجف.
    3. الطرد المركزي استثارة المخزن المؤقت في 600 x ز 5 s بعد مجيئه إلى درجة حرارة الغرفة. إزالة أنابيب من الوقوف. نقل 17.5 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستثارة للأنبوب ومزيج. واسمحوا أنابيب احتضانها في أعلى هيئة ل 2 دقيقة ثم نقل إلى موقف المغناطيسية لمدة 5 دقائق.
    4. "الماصة؛" 15 ميليلتر من المادة طافية تتضمن العينات كدنا ds لمجموعة من (5th) مل 0.2 رقيقة الجدران أنابيب جديدة. الانتقال إلى الخطوة التالية على وجه السرعة أو ختم وتخزينها في-15 درجة مئوية إلى-25 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 7 أيام.
  5. أدينيلاتي 3 ' ينتهي.
    1. "الماصة؛" ميليلتر 2.5 درجة حرارة الغرفة استثارة المخزن المؤقت في أنبوب العينة ثم إضافة ميليلتر 12.5 المذابة A-تراجع مزيج. مزيج تماما من بيبيتينج.
      ملاحظة: لا تحكم A-تراجع المستخدمة.
    2. كاب واحتضان في ثيرموسيكلير مع غطاء دافئ قبل 100 درجة مئوية. تشغيل عند 37 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، ثم على 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع غطاء دافئ. السماح ثيرموسيكلير إلى الراحة عند 4 درجة مئوية.
  6. سد محولات الفهرس
    1. إحضار أنابيب "محول الحمض النووي الريبي" ومزيج "التوقف عن ربط المخزن المؤقت" إلى درجة حرارة الغرفة. لكل منهما، الطرد المركزي في 600 x ز لإجازة 5 س. ربط المزيج في الثلاجة حتى جاهزة للاستخدام. ينبغي أن تكون معروفة عينة تجمع الترتيب للفهرسة.
    2. إضافة 2.5 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستثارة و 2.5 ميليلتر من مزيج ربط لكل أنبوبة العينة. الآن "الماصة؛" في ميليلتر 2.5 من "محول الحمض النووي الريبي" السليم في كل أنبوبة العينة. اختيار محول ينبغي أن يؤديها تعليمات الشركة المصنعة لهذه المجموعة المختارة.
    3. خلاصة ومزج بالطرد المركزي لمدة 1 دقيقة على 280 x ز. احتضان في cycler حرارية لمدة 10 دقائق في 30 درجة مئوية. إضافة 5 ميليلتر "وقف عملية ربط المخزن المؤقت" إلى عينة لوقف رد الفعل ومزيج جيد.
    4. بدء تنظيف بمزج الخرز سبري باراماجنيتيك من دوامة ل 60 ميليلتر نقل 42 س. من حبات لكل أنبوبة. ثوروغليثين ميكس احتضانها لمدة 15 دقيقة على مقاعد البدلاء أعلى.
    5. نقل أنابيب إلى موقف المغناطيسية وترك حتى يتحول السائل واضحة (~ 5 دقائق). إزالة وتجاهل 79.5 ميليلتر من المادة طافية مرة واضحة. ترك أنابيب على الوقوف المغناطيسية وتغسل بإضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80%. السماح للجلوس لمالا يقل عن 30 ثانية ثم إزالة وتجاهل طافية. كرر الخطوة الغسيل. ترك على موقف المغناطيسي لإضافية ~ 15 دقيقة للسماح للتجفيف. عدم تعطيل الخرز أثناء خطوات الغسيل.
    6. إضافة 52.5 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستثارة لأنبوب عينة ومزيج حتى الخرز تماما إعادة مع وقف التنفيذ. احتضان لمدة 2 دقيقة على مقاعد البدلاء أعلى. أنبوب عينة نقل مرة أخرى إلى موقف المغناطيسي حتى السائل واضح (~ 5 دقائق).
    7. ترك على الوقوف ولطف "الماصة؛" 50 ميليلتر من المادة طافية إلى الجديدة (6ث) الأنابيب. إضافة 50 ميليلتر من حبات سبري فورتيكسيد. السماح لاحتضان في أعلى هيئة لمدة 15 دقيقة.
    8. الانتقال إلى موقف المغناطيسية وتسمح لوحة البقاء حتى يتحول السائل واضحة (~ 5 دقائق). تجاهل 95 ميليلتر من المادة طافية تاركة 5 ميليلتر في كل أنبوبة.
    9. ترك أنابيب على موقف المغناطيسية وتغسل بإضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80%. يسمح الأنبوب للجلوس لمدة 30 ثانية ثم إزالة وتجاهل المادة طافية. تكرار الغسيل. واسمحوا الأنابيب الجافة على موقف المغناطيسية لمدة 15 دقيقة.
    10. إضافة في ميليلتر 22.5 من المخزن المؤقت لاستثارة ومزيج حتى يتم تعليق الخرز. تبني على مقاعد البدلاء لمدة 2 دقيقة ثم الانتقال إلى موقف المغناطيسي حتى يتحول السائل واضحة (~ 5 دقائق). "الماصة؛" 20 ميكروليتر من عينة إلى أنابيب PCR جديدة (7th).
  7. إحضار مكونات أدوات اللازمة لدرجة حرارة الغرفة. نقل 5 ميليلتر من PCR التمهيدي مزيج و 25 ميليلتر من مزيج PCR الرئيسي من مجموعة للعينة (7ال PCR أنبوب) التي تحتوي على عينات المفهرسة. مزيج من أنبوب عينة وكاب.
    1. ضع الأنابيب في cycler الحرارية مع غطاء ساخن مسبقاً. تشغيل البرنامج: 98 درجة مئوية لمدة 30 s، ثم دورات 15 98 درجة مئوية لمدة 10 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية للحد الأدنى 5 عقد في 4 درجات مئوية.
  8. تنظيف العينات بإضافة 50 ميليلتر من حبات سبري المختلطة بما فيه الكفاية أخذ عينة من الأنبوب و "الماصة؛" للجمع. السماح بأن رد الفعل على احتضان في أعلى هيئة لمدة 15 دقيقة.
    1. نقل الأنبوب إلى موقف مغناطيسية واحتضان حتى يتحول السائل واضحة (~ 5 دقائق). تجاهل 95 ميليلتر من المادة طافية تاركة 5 ميليلتر في كل أنبوبة.
    2. ترك الأنبوب في موقف المغناطيسية وتغسل بإضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80%. السماح للجلوس لمالا يقل عن 30 ثانية ثم إزالة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة من المياه والصرف الصحي. ترك على موقف المغناطيسية لمدة 15 دقيقة للسماح لتجف.
    3. إضافة في 32.5 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستثارة ومزيج حتى الخرز تماما إعادة مع وقف التنفيذ. تبني على مقاعد البدلاء لمدة 2 دقيقة ثم الانتقال إلى موقف المغناطيسي حتى يتحول السائل واضحة (~ 5 دقائق). "الماصة؛" 30 ميليلتر من عينة من كل أنبوب إلى أنبوب بكر جديدة.
    4. تقييم نوعية وكمية الحمض النووي بتكرار الخطوات من 6.1 و 6.2 مع رقاقة المناسبة. الانتقال إلى تجميع الخطوة (الخطوة رقم 9).

8-الصغيرة "إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي" سنكرناس. 17

ملاحظة: بروتوكول الخطوات استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة17.

  1. تبدأ الإعدادية مكتبة صغيرة في الجيش الملكي النيبالي ~ 220 نانوغرام-~1.1 ميكروغرام/ميليلتر من الحمض النووي الريبي خفضت جلوبين عينات (4 ميليلتر).
  2. ربط محول
    1. سد 3 '--المحول بخلط دقيق 1 ميليلتر محول و 2 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس 4 ميليلتر من تخفيض جلوبين عينة الحمض النووي الريبي. تبني على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ومن ثم ضع فورا على الجليد.
    2. إضافة 10 ميليلتر من 2 × ربط المخزن المؤقت، و 3 ميليلتر من ربط إنزيم ميكس، مزيج واحتضان 16 درجة مئوية ح 18.
      ملاحظة: يوصي بزيادة وقت الحضانة العينة لمدة 18 ساعة في درجة حرارة أقل من 16 درجة مئوية للدراسات المهتمة في ميثليته الحمض النووي الريبي الأنواع، مثل بيوي الكشف. يسمح وقت حضانة أطول لزيادة كفاءة عملية ربط بسبب فئة تعديلات أثناء مرحلة ربط محول 3 '.
    3. إضافة 1 ميليلتر من النسخ العكسي التمهيدي في 4.5 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي إلى خليط ربط منع تكوين محول-ديمر الزائدة 3 ' محول.
    4. احتضان في cycler حرارية مسخن المبرمجة لمدة 5 دقائق في 75 درجة مئوية، 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية، وعقد في 4 درجات مئوية.
    5. تؤذي 1 ميليلتر من قبل المخفف 5 '--محول كل عينة في cycler حرارية على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ومن ثم ضع فورا على الجليد.
    6. إضافة 1 ميليلتر من التشويه والتحريف 5 '--محول، 1 ميليلتر من 10 × 5' ربط المخزن المؤقت وميليلتر 2.5 من ربط إنزيم 5 '. خلط واحتضان 25 درجة مئوية ح 1.
  3. توليف كدنا والتضخيم
    1. مزيج دقيق من بيبيتينج ميليلتر 30 الجيش الملكي النيبالي 5/3-محول-متصلة، 8 ميليلتر من المخزن المؤقت الأول-ستراند، 1 ميليلتر من مثبط رناسي و 1 ميليلتر من المنتسخة العكسية. احتضان الخليط عند 50 درجة مئوية عن 60 دقيقة الشروع فورا إلى التضخيم PCR أو الحرارة إلغاء تنشيط رد فعل على 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    2. [بكر] تضخيم ميليلتر 40 من رد فعل المنتسخة العكسية بإضافة 50 ميليلتر من مزيج PCR الرئيسي، 2.5 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي PCR التمهيدي، إضافة 2.5 ميليلتر "الجيش الملكي النيبالي" المعين بكر التمهيدي مؤشر للعينة، والمياه خالية من نوكلاس إلى إجمالي حجم 100 ميليلتر. مزيج من بيبيتينج. تشغيل PCR في cycler الحرارية استخدام الدراجات الشروط التالية: تمسخ الأولى في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ دورات 11 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، الصلب في 62 درجة مئوية 30 ثانية، وتمديد في 70 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ متبوعة بملحق نهائي على 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ ويمكن عقد عينات في 4 درجات مئوية في cycler.
    3. ملاحظة: يتم إضافة الفهارس لغرض تجميع العينة.
  4. تنظيف العينة
    1. من مجموعة أدوات تنظيف الحمض النووي إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم (5 م قو-HCl، الايزوبروبانول 30 ٪) إلى 100 ميكروليتر من عينة بكر تضخيم لتمكين ربط فعالة للغشاء عمود الدوران.
      ملاحظة: إذا كان المخزن المؤقت ملزم مؤشر الرقم الهيدروجيني وشملت التأكد من أن لون الخليط الأصفر.
    2. خليط 600 ميليلتر ماصة العينة وربط المخزن المؤقت إلى تصفية خرطوشة داخل أنبوب جمع 2 مل، تدور على 30-60 ثانية في س 17,900 ز في أجهزة الطرد مركزي منضدية. تجاهل من خلال التدفق.
    3. أغسل تصفية خرطوشة في أنبوب جمع نفسه مع 0.75 مل طقم الموردة يغسل المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl pH 7.5، الإيثانول 80%) بالغزل عن 30-60 ثانية في س 17,900 ز في أجهزة الطرد مركزي منضدية وتجاهل التدفق--من خلال. تدور خرطوشة تصفية الجافة 60 إضافية s.
    4. ضع خرطوشة تصفية في أنبوب جمع نظيفة 1.5 مل. إضافة 30 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت (pH 8.5 من 10 ملم تريس-HCl)، ترك العمود الوقوف 60 s، وتدور ثم 60 s في س 17,900 ز في أجهزة الطرد مركزي منضدية.
  5. تقييم جودة عينة بتكرار الخطوات 6.1 و 6.2 مع رقاقة الحمض النووي المناسب. الانتقال إلى تجميع الخطوة (الخطوة رقم 9).

9-نموذج تجميع للتسلسل

  1. تجمع المراقب وعينات QC'ed بإنشاء وتسمية أنابيب جديدة (أو لوحة بكر جيدا 96) تحتوي على عينات مرناً أو نكرنا. نقل 13 ميليلتر لكل مكتبة 10nM المراقب لأنابيب المناظرة (أو الآبار في لوحة جديدة) كل تعليمات الشركة المصنعة16،17. تقديم العينات المجمعة للتسلسل، وتكون معينة لاختيار أطوال قراءة مماثلة إذا كانت عينات ليتم تشغيلها على نفس الرقاقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هي عينات ممثلة في دراستنا جلوبين وعينات الدم كله المنضب ريبو. نتائج تمثيلية للبروتوكول يتكون من نموذج مكتبة المنضب جلوبين مع عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) أعلاه 7 (الشكل 1) و 260/280 nm نسب تركيز أو أعلى 2 (الشكل 1ب وج 1). تم إجراء التحقق من صحة نتائج العينة باستخدام جهاز المطياف الضوئي لإعطاء التركيز النهائي لكل مكتبة والقائم على رقاقة التفريد إعطاء رقم رين جنبا إلى جنب مع رسم بياني للقمم التي تظهر فيها جزيئات (مرناً أو نكرنا) تم القبض على على أساس أدخل حجم العينة مكتبة قبل تجميع وترتيب. للدراسة الحالية تم التركيز على مرناً ونكرناس الصغيرة فقط. لمكتبات مرناً نتيجة الممثل ذروة اليكتروفيروجرام في ~ 280 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 1د). للممثل نكرناس الصغيرة نتائج تتكون من مجموعة من قمم من ~ 100-400 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 1ﻫ)، بلغت ذروتها في bp ~ 143 و ~ 153 تتوافق مع ميرناس وبرنس، على التوالي. وأظهرت نتائج عينة لدينا أن لدينا الأسلوب الأمثل أسفرت عن المكتبات رين بأرقام تتراوح بين 6.3 (دون المستوى الأمثل) إلى 9.2 (أعلاه الأمثل). وهذا ثبت أن تحسنا مقارنة بغيرها من الدراسات التي تستخدم أساليب استنزاف جلوبين وكانت فقط قادرة على تحقيق أرقام رين في أو بالقرب من 6. بالتفريد المستندة إلى شرائح وأظهرت النتائج أيضا أنه من الممكن تحقيق التقاط جزيء الحمض النووي الريبي من قمم يمثلون مرناً ونكرنا (د 1 الأرقام و 1e) من عينة دم واحد واحد، وأحجام إدراج عينة التي غطت كل صغيرة وكبيرة غير الترميز جزيئات الحمض النووي الريبي. هذه النتائج هي الممثل لعشرات رين الأمثل وإدراج الأحجام اللازمة لضمان جودة نص يقرأ يمكن متسلسلة من مكتبات معدّة لما يقرب من جميع المنابر خ ع الجيش الملكي النيبالي-seq.

Figure 1
الشكل 1 : الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 1b
الشكل 1b : الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 1c
الشكل 1 ج : الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 1d
د الشكل 1 : الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 1e
1e الشكل : الممثل النتائج مرناً وغير الترميز مكتبات التعبير الجيش الملكي النيبالي من واحد من عينات من الدم كله الخنزير- (أ) التفريد ملف تشغيل التمثيل الموجز رين أرقام جلوبين قبل التخفيض والحد من جلوبين بعد. تخفيض جلوبين قبل الممثل اليكتروفيروجرامس (ب) وتخفيض جلوبين بعد (ج) من عينة واحدة من الدم كله الخنزير. (د) ممثل اليكتروفيروجرامس جلوبين والدم كله المنضب ريبو مرناً مكتبة العينات قبل تجميع وترتيب. (ه) اليكتروفيروجرامس ممثل من جلوبين المنضب سنكرنا الدم كله مكتبات عينات نفس المميز في لوحة د قبل تجميع وترتيب الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وشملت الخطوة الحاسمة الأولى في البروتوكول التي جعلت من الأمثل الخطوات استنفاد جلوبين المضافة، التي جعلت من الممكن الحصول على نوعية ما يلي من عينات الدم كله. واحدة من أكبر القيود المفروضة على استخدام الدم كله في تسلسل الدراسات هي أرقام عالية من يقرأ في العينة خريطة لجزيئات جلوبين والحد من القراءات التي يمكن تعيينها إلى جزيئات أخرى لفائدة18. ولذلك، في الاستفادة المثلى من البروتوكول لأن نوع العينة، أننا بحاجة إلى إدراج خطوة استنفاد جلوبين لضمان أعلى ممكن مرناً والحمض النووي الريبي غير ترميز التقاط عن طريق التسلسل. كانت جميع العينات جلوبين المنضب إلى حساب لمستويات عالية من النصوص جلوبين استخدام الخنزير محددة الهيموغلوبين A و B (HBA وسداسي البروم ثنائي الفينيل) النوكليوتيد استناداً إلى الإجراء من تشوي et al.، 201414. وكان خطوة حاسمة أخرى استخدام مجموعة أدوات استخراج ريبو-استنفاد مما أتاح لإزالة القدرة جزيئات الحمض النووي الريبي غير المرغوب فيها من عينات لدينا مع الاحتفاظ في نفس الوقت بوليادينيلاتيد غير الترميز والفيروسية جزيئات الحمض النووي الريبي لمصلحة تجريبية داخل لدينا مكتبات لتسلسل19. بالإضافة إلى ذلك، كنا قادرين على العمل مع عينات واحدة لإنشاء كل من الترميز (مرناً) والترميز غير مكتبات الحمض النووي الريبي (صغيرة وطويلة) عن طريق إزالة الحمض النووي الريبي الإثراء وحجم التحديد خطوات صغيرة. عند القيام بذلك، تمكنا من تعظيم مختبرين الحمض النووي الريبي لتجميع وضمان أرسلنا حجم ما يكفي للسماح للتسلسل. تم القيام به الأمثل لكافة البروتوكولات للشركة المصنعة لزيادة مرناً وغير الترميز استعادة الجيش الملكي النيبالي لإنشاء مكتبة المتلقين للمعلومات. ونحن أيضا الأمثل إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي غير الترميز لجزء صغير غير الترميز الحمض النووي الريبي لتحليلنا المصب بإضافة وقت إضافي للاحتضان بكر كل تعليمات الشركات المصنعة لزيادة كفاءة عملية ربط الكشف ميثليته و احتمال استعادة بيوي-الكشف.

القيود المفروضة على البروتوكول الأمثل متأصلة في الافتقار إلى الخصوصية التي تجعلها مثالية لتحليلات متعددة من عينة واحدة. عن طريق إزالة بتخصيب اليورانيوم وحجم اختيار أجزاء من إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي غير الترميز، نحن تحد من الرواية الصغيرة رنا اكتشاف20 إلى التوازن ضد حيازة صغيرة وطويلة غير الترميز من جزيئات الحمض النووي الريبي. ومن ثم البروتوكول الأمثل ويعطي نظرة عامة جيدة من أنواع التعبير غير الترميز، لكنه يتطلب معالجة إضافية المرحلة التحليلية من رسم خرائط الحصول على معلومات أكثر تحديداً عن الفئات والأحجام غير الترميز التعبير الحمض النووي الريبي أسروا في عينة. قيد آخر على الأسلوب سبب إدراج الخطوات استنفاد جلوبين، مما سيخفض العدد الإجمالي رين. كنا قادرين على استكشاف هذا بأول فحص أرقام رين قبل وبعد استنفاد جلوبين لفهم كيفية كبيرة من تخفيض في سلامة الحمض النووي الريبي سوف نعاني. وهذا أسفر عن النتائج التي أظهرت أننا يمكن أن تجربة انخفاض ~ 1-2 نقطة. لحساب هذا الانخفاض ونحن كذلك الأمثل بروتوكول نضوب جلوبين 6 ميكروغرام من عينة بدلاً من ميكروغرام 10 الموصى بها. وهذا ساعد على تحسين اعدادنا رين، كذلك، المحافظة على عينة. بالإضافة إلى ذلك، نحن أيضا استخدام أنابيب رد فعل ميكروامب رقيقة الجدران ومثلج الأنابيب مباشرة بعد الخطوة الأولى يشوه. وهذا سمح لنا بإخماد رد فعل أسرع، وتسمح بتحسين الأرقام رين على جلوبين المنضب عينات.

تعديل البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة مزايا عديدة على طرق إعداد المكتبة الأساسية المستخدمة في الدراسات الأخرى حيث مرناً أو الحمض النووي الريبي غير الترميز فقط هي تدرس على حدة. التغييرات للتحسين يسمح للاستخدام الكفء للدم كله كنوع العينة لدينا. هذا مفيد للدراسات المستقبلية لأن الدم كله كنوع عينة أقل خطوات لجمع وتجهيز ومن جزء الكريات البيض في الدم. بالإضافة إلى ذلك، الدم كله أيضا المزايا المضافة للسماح للباحثين دراسة الاستجابات النظامية ويمكن جمعها مرارا وتكرارا من الحيوان. ومع ذلك، هناك تحذيراً باستخدام عينات الدم كله في كمية الدم التي يتم جمعها اعتماداً على السن وحجم الكائن الحي في السؤال. كميات صغيرة من الدم سوف تؤدي إلى انخفاض غلة الجيش الملكي النيبالي، ولكن الأسلوب قدم هنا سيسمح إنشاء مكتبة المزدوج من يقل عن 2.5 مل من الدم كله. هذا يسمح لنا باستخدام عينة واحدة للتحقيق في كل من مرناً وغير الترميز التعبير والربط بين كل فرد في لقطة في الوقت المناسب، فعالية مما يسمح لنا بجمع معلومات أكثر من أساليب إعداد المكتبة التقليدية. أيضا، عن طريق إجراء ريبو-الاستنفاد نحن مكن للحد من النصوص التي يمكن أن تستنفد ما يلي التسلسل، بينما لا يزال الإبقاء على النصوص غير الترميز والفيروسية التي يمكن أن تضيع أثناء إنشاء المكتبة التقليدية لدراسة مرناً. في هذه الطريقة ثلاثة أمثاله البروتوكول الأمثل لدينا كمية المعلومات التي يمكن الحصول عليها من عينة واحدة. كانت تغييرات هامة أخرى قمنا إلى الطريقة لتسهيل القبض على الحمض النووي الريبي أكثر أنواع المعلومات: تغيير نوع لوحة PCR لوقف بسرعة رد الفعل، مما أدى إلى تحسن الحمض النووي الريبي نقاء الغلة؛ حضانة ثيرموسيكلير وقتاً أطول لزيادة ربط الاسترداد المحتملة للكشف ميثليته؛ ولم توظف تحديد حجم هلام، للسماح لجميع نكرناس قابلة للكشف عن هويته بغض النظر عن طول. هذا يسمح لتحليل المتلقين للمعلومات للقبض على الكشف غير ترميز متعددة بين 18nt-200nt في طول.

باستخدام هذا الأسلوب الأمثل، تمكنت مجموعتنا من طرح بروتوكول التي يمكن تطبيقها على تحاليل الدم كله ترانسكريبتوميك والسماح مرناً والحمض النووي الريبي غير الترميز من عينة واحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

الإشارة إلى الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المادة هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من قبل "وزارة الزراعة في الولايات المتحدة". وزارة الزراعة هو موفر تكافؤ الفرص ورب العمل.

Acknowledgments

وكان هذا العمل أساسا بدعم من "وزارة الزراعة" NIFA أفري 2013-67015-21236، وفي جزء آخر من "وزارة الزراعة" عام 2015 أفري NIFA-67015-23216. هذه الدراسة تدعمها جزئيا تعيين إلى "الزراعية البحوث خدمة البحث مشاركة برنامج" يديره معهد أوك ريدج للعلم والتعليم (أرس) من خلال اتفاق مشترك بين الوكالات بين (وزارة الطاقة الأمريكية وزارة الطاقة)، ووزارة الزراعة في الولايات المتحدة. إدارة أوريسي أوك ريدج الجامعات المرتبطة بمقتضى العقد الفلاني لا. دي-AC05-06OR2310.

ونود أن نشكر الدكتور كاي فابيرج لاستنساخ المعدية HP برسف، الدكتورة سوزان بروكمير لمساعدة لها مع الحيوانات المشاركة في التجربة، وسو أوهليندورف للمساعدة في مجال السكرتارية في إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAXgene Tubes PreAnalytix 762165
Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
mirVana miRNA Isolation Kit ThermoFisher AM1560
Rneasy MinElute Clean Up Kit QIAGEN 74204
100% Ethanol Decon Labs, Inc. 2716
0.2 mL thin-walled tubes ThermoFisher 98010540
1.5 mL RNase/DNase - free tubes Any supplier
Veriti 96-well Thermocycler ThermoFisher 4375786R
Globin Reduction Oligo (α 1) Any supplier Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (α 2) Any supplier Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1) Any supplier Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2) Any supplier Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
-KCl Millipore Sigma 60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
 -DTT ThermoFisher Y00147
 -MgCl2 Promega A351B
 -Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
RNase H ThermoFisher AM2292
SUPERase-IN ThermoFisher AM2694 Rnase inhibitor
EDTA Millipore Sigma E7889
Microcentrifuge Any supplier
 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument Agilent Technologies G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies 5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  Kit Agilent Technologies 5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero  Illumina RS-122-2201 mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A  (48 samples, 12 indexes)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide Illumina Available on-line
RNAClean XP Beads BeckmanCoulter A63987
AMPure XP Beads BeckmanCoulter A63880
MicroAmp Optical 8-tube Strip ThermoFisher N8010580 0.2 ml thin-walled tubes
MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap ThermoFisher N801-0535
RNase/DNase - free reagent reservoirs Any supplier
SuperScript II Reverse Transcriptase ThermoFisher 18064-014
MicroAmp Optical 96 well plates ThermoFisher N8010560 These were used in place of .3mL plates as needed
MicroAmp Optical adhesive film ThermoFisher 4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1)  New England Biolabs E73005 small RNA kit
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2)  New England Biolabs E75805 small RNA kit
QIAQuick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
96S Super Magnet Plate ALPAQUA A001322

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
  2. Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
  3. Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
  4. Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
  5. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  6. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  7. Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  8. Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf (2015).
  9. Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
  10. Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).
  11. Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
  12. Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
  13. Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
  14. Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
  15. Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf (2007).
  16. TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
  17. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018).
  18. Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
  19. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
  20. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 141، مرناً، عدم الترميز رنا، رنا-Seq، الدم كله، جينية، جلوبين الحد
وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fleming, D. S., Anderson, S. J.,… More

Fleming, D. S., Anderson, S. J., Miller, L. C. Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood. J. Vis. Exp. (141), e58689, doi:10.3791/58689 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter