Summary
Her præsenterer vi en protokol optimeret til behandling af kodning (mRNA) og ikke-kodende (ncRNA) globin reduceret RNA-seq biblioteker fra en enkelt hele blodprøve.
Abstract
Fremkomsten af innovative og stadig mere magtfulde næste generation sequencing teknikker har åbnet nye veje ind i mulighed for at undersøge de underliggende genekspression relateret til biologiske processer af interesse. Disse innovationer ikke kun give forskere at observere udtryk fra mRNA sekvenser, som kode for gener at virkning cellefunktion, men også de ikke-kodende RNA (ncRNA) molekyler, der forbliver utranslaterede, men stadig have myndighedsopgaver. Selv om forskerne har evnen til at observere både mRNA og ncRNA udtryk, har det været sædvane for en undersøgelse for at fokusere på ene eller den anden. Men når undersøgelser er interesseret i både mRNA og ncRNA udtryk, mange gange de bruger separate prøver for at undersøge enten kodning eller ikke-kodende RNA'er på grund af forskellen i biblioteket præparater. Dette kan føre til behovet for flere prøver, som kan øge tid, hjælpematerialer og dyrenes stress. Derudover kan det forårsage forskere til at beslutte at forberede prøverne for kun én analyse, normalt mRNA, begrænse antallet af biologiske spørgsmål, der kan undersøges. Dog span klarlægning flere klasser med regulerende roller at virkning mRNA udtryk. Fordi ncRNA er vigtige for grundlæggende biologiske processer og forstyrrelse af disse processer i under infektion, kan de derfor foretage attraktive mål for therapeutics. Dette håndskrift, viser en modificeret protokol for generation mRNA og ikke-kodende RNA udtryk biblioteker, herunder viral RNA, fra en enkelt prøve af fuldblod. Optimering af denne protokol, forbedret RNA renhed, øget ligatur for inddrivelse af methylerede RNA'er og udeladt størrelse udvælgelse, for at tillade fangst af flere arter, RNA.
Introduction
Næste generation sequencing (NGS) fremstod som et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af de ændringer, der opstår på genomisk niveau af biologiske organismer. Prøveforberedelse til NGS metoder kan varieres afhængigt af organismen, vævstype, og endnu vigtigere spørgsmål forskerne er ivrige efter at adresse. Mange undersøgelser har vist at NGS som et middel til at studere forskellene i genekspression mellem stater som raske og syge personer1,2,3,4. Sekventering tage sted på grundlag af samlede genom og giver mulighed for en forsker at fange mest, hvis ikke alle genomisk oplysninger for en bestemt genetiske markør på et tidspunkt punkt.
De mest almindelige markører ytringsfriheden observeret er messenger RNA'er (mRNAs). De mest anvendte procedurer for prepping biblioteker for RNA-seq er optimeret til genopretning af mRNA molekyler ved hjælp af en række purifications, opdelinger og ligations5,6. Dog beslutningen om hvordan en protokol er der skal udføres er stærkt afhængig af prøvetypen og spørgsmålene om nævnte stikprøve. I de fleste tilfælde er total RNA ekstraheret; men ikke alle RNA molekyler er af interesse og i sager som mRNA udtryk undersøgelser alt for rigelige RNA arter, som ribosomale RNA'er (rRNA) skal fjernes for at øge antallet af påviselige udskrifter tilknyttet mRNAs. De mest populære og udbredte metode til at fjerne de rigelige rRNA molekyler er reduktion af polyadenylated RNA udskrifter omtales som polyA udtømning7. Denne metode fungerer godt for analysen af mRNA udtryk da det ikke påvirker mRNA udskrifter. I undersøgelser, der er interesseret i ikke-kodende eller viral RNA'er, fjerner polyA udtynding også disse molekyler.
Mange undersøgelser vælger at fokusere på RNA sekvens bibliotek forberedelse at undersøge enten mRNA udtryk (kodning) eller en bestemt klasse af små eller store ikke-kodende RNA. Selv om der er andre procedurer8 som vores, der giver mulighed for den dobbelte prøveforberedelse, forberede mange undersøgelser biblioteker fra separate prøver på separate undersøgelser når det er tilgængeligt. For en undersøgelse som vores, ville dette normalt kræve flere blodprøver stigende tid, hjælpematerialer og dyrenes stress. Målet med vores undersøgelse var at bruge fuldblod fra dyr til at identificere og kvantificere de forskellige klasser af både mRNA og ikke-kodende RNA udtrykt mellem sund og højpatogen porcint reproduktions- og luftvejssyndrom virus (HP-PRRSV) udfordret svin9,10 trods kun en enkelt fuldblod prøve (2,5 mL) fra hvert svin. For at gøre dette, vi havde brug at optimere de typiske udvinding og bibliotek oprettelsen protokoller til at generere de relevante data til analyse af både mRNA og ikke-kodende RNA (ncRNA) udtryk11 fra en enkelt prøve.
Det fik brug for en protokol, der er tilladt for mRNA og ikke-kodende RNA analyse, fordi de tilgængelige standard kits og metoder til oprettelse af RNA-udvinding og bibliotek var hovedsageligt tiltænkt mRNA og bruge en poly-en udtynding trin12. Dette trin ville have gjort det umuligt at gendanne ikke-kodende RNA eller viral udskrifter fra prøven. Derfor, en optimeret metode var nødvendig at tilladt for total RNA udvinding uden prøve polyA udtynding. Metoden fremlægges i dette håndskrift er blevet optimeret til at tillade brugen af fuldblod som en prøvetypen og opbygge sekventering biblioteker for både mRNA og klarlægning af små og store størrelser. Metoden er blevet optimeret for at give mulighed for analyse af alle påviselige ikke-kodende RNA'er samt bevare viral RNA'er til senere undersøgelse13. I alt vores optimeret bibliotek forberedelse protokol giver mulighed for undersøgelse af flere RNA molekyler fra en enkelt hele blodprøve.
Det overordnede mål bag brugen af denne metode var at udvikle en proces, der er tilladt for samling af både ikke-kodende RNA og mRNA fra én prøve med fuldblod. Dette tillader os at have mRNA, ncRNA og viral RNA for hvert dyr i vores undersøgelse, stammer fra en enkelt prøve9. Dette, i sidste ende giver mulighed for mere videnskabelig opdagelse uden yderligere omkostninger til dyr og giver en mere komplet billede af udtryk for hver enkelt prøve. Den beskrevne metode giver mulighed for undersøgelse af regulatorer af genekspression samt giver mulighed for færdiggørelsen af korrelationsmaalinger undersøgelser sammenligning begge mRNA og ikke-kodende RNA udtryk ved hjælp af en enkelt hele blodprøve. Vores undersøgelse anvendes denne protokol til at undersøge ændringerne i genekspression og mulige epigenetiske lovgivere i viralt inficerede 9 - uger gamle mandlige kommercielle svin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animalske protokoller blev godkendt af National Animal sygdom Center (USDA-ARS-NADC) dyrs pleje og brug udvalget.
1. samling af svin blod prøver
- Indsamle blodprøver i RNA rør. Indsamle ~2.5 mL eller mere, hvis større indsamling rør er tilgængelige.
2. behandling af svin blod prøver
- Der centrifugeres blod rør på 5,020 x g i 10 min. ved stuetemperatur (15-25 ° C). Hvis behandlingen frosne prøver Inkuber rør ved stuetemperatur for et minimum af 2 h inden centrifugering.
- Fjern supernatanten og tilsæt 8 mL af RNase-fri vand til pellet. Luk og vortex pellet indtil det er synligt opløst. Der centrifugeres prøveglassene på 5,020 x g i 10 min. ved stuetemperatur til at inddrive pelleten. Kassér alle supernatanten og bevare pelleten.
3. økologisk udvinding for Total RNA og små RNA (miRNA isolering Kit)
- Begynde total RNA udvinding af pipettering 300 µL af bindende lysisbuffer at toerstoffet fra trin 2.2.
- Vortex og overførsel blandingen til en ny mærket 1,5 mL-centrifugerør. Tilføj 30 µL af homogenatet tilsætningsstof fra sættet. Vortex røret og sted i isbad i 10 min.
- Fjern røret og tilsæt 300 µL af syre-phenol: chloroform reagens fra sættet. Vortex røret til mix. Der centrifugeres ved 10.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt vandfasen (300-350 µL) til en frisk tube. Bemærk volumen til det næste trin.
4. samlede RNA isolering Procedure
- Baseret på mængden af vandige recovery (300-350 µL) tilføje 1,25 x volumen på 100% (~ 375 µL) ethanol til vandfasen. Bland prøven ved hjælp af en pipette.
- Set-up nye indsamling rør indeholdende et filterpatron for hver prøve. Pipette ~ 675 µL af lysate/ethanol blandingen på filter cartridge.
Bemærk: Læg ikke > 700 µL filterpatron ad gangen. For større mængder anvendelse i arvesagen. - Kort der centrifugeres (~ 15-20 s) på 10.000 x g at passere væske gennem filteret. Ikke spin hårdere end dette.
- Kassér flow gennem, og hvis det er nødvendigt, gentage centrifugering med de resterende lysate/ethanol blandingen indtil det har alle været anvendt. Bevare den samme filter patron og collection tube til næste skridt.
- Tilføje 700 µL af vask løsning 1 fra kit til filter cartridge og centrifugeres kort (~ 10 s) til at trække gennem filteret. Kassér flow gennem og bevare det samme filter patron og collection tube.
- Tilsættes 500 µL vaskeopløsning 2/3. Centrifuge at trække væske gennem filter cartridge. Kassér flow gennem. Gentag vask trin.
- Inthe samme rør, dreje filter cartridge en yderligere 60 s for at fjerne enhver resterende væske fra filteret. Overføre filter cartridge til en frisk collection tube.
- Tilføj 100 µL forvarmet (95 ° C) nukleasen-gratis vand til midten af filter cartridge. Spin for ca. 20-30 s bordplade centrifuge max hastighed.
Bemærk: RNA kan er indeholdt i eluatet og nu yderligere forarbejdes eller opbevares ved-20 ° C eller under. Berigelse for små RNA'er blev ikke udført.
5. globin reduktion (baseret på en protokol optimeret til svin hele blodprøver)14,15
Bemærk: Globin reduktion er foretaget, således at biblioteker ikke er overbefolket med læser kortlægning globin gener, som vil sænke antallet af læser kan tilknyttes andre gener af større interesse14,15 .
- Hybridisering med globin reduktion oligos
- Denaturere RNA (6 µg RNA prøven i maksimum 7 µL volumen) af pipettering udpakkede prøven i et 0,2 mL tyndvæggede nukleasen-fri reaktion rør og markedsføring i en termisk cycler ved 70 ° C i 2 min. Det er nøglen til is rør umiddelbart efter den første denature trin for optimal RNA kvalitet. Ingen DNase behandling er nødvendig.
- Mens rør cool forbereder en 400 µL af 10 x globin reduktion oligo mix: 100 µL af to HBA oligos (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3', og 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3') på 30 µM, to Ulla oligos (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3', og 5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3') på 120 µM per reaktion, der giver en endelig koncentration på 7,5 µM HBA oligos og 30 µM Ulla oligos. Forberede 10 x oligo hybridisering buffer: 100 mM Tris-HCL, pH 7,6; 200 mM KCl.
- Forberede hybridisering mix: 6 µg RNA prøve (maksimalt 7 µL volumen), 2 µL af de 400 µL af 10 x globin reduktion oligo mix (slutkoncentration 2 X), 1 µL af 10 x oligo hybridisering buffer (slutkoncentration 1 x). Tilføje nukleasen-gratis vand til en endelige mængden af 10 µL.
- Sæt thermocycler på 70 ° C i 5 min. Cool straks til 4 ° C og Fortsæt til RNase H fordøjelsen.
- RNase H fordøjelsen
- Fortynde 10 x RNase H (10 U / µL) til 1 x RNase H med 1 x RNase H buffer.
Bemærk: RNase buffer kommer på 10 x og skal fortyndes med 1 x RNase H buffer til 1 x før anvendelsen. - Forberede RNase H mastermix ved at kombinere: 2 µL af 10 x RNase buffer, 1 µL af RNase hæmmer i 2 µL 1 x RNase H og 5 µL af nukleasen-gratis vand til en total volume 10 µL.
- Blandes grundigt Globin reduktion hybridisering prøver med 10 µL af RNase H mastermix og fordøje ved 37 ° C i 10 min. Cool til 4 ° C.
- Stopper fordøjelsen ved tilsætning af 1.0 µL af 0,5 M EDTA til hver prøve og gå straks til trinnet oprydning.
- Fortynde 10 x RNase H (10 U / µL) til 1 x RNase H med 1 x RNase H buffer.
- RNase H-behandlede Total RNA oprydning.
- Rense RNase H behandlet RNA ved hjælp af en silica-membran-baserede eluering rensning oprydning kit ifølge producentens anvisninger. Premix buffere: For mild vask buffer, tilføje 44 mL 100% ethanol.
- Ikke overføre prøven til et nyt rør. Tilsættes 80 µL af RNase-fri vand og 350 µL af lysisbuffer. Tilføje 250 µL af 100% ethanol til den fortyndede RNA og bland godt ved pipettering.
Bemærk: Ikke centrifugeres. Fortsætte straks at træde 5.3.3. - Nu overføre 700 µL prøven til et eluering filterpatron anbringes i et 2 mL collection tube at indsamle flow gennem. Der centrifugeres i 15 s ≥ 8.000 x g. Kassér gennemstrømnings.
- Gentag dette ved at placere eluering filterpatron ind i et nyt 2 mL indsamling rør. Tilsæt 500 µL af mild vask buffer til filterpatron og centrifugeres i 15 s ≥ 8.000 x g for at vaske filter cartridge membranen. Kassér gennemstrømnings. Genbruge collection tube taktfast 5.3.5.
- Nu bruger den samme prøveglas, tilføje et andet 500 µL 80% ethanol til filter cartridge. Denne gang centrifugeres tube for 2 min på ≥ 8.000 x g. Indsamle kolonnen eluering spin for det næste skridt og kassér både gennemstrømning og collection tube.
- Sætte eluering filterpatron fra det sidste trin i et nyt 2 mL collection tube. Forlade låget åbnes på filterpatron og centrifugeres ved fuld hastighed i 5 min at tørre spin kolonne membran og forhindre ethanol fremførsel. Kassér gennemstrømning og collection tuben.
Bemærk: For at undgå skader vinkel låg at pege i en retning modsat, at af rotoren. - Tag den tørrede filterpatron og sted i en ny 1,5 mL collection tube. Tilføje 14 µL af RNase-fri vand til at filtrere patron membran og sørg for at tilføje RNase-fri vandet direkte til centrum. Der centrifugeres i 60 s i fuld fart at eluere RNA.
- Vurdere kvaliteten af globin-reduceret RNA prøver (trin 6). Fortsæt til mRNA Prøveforberedelse (trin 7) og små RNA bibliotek forberedelse (trin 8)16,17.
Bemærk: Globin-reduceret RNA prøver kan nu opbevares ved-20 ° C, men opbevaring ved-80 ° C anbefales for langsigtet bevaring.
6. vurdering af RNA
- Kvantificere RNA koncentration ved hjælp af et spektrofotometer. Undersøge bølgelængde forholdet mellem 260 og 280 nm. Nøgletal på ~ 2 eller mere betragtes som ren for RNA og lavere værdier angiver nogle forurening. Instrumentet bruger dette forhold til at bestemme RNA fusion som ng/µL.
- Vurdere RNA kvalitet ved hjælp af 1 µL (100 ng) af prøven på en passende chip. Slutproduktet skal være et RIN ~ 2 eller højere og et højdepunkt på ~ 280 nt til mRNA enkelt læse biblioteker; små RNA biblioteker toppe på 143 svarer til miRNAs.
7. strandede Total RNA prøveforberedelse til mRNA og lang ncRNA biblioteker. 16
- Bemærk: Bringe eluering buffer og rRNA fjernelse perler til stuetemperatur. Pre label 0,2 ml tyndvæggede PCR rør (plader kan også bruges). Protokollen trin baseret på producentens instruktioner16.
- Start med 4 µL af globin-reduceret RNA. Tilsæt 6 µL nukleasen-gratis vand, 5 µL af rRNA binding buffer og 5 µL af rRNA fjernelse mix pr tube (1st tube). Med pipette overfoeres til at blande og re-cap. Sted i thermocycler med 100 ° C opvarmet låg i 5 min på 68° C. Fjern og henstår ved stuetemperatur for 60 s.
- Resuspend rRNA fjernelse perler af vortex; tilføje 35 µL af perler til nye (2nd) PCR rør og afpipetteres prøve fra 1st rør på perler i de 2nd rør. Inkuber 2nd PCR rør ved stuetemperatur i 3 min. Placer den magnetiske stativet i 7 min.
Bemærk: Bland hver prøve grundigt af pipettering for optimal rRNA udtømning. Hæve/sænkning tube i standen kan hjælpe fremskynde adskillelse proces. - Overførsel supernatanten fra 2nd PCR rør til matchende 3rd PCR rør og plads til den magnetiske står for et minimum af 60 s. Gentag overførsel til en ny PCR rør kun hvis perlerne ikke er flyttet til tube sider.
- Mix prøve rensning perler af vortex; tilføje 99 µL til hver 3rd PCR rør. Gør det muligt for at sidde ved stuetemperatur i 15 min. sted på magnetisk stå i 5 min. sikre perler flyttes til siderne. Pipette til supernatanten.
- Hold 3rd tube indstillet på magnetisk stand. Tilføje 200 µL af 70% ethanol, samtidig med at være omhyggelig med ikke at mase perlerne. Lad det sidde i mindst 30 s og pipette til supernatanten. Gentag trin.
- Tillad prøven tørres ved stuetemperatur i 15 min. på den magnetiske stand. Centrifugeres kit eluering buffer for 5 s på 600 x g. Fjerne tube og tilføje 11 µL af eluering buffer blandes grundigt. Der inkuberes i 2 min på bænken så mindst 5 min på den magnetiske stå ved stuetemperatur.
- Overføre 8,5 µL af supernatanten fra de 3rd til en ny (4th) PCR rør. Tilføje 8,5 µL af Prime-Elute-Fragment høj mix fra sættet. Bland godt. Cap og sted i en thermocycler med forvarmet låg for 8 min på 94 ° C, hold ved 4 ° C. Fjerne og centrifugeres kort.
- Syntetisere første streng cDNA
- Give første strand syntese mix fra kit til at komme til stuetemperatur og centrifugeres ved 600 × g for 5 s. overføre 50 µL af reverse transkriptase i første strand syntese blandingen. Reverse transkriptase kan føjes til første strand syntese i forholdet 1:9.
- Med pipette udtages 8 µL af den kombinerede reverse transkriptase/første strand syntese mix ind i 4. røret med prøve. Cap og centrifugeres 600 x g i 5 s. sted i thermocycler med forvarmet låg på 100 ° C. Køres til: 10 min. ved 25 ° C, 15 min på 42 ° C, 15 min. ved 70 ° C, derefter hvile ved 4 ° C. Endelige volumen er ~ 25 µL pr. brønd. Flyt straks til næste trin.
- Syntetisere anden streng cDNA
- Bringe ende reparation reagens (ERR) og anden Strand Mix (SSM) til stuetemperatur, og der centrifugeres ved 600 x g for 5 s. Mix ERR med resuspension buffer på 1:50 fortynding. Tag hætten 4th rør og tilsæt 5 µL fortyndede ERR og 20 µL af SSM til hver; Pipette til bland godt. Endelige volumen ~ 50 µL ds cDNA.
- Cap og Inkuber i thermocycler i 1 time ved 16 ° C. Når den er færdigafkølet, fjerne caps og giver mulighed for at komme til stuetemperatur på bænk toppen.
- DS cDNA oprydning trin
- Begynder ved at blande Solid fase Reversible immobilisering (SPRI) Paramagnetiske perler af vortex. Overføre 90 µL af perlerne til prøven i 4thrøret (ds cDNA) og blandes. Endelige volumen er 140 µL. Tillad rør til at sidde ved stuetemperatur i 15 min. Ruger på magnetisk står for ~ 5 min. Fjern ~ 135 µL af supernatanten fra hver brønd. Der bør 5 µL tilbage i hver brønd.
- Forlader røret på den magnetiske stå og vaske ved at tilføje 200 µL 80% ethanol. Lad det sidde i 30 s så fjern og kassér supernatanten. Gentag vask trin. Forlade rør på den magnetiske står for 15 min at tørre.
- Centrifugeres resuspension buffer på 600 x g for 5 s efter kommer til stuetemperatur. Fjerne rør fra standby. Overføre 17,5 µL af resuspension buffer til glasset og bland. Lad rør Ruger på bænk toppen for 2 min og derefter flytte til magnetiske stå i 5 min.
- Der afpipetteres 15 µL af supernatanten indeholdende ds cDNA prøver nye sat af (5th) 0,2 mL tyndvæggede rør. Flytte til næste trin hurtigt eller forsegle og opbevar ved-15 ° C og 25 ° C i mere end 7 dage.
- Adenylate 3' ender.
- Der afpipetteres 2,5 µL af stuetemperatur resuspension buffer i prøveglas derefter tilføje 12,5 µL af optøede A-hale mix. Bland helt af pipettering.
Bemærk: Ingen A-hale kontrol anvendes. - Cap og inkuberes i en thermocycler med 100 ° C forvarmet låg. Kør ved 37 ° C i 30 min., derefter ved 70 ° C i 5 min med opvarmede låg. Tillade thermocycler at hvile på 4 ° C.
- Der afpipetteres 2,5 µL af stuetemperatur resuspension buffer i prøveglas derefter tilføje 12,5 µL af optøede A-hale mix. Bland helt af pipettering.
- Ligate indeks adaptere
- Bringe RNA adapter rør og stoppe ligatur Buffer blandingen til stuetemperatur. For hver, der centrifugeres ved 600 x g for 5 s. orlov ligatur mix i fryseren indtil klar til brug. Prøven pooling arrangement til indeksering skal være kendt.
- Tilføje 2,5 µL af resuspension buffer og 2,5 µL af ligatur mix til hvert prøveglas. Nu afpipetteres i 2,5 µL af den korrekte RNA-adapter i hvert prøveglas. Adapter udvalg bør udføres af producentens instruktioner for den valgte kit.
- Opsummere og blandes ved centrifugering i 1 min på 280 x g. Inkuber i et termisk cycler i 10 min ved 30 ° C. Tilføj 5 µL af stoppe ligatur Buffer til at prøve at standse reaktionen og bland godt.
- Begynd oprydning ved at blande SPRI Paramagnetiske perler af vortex for 60 s. overføre 42 µL af perler til hver tube. Mix thoroughlythen inkuberes i 15 min på bænk toppen.
- Flytte rør til magnetiske stå og lade indtil flydende slår klart (~ 5 min). Endnu en gang klart Fjern og kassér 79,5 µL af supernatanten. Forlade rør på den magnetiske stå og vaske ved at tilføje 200 µL 80% ethanol. Lad det sidde i mindst 30 s så fjern og kassér supernatanten. Gentag vask trin. Forlade på magnetisk står for yderligere ~ 15 min til tørring. Ikke forstyrre perler under vask trin.
- Tilføje 52,5 µL af resuspension buffer til prøveglas og bland indtil perlerne er helt re suspenderet. Der inkuberes i 2 min på bænk toppen. Flyt prøveglas tilbage til magnetiske stå indtil væsken er klar (~ 5 min).
- Forlade på stativ og forsigtigt afpipetteres 50 µL af supernatanten til nye (6th) rør. Tilsæt 50 µL af vortexed SPRI perler. Tillad for at udruge på bænk toppen i 15 min.
- Flytte til magnetiske stå og lad pladen forblive indtil flydende slår klart (~ 5 min). Kassér 95 µL af supernatanten forlader 5 µL i hver tube.
- Forlade rør på magnetisk stå og vaske ved at tilføje 200 µL 80% ethanol. Give røret til at sidde i 30 s derefter fjerne og kassere supernatanten. Gentag vask. Lad rør tørre magnetiske stativet i 15 min.
- Tilføj i 22,5 µL af resuspension buffer og bland indtil perlerne er suspenderet. Ruger på bænken for 2 min og derefter flytte til magnetiske stå indtil flydende slår klart (~ 5 min). Med pipette overfoeres 20 µL af prøven til nye PCR rør (7th).
- Bringe nødvendige kit komponenter til stuetemperatur. Overføre 5 µL PCR primer mix og 25 µL PCR master mix fra kit til at prøve (7th PCR rør) som indeholder indekserede prøver. Bland prøven og cap tube.
- Sted rør ind termisk cycler med forvarmet låg. Kør program: 98 ° C til 30 s, så 15 cyklusser af 98 ° C til 10 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s, 72 ° C i 5 min. Hold ved 4 ° C.
- Rydde op prøver ved at tilføje 50 µL af tilstrækkeligt blandet SPRI perler at prøve tube og afpipetteres at kombinere. Tillad reaktion at udruge ovenpå bænk i 15 min.
- Flytte røret til en magnetisk stå og inkuberes indtil flydende slår klart (~ 5 min). Kassér 95 µL af supernatanten forlader 5 µL i hver tube.
- Forlade tube på magnetisk stå og vaske ved at tilføje 200 µL 80% ethanol. Lad det sidde i mindst 30 s og derefter fjerne og kassere supernatanten. Gentag trinnet vask. Forlade magnetiske stativet i 15 min at tørre.
- Tilføj i 32,5 µL af resuspension buffer og bland indtil perlerne er helt re suspenderet. Ruger på bænken for 2 min og derefter flytte til magnetiske stå indtil flydende slår klart (~ 5 min). Med pipette udtages 30 µL af prøven fra hvert rør ind i en ny PCR rør.
- Vurdere DNA mængde og kvalitet ved at gentage trin 6.1 og 6.2 med passende chip. Videre at samle trin (trin 9).
8. lille RNA bibliotek forberedelse til sncRNAs. 17
Bemærk: Protokol trin baseret på producentens instruktioner17.
- Start små RNA bibliotek prep med ~ 220 ng - ~1.1 µg / µL af globin-reduceret RNA prøver (4 µL).
- Adapter ligatur
- Ligate 3'-adapter ved at blande grundigt 1 µL af adapter, 2 µL af nukleasen-gratis vand og 4 µL af globin-reduceret RNA prøve. Der inkuberes ved 70 ° C i 2 min. og derefter straks sted på is.
- Tilsæt 10 µL af 2 x ligatur buffer, og 3 µL af ligatur enzym blanding, blandes og inkuberes 16 ° C i 18 h.
Bemærk: Stigning prøve inkubationstiden til 18 timer ved en lavere temperatur på 16 ° C anbefales for studier interesseret i methylerede RNA arter, såsom piwi RNA'er. Den længere inkubationstiden giver mulighed for større ligatur effektivitet på grund af klassen af ændringer i 3' adapter ligatur fase. - Tilføje 1 µL af reverse transkription primer i 4,5 µL nukleasen-gratis vand til ligatur blandingen for at forhindre adapter-dimer dannelsen af overskydende 3' adapter.
- Der inkuberes i en forvarmet termisk cycler programmeret i 5 min ved 75 ° C, 15 minutter ved 37 ° C, 15 minutter ved 25 ° C, og holde ved 4° C.
- Denaturere 1 µL af forud fortyndede 5'-adapter per prøve i et termisk cycler ved 70 ° C i 2 min. og derefter straks sted på is.
- Tilføj 1 µL af denatureret 5'-adapter, 1 µL af 10 x 5' ligatur buffer og 2,5 µL af 5' ligatur enzym. Blandes og inkuberes 25 ° C i 1 time.
- cDNA syntese og forstærkning
- Blandes grundigt ved pipettering 30 µL af 5 ' / 3 '-adapter-forbundet RNA, 8 µL af første-strand buffer, 1 µL af RNase inhibitor og 1 µL af reverse transkriptase. Inkuber blanding ved 50 ° C til 60 min. Fortsæt straks til PCR-amplifikation eller varme inaktivere reaktion ved 70 ° C i 15 min og opbevares ved-20 ° C.
- PCR forstærke de 40 µL af Reverse transkriptase reaktion ved at tilføje 50 µL PCR master mix, 2,5 µL af RNA PCR primer, tilføje 2,5 µL af udpegede RNA PCR Primer indeks til prøven, og nukleasen-gratis vand til et volumen på 100 µL. Mix af pipettering. Køre PCR i den termiske cycler ved hjælp af følgende cykling betingelser: indledende denaturering på 94 ° C til 30 s; 11 cyklusser af 94 ° C til 15 s, udglødning ved 62 ° C til 30 s og udvidelse ved 70 ° C i 15 s; efterfulgt af en sidste udvidelse ved 70 ° C i 5 min; prøver kan afholdes ved 4 ° C i cycler.
- Bemærk: Indeks er tilføjet til formålet med stikprøven pooling.
- Prøve oprydning
- Tilføj 500 µL af binding buffer fra DNA oprydning kit (5 M Gu-HCl, 30% isopropanol) til de 100 µL PCR forstærket prøve hen til muliggøre effektiv binding til spin-kolonne membran.
Bemærk: Hvis binding buffer har pH indikator inkluderet kontrollere, at farven på blandingen er gul. - Pipette 600 µL blanding af prøven og binding buffer ind i en filterpatron inde i et 2 mL collection tube, spin for 30-60 s på 17,900 x g i en bordplade centrifuge. Kassér gennemstrømning.
- Vaske filter cartridge ind i den samme samling rør med 0,75 mL af kit leveres vaskebuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 80% ethanol) ved spinning for 30-60 s på 17,900 x g i en bordplade centrifuge og kassere flowet-gennem. Spin den filter cartridge tør for en yderligere 60 s.
- Placer filter cartridge i en ren 1,5 mL collection tube. Tilføj 30 µL af eluering buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,5), lad kolonnen henstår i 60 s, og derefter spin for 60 s på 17,900 x g i en bordplade centrifuge.
- Tilføj 500 µL af binding buffer fra DNA oprydning kit (5 M Gu-HCl, 30% isopropanol) til de 100 µL PCR forstærket prøve hen til muliggøre effektiv binding til spin-kolonne membran.
- Vurdere prøve kvalitet ved at gentage trin 6.1 og 6.2 med den relevante DNA-chip. Flytte til pooling trin (trin 9).
9. prøve pooling til sekvensering
- Pool barcoded og QC'ed prøver af opsætning og mærkning nye rør (eller en 96 godt PCR plade) skal indeholde enten mRNA eller ncRNA prøver. Overføre 13 µL af hver barcoded 10nM bibliotek til tilsvarende rør (eller brønde i den nye plade) pr. producentens instruktioner16,17. Indsende poolede prøver til sekvensering, være sikker på at vælge lignende Læs længder, hvis prøver skal køres på samme chip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De repræsentative prøver i vores undersøgelse er globin og ribo-forarmet hele blodprøver. Repræsentative resultatet af protokollen består af en globin forarmet bibliotek prøve med en RNA integritet tal (RIN) over 7 (figur 1en) og 260/280 nm koncentration nøgletal på eller over 2 (figur 1b og 1 c). Validering af prøven resultatet blev udført ved hjælp af spektrofotometret for at give den endelige koncentration af hvert bibliotek og chip-baserede elektroforese give RIN antallet samt en graf af toppe, der viser, hvilke molekyler (mRNA eller ncRNA) var fanget baseret på Indsæt størrelse i biblioteket prøven før gruppering og sekventering. For den aktuelle undersøgelse var fokus på mRNA og små klarlægning kun. For mRNA biblioteker repræsentative resultatet er en elektroferogrammet peak på ~ 280 bp (fig. 1d). For den lille klarlægning repræsentant resultater består af en vifte af toppe fra ~ 100-400 bp (figur 1e), med toppe på ~ 143 og ~ 153 bp svarer til miRNAs og piRNAs, henholdsvis. Vores prøveresultater viste, at vores optimeret teknik resulterede i biblioteker med RIN numre, der spænder fra 6.3 (optimale) til 9.2 (over optimal). Dette viste sig for at være en forbedring i forhold til andre undersøgelser, der anvendte globin udtynding metoder og var kun i stand til at opnå RIN numre på eller i nærheden af 6. Chip-baserede elektroforese resultater viste også, at fra en enkelt blodprøve er det muligt at opnå RNA-molekyle erobringen af toppe der repræsenterer både mRNA og ncRNA (figur 1 d og 1e), og Indsæt stikprøvestørrelser, der omfattede både små og store ikke-kodende RNA molekyler. Disse resultater er repræsentative for de optimale RIN scores og indsætte størrelser behov for at sikre kvalitet udskrift læser kan sekventeret fra de forberedte biblioteker for næsten alle NGS RNA-seq platforme.
Figur 1 : Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1b : Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1 c : Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1 d : Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1e : Repræsentant resultater af mRNA og ikke-kodende RNA udtryk biblioteker fra enkeltprøver af hele svineblod. a en elektroforese fil køre sammenfattende repræsentation af RIN numre før globin reduktion og efter globin reduktion. Repræsentant elektroferogrammer (b) før globin reduktion og (c) efter globin reduktion af en enkelt svin hele blodprøve. (d) repræsentant elektroferogrammer globin og ribo-forarmet fuldblod mRNA bibliotek prøver før gruppering og sekventering. (e) repræsentant elektroferogrammer af globin forarmet sncRNA fuldblod biblioteker af de samme prøver featured i panelet d før gruppering og sekventering venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det første vigtige skridt i den protokol, der gjorde det optimeret inkluderet ekstra globin udtynding trin, som gjorde det muligt at få kvalitet læsninger fra hele blodprøver. En af de største begrænsninger på ved hjælp af fuldblod i sekventering undersøgelser er det høje antal læsninger i stikprøven, vil knytte til globin molekyler og reducere de læser, der kan knyttes til andre molekyler af interesse18. Derfor, i optimering af protokollen for vores prøvetype, vi havde brug at indarbejde en globin udtynding skridt for at sikre den højest mulige mRNA og ikke-kodende RNA fange gennem sekventering. Alle prøverne var globin forarmet konto for høje niveauer af globin udskrifter ved hjælp af svin bestemt hæmoglobin A og B (HBA og Ulla) oligonukleotider baseret på proceduren fra Choi et al., 201414. Et andet vigtigt skridt var brugen af en ribo-udtynding udvinding kit, som tilladt for mulighed for fjerne uønskede RNA molekyler fra vores prøver samtidig samtidig bevare polyadenylated ikke-kodende og viral RNA molekyler af eksperimentel interesse inden for vores biblioteker til sekvensering19. Derudover var vi kunne arbejde med enkelt prøver at skabe både kodning (mRNA) og ikke-kodende (små og lange) RNA biblioteker ved at fjerne de små RNA berigelse og størrelse udvælgelse skridt. Ved at gøre dette, var vi i stand til at maksimere RNA delprøver til gruppering og garantere sendte vi nok volumen til at give til sekvensering. Optimering af alle producentens protokoller blev gjort for at øge mRNA og ikke-kodende RNA recovery for downstream bibliotek oprettelsen. Vi også optimeret ikke-kodende RNA bibliotek forberedelse for de små ikke-kodende RNA del af vores downstream analyse ved at føje yderligere tid til PCR inkubation pr. producenter vejledningen at øge methylerede RNA'er ligatur effektivitet og sandsynligheden for at inddrive piwi-RNA'er.
Begrænsningerne af den optimerede protokol har rod i manglende specificitet, der også gør det ideelt for flere analyser fra en enkelt prøve. Ved at fjerne berigelse og størrelse udvælgelse dele af ikke-kodende RNA bibliotek forberedelse, begrænser vi roman små RNA opdagelse20 for at afbalancere det mod erhverve både lille og længe ikke-kodende RNA molekyler. Derfor, den optimerede protokol giver et godt overblik over typerne af ikke-kodende udtryk, men kræver ekstra forarbejdning i den analytiske fase af mapping at få mere specifikke oplysninger om klasserne og størrelser af ikke-kodende RNA udtryk fanget i den prøven. En anden begrænsning til metoden er på grund af indlemmelse globin udtynding skridt, som vil sænke den samlede RIN numre. Vi var i stand til at foretage fejlfinding af dette første undersøge RIN numrene før og efter globin udtynding til at forstå, hvor stor en reduktion i RNA integritet vi ville opleve. Det gav resultater, der viste vi kunne opleve et fald på ~ 1-2 point. For at tage hensyn til dette fald optimeret vi yderligere globin udtynding protokol til 6 µg prøve i stedet for de anbefalede 10 µg. Dette hjalp med at forbedre vores RIN numre samt spare på prøve. Derudover vi også brugte tyndvæggede microamp reaktion rør og iced rør umiddelbart efter den første denaturering skridt. Dette tillod os at slukke den hurtigere reaktion, giver mulighed for forbedrede RIN numre på globin forarmet prøver.
Den ændrede protokol, der bruges i denne undersøgelse har flere fordele sammenlignet med base bibliotek forberedelse metoder, der anvendes i andre undersøgelser, hvor kun mRNA eller ikke-kodende RNA undersøges separat. De ændringer, vi har foretaget for optimering tilladt for effektiv udnyttelse af fuldblod som vores prøvetypen. Dette er fordelagtigt for fremtidige undersøgelser fordi fuldblod som en prøvetypen har mindre skridt for indsamling og behandling end leukocyt del af blod. Derudover fuldblod også har tilføjet fordelene ved at tillade forskere undersøge Systemiske reaktioner og gentagne gange kan afhentes fra dyret. Men der er en advarsel til brugen af fuldblod prøver i, at mængden af blod indsamlet er afhængig af alder og størrelsen af de pågældende organismer. Mindre mængder af blod vil føre til lavere RNA udbytter, men metoden, der præsenteres her tillader dobbelt bibliotek skabelse fra mindst 2,5 mL fuldblod. Dette tilladt os at bruge én prøve at undersøge både mRNA og ikke-kodende udtryk og korrelere både til en person på et øjebliksbillede i tid, effektivt at lade os indsamle flere oplysninger end traditionelle bibliotek præparationsmetoder. Også, ved at udføre ribo-udtynding vi gjort det muligt at reducere udskrifter, der kan nedbryder sekventering læser, samtidig stadig bevare de ikke-kodende og viral udskrifter, der kan gå tabt under oprettelsen af traditionelle bibliotek at studere mRNA. På denne måde tredobler vores optimeret protokol mængden af oplysninger, der kan vindes ved en enkelt prøve. Andre væsentlige ændringer vi gjort til metoden til at lette erobringen af flere RNA arter oplysninger var: ændring af typen af PCR plade til hurtigt standse den reaktion, som forbedret RNA renhed udbytte; et længere thermocycler inkubation at øge ligatur for mulige genopretning af methylerede RNA'er; og ikke ansætte en størrelse udvælgelse gel, Tillad for alle påviselige klarlægning identificeret uanset længde. Til downstream analyse tilladt dette for erobringen af flere ikke-kodende RNA'er mellem 18nt-200nt i længden.
Ved at ansætte denne optimerede metode, var vores gruppe i stand til at fremlægge en protokol, der kan anvendes til fuldblod transkriptom analyser og give mulighed for mRNA og ikke-kodende RNA fra en enkelt prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne artikel er udelukkende til brug for specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af US Department of Agriculture. USDA er en udbyder af lige muligheder og arbejdsgiver.
Acknowledgments
Dette arbejde var primært støttet af den af USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, og dels af USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Denne undersøgelse var delvist understøttet af en aftale i landbruget forskning Service forskning deltagelse programmet administreres af Oak Ridge Institut for videnskab og uddannelse (ORISE) gennem en tværinstitutionelle aftale mellem os Department of Energy ( DOE) og US Department of Agriculture. ORISE er forvaltes af Oak Ridge associeret universiteter under DOE kontrakt ikke. DE-AC05-06OR2310.
Vi vil gerne takke Dr. Kay Faaberg for HP-PRRSV smitsomme kloner, Dr. Susan Brockmeier for hendes hjælp dyrene involveret i eksperimentet og Sue Ohlendorf for sekretærservice bistand under forberedelse af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase - free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase - free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
References
- Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
- Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
- Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
- Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf (2015).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).
- Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
- Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
- Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
- Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
- Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf (2007).
- TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
- New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018).
- Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).
