Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Идентификация и кодирования кодирование классы РНК выражена в свином цельной крови

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58689
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, 2ORAU/ORISE

Summary

Здесь мы представляем протокол, оптимизированный для обработки кодирования (мРНК), и -кодирования (ncRNA) Глобин снижена РНК seq библиотек из одного состава крови.

Abstract

Появление новаторских и более мощный следующего поколения последовательности методов открыла новые направления в способности для изучения базовых экспрессии генов, связанных с биологическими процессами интерес. Эти нововведения позволяют не только исследователи соблюдать выражение из последовательности мРНК, которые код для генов клеточную функцию этот эффект, но также молекулы РНК (ncRNA)-кодирования, которые остаются без перевода, но все еще имеют функции регулирования. Хотя исследователи имеют возможность наблюдать за выражение mRNA и ncRNA, он был обычным для исследования сосредоточиться на одной или другой. Однако когда исследования заинтересованы экспрессии мРНК и ncRNA, во много раз они используют отдельные образцы для изучения кодирования или некодирующих РНК за счет разницы в библиотеке препаратов. Это может привести к необходимости более образцов, которые может увеличить время, расходных материалов и животных стресс. Кроме того это может привести к исследователи решили подготовить образцы для анализа только один, обычно мРНК, ограничивая количество биологических вопросов, которые могут быть исследованы. Однако ncRNAs охватывают несколько классов с нормативной роли это выражение mRNA эффект. Потому что во время инфекции являются важными для основных биологических процессов и расстройство этих процессов в ncRNA, они могут таким образом, сделать привлекательной цели для терапии. Эта рукопись демонстрирует изменение протокола для поколения мРНК и некодирующих РНК выражение библиотек, в том числе вирусной РНК, от одного образца цельной крови. Оптимизации этого протокола, улучшение чистоты РНК, увеличение перевязки для восстановления метилированной РНК и опустить выбор размера, чтобы разрешить захват более видов РНК.

Introduction

Следующего поколения последовательности (НГС) стала мощным инструментом для изучения изменений, которые происходят на уровне генома биологических организмов. Пробоподготовка для NGS методы можно варьировать в зависимости от организма, тип ткани, и что более важно вопросы исследователи стремятся адрес. Многие исследования обратились к NGS как средство изучения различий в экспрессии генов между государствами таких здоровых и больных лиц1,2,3,4. Последовательности занять место на основе всего генома и позволяет исследователь захватить наиболее, если не все, геномной информации для конкретного генетический маркер в то время.

Наиболее распространенными маркеры выражения наблюдается являются Посланник РНК (мРНК). Наиболее часто используемые процедуры prepping библиотек для РНК seq оптимизированы для восстановления молекул мРНК с помощью серии очищения, образовавшиеся и перешнуровок5,6. Однако решение о том, как протокол будет выполняться полагается на образец типа и вопросы о сказал образца. В большинстве случаев всего РНК добывается; Тем не менее не все молекулы РНК представляют интерес и в тех случаях, таких как исследования выражение mRNA чрезмерно обильные видов РНК, как рибосомная РНК (рРНК) должны быть удалены, чтобы увеличить количество обнаруживаемых стенограммы, связанные с мРНК. Наиболее популярным и широко используемым методом для удаления обильные молекул рРНК является сокращение polyadenylated РНК стенограммы, именуемый поля истощения7. Этот подход хорошо работает для анализа экспрессии мРНК, он не влияет на мРНК стенограммы. Однако в исследованиях, которые заинтересованы в некодирующих или вирусной РНК, истощение поля также удаляет эти молекулы.

Многие исследования решили сосредоточиться на подготовке библиотеки РНК последовательности изучить либо выражение mRNA (кодирование) или определенного класса малых или больших РНК-кодирования. Хотя есть другие процедуры8 , как наша, которые позволяют для двойной пробоподготовки, многие исследования готовиться отдельные исследования при наличии библиотек от отдельных образцов. Для исследования, как наша это обычно требуется несколько образцов крови увеличение времени, расходных материалов и животных стресс. Целью нашего исследования было чтобы иметь возможность использовать цельную кровь от животных для выявления и количественной оценки различных классов обоих мРНК и выразил РНК-кодирования между здоровым и высоко патогенного репродуктивно и вирус атипичной пневмонии (HP-PRRSV) оспорено свиней9,10 несмотря на наличие только одного состава крови (2,5 мл) от каждой свиньи. Чтобы сделать это, нам необходимо оптимизировать типичная добыча и протоколы создание библиотеки для создания правильных данных для анализа мРНК и некодирующих РНК (ncRNA) выражение11 от одного образца.

Это вызвало необходимость в протоколе, который позволил мРНК и анализа РНК-кодирования потому что доступны стандартные комплекты и методов для создания РНК добыча и библиотека были предназначены главным образом для мРНК и использовать поли А слоя шаг12. Этот шаг было бы невозможно восстановить некодирующих РНК или вирусный стенограммы из образца. Поэтому было необходимо оптимизированный метод что позволило общее извлечение RNA без истощения поля образец. Метод, представленный в этой рукописи была оптимизирована для использования цельной крови в качестве образца типа и для построения библиотек последовательность мРНК и ncRNAs малых и больших размеров. Этот метод был оптимизирован для анализа всех обнаружить РНК-кодирования, а также сохранить вирусной РНК для последующего расследования13. Во всех наши оптимизированные библиотеки подготовка протокол предусматривает расследование нескольких молекул РНК из одной цельной крови образца.

Общая цель за использование этого метода было разработать процесс, который позволил для коллекции некодирующих РНК и мРНК из одной пробы цельной крови. Это позволяет нам иметь мРНК, ncRNA и вирусной РНК для каждого животного в нашем исследовании, получены от одного образца9. Это, в конечном счете, позволяет более научное открытие без дополнительных затрат животных и дает более полную картину выражение каждого индивидуального образца. Описан метод позволяет для изучения регуляторов экспрессии генов, а также позволяет для завершения корреляционного исследования, сравнивающие оба мРНК и некодирующих РНК выражение с помощью одного состава крови. Наши исследования использовали этот протокол для изучения изменения в экспрессии генов и возможных эпигеномные регуляторы в вирусно зараженных 9 - неделя старый коммерческих хряков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Животных протоколы были утверждены Национальным животных заболеваний центр (USDA-ARS-NADC) животное уход и использование Комитетом.

1. сбор свиной крови образцов

  1. Соберите образцы крови в РНК трубы. Соберите ~2.5 mL или больше, если большие коллекции трубки доступны.

2. обработка свиной крови образцов

  1. Центрифуга трубки крови в 5020 x g 10 мин при комнатной температуре (15-25 ° C). Если обработка замороженных образцов инкубировать трубки при комнатной температуре для минимум 2 ч перед центрифугированием.
  2. Удалить супернатант и добавить 8 мл РНКазы свободной воды в гранулы. Закрыть и вихревой Пелле, пока он явно не растворится. Центрифуга пробоотборные трубки в 5020 x g 10 мин при комнатной температуре для восстановления гранулы. Отменить все супернатант и сохранения гранулы.

3. органические извлечения для всего РНК и малые РНК (miRNA изоляции комплект)

  1. Начинают общее извлечение RNA, дозирования 300 мкл буфера lysis привязки гранулы из шага 2.2.
  2. Вихрь и передача смеси к новой маркировкой 1,5 мл пластиковых пробирок. 30 мкл огневки добавка, из комплекта. Вихревой трубе и место на льду за 10 мин.
  3. Снять трубку и 300 мкл кислоты фенола: хлороформ реагент из комплекта. Вихревой трубе смеси. Центрифуга на 10000 x g 5 мин при комнатной температуре.
  4. Осторожно удалите водной фазе (300-350 мкл) в свежих трубку. Обратите внимание на объем для следующего шага.

4. Общая РНК процедура изоляции

  1. На основании количество водных восстановления (300-350 мкл) добавить 1,25 x объем 100% (~ 375 мкл) этанола в водной фазе. Смешайте образца с помощью пипетки.
  2. Создание новой коллекции пробирки, содержащие картриджа фильтра для каждого образца. Пипетка ~ 675 мкл lysate/этанол смеси на картридж фильтра.
    Примечание: Не добавляйте > 700 мкл картриджа фильтра в одно время. Для больших томов применяются последовательно.
  3. Центрифуга кратко (~ 15-20 s) на 10 000 x g пройти жидкости через фильтр. Не сложнее, чем это спина.
  4. Отменить через поток и, при необходимости, повторить центрифугирования с оставшейся смесью lysate/этанол до тех пор, пока она все была применена. Сохраните же фильтр картридж и коллекции трубки для следующего шага.
  5. 700 мкл Вымойте решения 1 из комплекта для картриджа фильтра и центрифуги кратко (~ 10 s) тянуть через фильтр. Отменить через поток и сохранить же фильтр картридж и коллекции трубки.
  6. 500 мкл Вымойте решения 2/3. Центрифуга нарисовать жидкость через картридж фильтра. Слейте через поток. Повторите шаг мыть.
  7. Inthe же трубку, спина картриджа фильтра дополнительные 60 s для удаления остатков жидкости из фильтра. Передать трубку свежие коллекции картриджа фильтра.
  8. Добавьте 100 мкл воды свободной от нуклеиназы подогретую (95 ° C) в центре картриджа фильтра. Отжим для примерно 20-30 s Макс скоростью настольная центрифуга.
    Примечание: РНК содержится в элюата и может теперь быть далее обрабатывается или хранится при температуре-20 ° C или ниже. Обогащение для малых РНК не была выполнена.

5. Глобин сокращение (на основе протокола оптимизирован для образцов свинину цельной крови)14,15

Примечание: Глобин, сокращение осуществляется так, что библиотеки не переполнены с читает сопоставление Глобин генов, которые снизят количество операций чтения, доступные для сопоставления с другими генами больший интерес14,15 .

  1. Гибридизации с сокращения oligos Глобин
    1. Денатурируйте РНК (6 мкг РНК образец в максимальной громкости 7 мкл), закупорить извлечения образца в трубку тонкостенных реакции свободных нуклеиназы 0,2 мл и поместив в тепловой циклователь при 70 ° C на 2 мин. Это ключ к лед трубы сразу же после первого шага denature для оптимального качества РНК. Не DNase лечение не требуется.
    2. В то время как трубы прохладно подготовить 400 мкл 10 x Глобин сокращения oligo микс: 100 µL из двух oligos HBA (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3' и 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3') на 30 мкм, два ГБД oligos (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3', и 5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3') на 120 мкм в реакции, уступая конечная концентрация 7,5 мкм HBA oligos и 30 мкм ГБД oligos. Подготовка 10 x oligo гибридизации буфера: 100 мм трис-HCL, рН 7,6; 200 мм KCl.
    3. Подготовьте смесь гибридизации: 6 мкг РНК образца (максимальный объем 7 мкл), 2 мкл 400 мкл 10 x Глобин сокращения oligo микс (конечная концентрация 2 X), 1 мкл 10 x oligo гибридизации буфера (конечная концентрация 1 x). Добавьте воды, свободной от нуклеиназы окончательный объем 10 мкл.
    4. Установите Термоциклер при 70 ° C за 5 минут остыть сразу до 4 ° C и приступить к H РНКазы пищеварение.
  2. H РНКазы пищеварение
    1. Разбавить 10 x H РНКазы (10 ед / мкл) 1 x H РНКазы с 1 x H РНКазы буфера.
      Примечание: РНКазы буфер приходит в 10 x и будет нужно разбавлять 1 x H РНКазы буфера до 1 x перед использованием.
    2. Подготовка H РНКазы реакция смеси путем комбинирования: 2 мкл 10 x буфер РНКазы, 1 мкл АБС битор РНКазы в 2 мкл 1 x H РНКазы и 5 мкл нуклеиназы свободной воды в общем объеме 10 мкл.
    3. Тщательно перемешать образцы гибридизации Глобин сокращения с 10 мкл H РНКазы реакция смеси и дайджест при 37 ° C для 10 минут остыть до 4 ° C.
    4. Остановить пищеварение путем добавления 1.0 мкл ЭДТА 0,5 М для каждой выборки и немедленно приступить к этапу очистки.
  3. РНКазы H-лечение всего РНК очистки.
    1. Очистить H РНКазы лечение РНК с помощью комплект очистки очистки на основе кремния мембраны элюции согласно инструкциям производителя. Премикс буферов: мягкая Отмывающий буфер, добавить 44 мл 100% этанола.
    2. Не передать образец новой трубки. Добавьте 80 мкл РНКазы свободной воды и 350 мкл буфера lysis. Добавьте 250 мкл, 100% этанола в разреженных РНК и смесь хорошо, закупорить.
      Примечание: Не центрифуги. Немедленно приступить к шаг 5.3.3.
    3. Теперь передать 700 мкл пример элюции картриджа фильтра в 2-мл пробирку коллекции для сбора через поток. Центрифуги для 15 s на ≥ 8000 x g. Отказаться от потока через.
    4. Повторите это, помещая картриджа фильтра элюции в новой коллекции 2-мл пробирку. 500 мкл мягкая Отмывающий буфер для картриджа фильтра и центрифуги для 15 s на ≥ 8000 x g чтобы помыть мембранный картридж фильтра. Отказаться от потока через. Повторное использование коллекции трубки на шаге 5.3.5.
    5. Теперь с помощью же образец трубки, добавьте еще один 500 мкл 80% этанола картриджа фильтра. На этот раз центрифуга трубки для 2 мин на ≥ 8000 x g. Собирать столбце spin элюции для следующего шага и отбросить как проточные и сбор трубки.
    6. Вставьте картридж фильтра элюции от последнего шага в новой коллекции 2-мл пробирку. Оставьте крышку открыть на картридж фильтра и центрифуги на полной скорости за 5 мин до сухой спин столбец мембраны и предотвращения этанола переносятся. Выбросите проточных и коллекции трубки.
      Примечание: Чтобы избежать повреждения угол крышки в направлении, противоположном который ротора.
    7. Возьмите сушеные картриджа и место в новой коллекции 1,5 мл трубку. 14 мкл РНКазы свободной воды для фильтрации мембранный картридж убедившись добавить РНКазы свободной воды непосредственно в центре. Центрифуги для 60 s на полной скорости, чтобы элюировать РНК.
  4. Оцените качество образцов Глобин снижена РНК (шаг 6). Перейти к мРНК пробоподготовки (шаг 7) и малых РНК библиотеки подготовка (шаг 8)16,17.
    Примечание: Образцы Глобин снижена РНК могут теперь храниться при температуре-20 ° C, однако хранения при температуре-80 ° C рекомендуется для длительного хранения.

6. Оценка РНК

  1. Количественную оценку концентрации РНК с помощью спектрофотометра. Изучите соотношение длины волны 260 и 280 Нм. Соотношения ~ 2 или более, считаются чисто для РНК, и более низкие значения указывают некоторые загрязнения. Инструмент использует это соотношение для определения концентрации РНК как нг/мкл.
  2. Оценить качество РНК с помощью 1 мкл (100 нг) образца на соответствующей фишке. Конечный продукт должен быть Рин ~ 2 или выше и пик на ~ 280 nt для мРНК одного чтения библиотеки; небольшие пики библиотеки РНК на 143 соответствуют адаптивной.

7. мель всего РНК Пробоподготовка для мРНК и длинные ncRNA библиотек. 16

  1. Примечание: Принесите Элюирующий буфер и рРНК удаления бусы до комнатной температуры. Предварительно ярлык 0,2 мл тонкостенных труб ПЦР (плиты также могут быть использованы). Протокол шаги на основе инструкции производителя16.
    1. Начните с 4 мкл Глобин снижена РНК. Добавьте 6 мкл нуклеиназы свободной воды, 5 мкл буфера привязки рРНК и 5 мкл рРНК удаления смесь трубки (1st трубки). Пипетка для микширования и Re шапочка. Место в Термоциклер с подогревом крышкой 100 ° C за 5 мин на 68° C. удалить и оставить при комнатной температуре 60 s.
    2. Ресуспензируйте рРНК удаления бусины вихря; 35 мкл бусы на новый (2nd) ПЦР-пробирку и Пипетка образца от 1st трубы на бусины в 2nd трубы. Проинкубируйте 2nd ПЦР-пробирку при комнатной температуре в течение 3 мин. Место на магнитного стенд за 7 мин.
      Примечание: Mix каждый образец тщательно закупорить для оптимального рРНК истощения. Повышение/опускание трубки на стенде может помочь ускорить процесс разделения.
    3. Передачи супернатант от 2nd ПЦР-пробирку для сопоставления 3rd ПЦР-пробирку и место на магнитной постоять минимум 60 s. повтор передачи в новой ПЦР-пробирку только если бисер не перемещаются в трубку стороны.
    4. Пример очистки смеси бусины вихря; Добавьте в каждую ПЦР-пробирку 3rd 99 мкл. Позвольте сидеть при комнатной температуре 15 мин место на магнитной подставкой для 5 минут обеспечить бусины переходит к сторонам. Пипетка для отмены супернатант.
    5. Держите 3rd трубки на магнитного стенд. Добавьте 200 мкл на 70% спирте хотя стараясь не толкаться бисер. Позвольте сидеть в течение по крайней мере 30 s и пипетку, чтобы удалить супернатант. Повторите шаг.
    6. Разрешить образец высохнуть при комнатной температуре 15 мин на магнитную подставку. Центрифуга комплект Элюирующий буфер для 5 s на 600 x g. Снимите трубку и 11 мкл буфера смешивания тщательно. Проинкубируйте 2 мин на скамейке запасных, то по крайней мере 5 минут на магнитные стоять при комнатной температуре.
    7. Передать новые (4th) 8,5 мкл супернатант от 3rd ПЦР-пробирку. Мкл 8,5 Elute/премьер/фрагмент высокой смеси из комплекта. Хорошо перемешайте. Колпачок и место в Термоциклер с предварительно нагретой крышкой 8 мин на 94 ° C, удерживайте при 4 ° C. Удалить и центрифугирования кратко.
  2. Синтез cDNA стренги первый
    1. Разрешить первый микс синтеза прядь из комплекта приехать в комнатной температуре и центрифуги на 600 × g для 5 s. передачи 50 мкл обратной транскриптазы в первый микс синтеза стренги. Обратной транскриптазы могут быть добавлены к сначала прядь синтеза в соотношении 1:9.
    2. Пипетка 8 мкл комбинированных обратной транскриптазы/сначала нить смесь синтеза в 4 трубки с образцом. Крышка и центрифуги 600 x g 5 s. место в Термоциклер с предварительно нагретой крышкой на 100 ° C. Запуск для: 10 мин при 25 ° C, 15 мин при 42 ° C, 15 мин при 70 ° C, затем остальные на 4 ° C. Окончательный объем составляет ~ 25 мкл в колодец. Сразу же перейти к следующему шагу.
  3. Синтез cDNA стренги второй
    1. Принесите конце ремонта реагента (ERR) и второй стренги Mix (SSM) до комнатной температуры и центрифуги на 600 x g для 5 s. Mix ERR с буфером ресуспендирования в 1:50 разрежения. ЭСКАТО 4й трубки и добавьте разбавленные ERR 5 мкл и 20 мкл SSM каждому; Пипетка для хорошо перемешайте. Окончательный объем ~ 50 мкл ds cDNA.
    2. Крышка и в Термоциклер инкубировать 1 час при температуре 16 ° C. Когда цикл завершается, снимите крышки и позволяют прийти к комнатной температуре на вершине скамейке.
  4. DS cDNA очистки шаг
    1. Начните с смешивания вихря парамагнитных бусины твердой фазы реверсивные иммобилизации (ОСПР). Передавать 90 мкл бусы из образца в 4йтрубки (ds cDNA) и перемешать. Окончательный объем — 140 мкл. разрешить трубы сидеть на 15 мин при комнатной температуре инкубации на магнитной подставкой для ~ 5 мин. Удалите из каждой скважины ~ 135 мкл супернатант. Там следует 5 мкл в каждой скважине.
    2. Оставьте трубки на магнитную подставку и мыть, добавляя 200 мкл 80% этанола. Позвольте сидеть в течение 30 s затем удалить и удалить супернатант. Повторите шаг мыть. Оставьте трубы на магнитные постоять 15 минут, чтобы дать высохнуть.
    3. Центрифуга ресуспендирования буфера на 600 x g 5 s после прихода до комнатной температуры. Удаление трубы от стенда. Передать трубку 17,5 мкл буфера ресуспендирования и перемешать. Пусть трубы инкубировать на скамейке верхней за 2 мин, а затем перейти к магнитным постоять 5 мин.
    4. Пипетка 15 мкл супернатанта, содержащие образцы cDNA ds новый набор (5th) 0,2 мл тонкостенных труб. Оперативно перейти к следующему шагу или печать и хранить при температуре-15 ° C до-25 ° C не более 7 дней.
  5. Adenylate 3' концы.
    1. Пипетка 2,5 мкл буфера ресуспендирования комнатной температуры в пробирку образца, а затем 12,5 мкл талой смесь A-хвостов. Смешайте полностью закупорить.
      Примечание: Не A-хвостохранилища управления.
    2. Крышка и инкубировать в Термоциклер с предварительно нагретой крышкой 100 ° C. Запуск при 37 ° C за 30 минут, затем при 70 ° C за 5 мин с подогревом крышкой. Разрешить Термоциклер отдохнуть на 4 ° C.
  6. Перевязать индекс адаптеров
    1. Принесите РНК адаптер трубки и остановить Buffer лигирования смесь до комнатной температуры. Для каждого центрифуги на 600 x g для 5 s. микс лигирование оставить в морозильной камере до готовности для использования. Должны быть известны примеры объединения Переложение для индексации.
    2. Добавьте 2.5 мкл буфера ресуспендирования и 2,5 мкл лигирование смеси в каждую пробирку образца. Теперь Пипетка в 2,5 мкл надлежащего питания РНК в каждую пробирку образца. Адаптер выбора должны выполняться инструкции производителя для выбранного комплекта.
    3. Повторение и смешайте центрифугированием за 1 мин на 280 x g. Инкубируйте в тепловой cycler для 10 мин при 30 ° C. Добавьте 5 мкл стоп лигирование буфера выборки остановить реакции и хорошо перемешайте.
    4. Начало очистки путем смешивания Спри парамагнитных бусины Вортекс для 60 s. передачи 42 мкл бусы для каждой трубы. Смесь thoroughlythen Инкубируйте 15 мин на вершине скамейке.
    5. Переместить трубки магнитного стенд и оставить до тех пор, пока жидкость оказывается ясно (~ 5 мин). Когда-то ясно снимите и выбросьте 79,5 мкл супернатант. Оставьте трубы на магнитную подставку и мыть, добавляя 200 мкл 80% этанола. Позвольте сидеть в течение по крайней мере 30 s затем удалить и удалить супернатант. Повторите шаг мыть. Оставьте на магнитной подставкой для дополнительных ~ 15 мин для сушки. Не нарушать бусины во время стирки шаги.
    6. 52,5 мкл буфера ресуспендирования пробирку образца и перемешать, пока бисер полностью вновь приостановлено. Проинкубируйте 2 мин на вершине скамейке. Перемещения образца трубки обратно магнитного стенд до жидкость ясно (~ 5 мин).
    7. Оставить на стенде и аккуратно Пипетка 50 мкл супернатант новый (6th) трубы. Добавьте 50 мкл vortexed Спри бусины. Позволяют инкубировать на скамейке Топ 15 мин.
    8. Перейти к магнитного стенд и пусть пластины остаться до тех пор, пока жидкость оказывается ясно (~ 5 мин). Отменить 95 µL из супернатанта, оставив 5 мкл в пробирки.
    9. Оставьте трубы на магнитную подставку и мыть, добавляя 200 мкл 80% этанола. Разрешить трубки сидеть за 30 s затем снимите и выбросьте супернатант. Повторите мыть. Пусть трубы сушат на магнитного стенд за 15 мин.
    10. Добавить в 22,5 мкл буфера ресуспендирования и перемешать до бусины приостанавливается. Инкубируйте на скамейке за 2 мин, а затем перейти к магнитного стенд до жидкого оказывается ясно (~ 5 мин). Пипетка 20 мкл пример в новые трубы ПЦР (7м).
  7. Необходимый комплект компонентов довести до комнатной температуры. Передать 5 мкл смеси праймера PCR и 25 мкл мастер смеси ПЦР из комплекта образцов (7th ПЦР трубки) содержащие индексированные образцы. Перемешайте образец и крышка трубки.
    1. Место труб в тепловая велосипедист с предварительно нагретой крышкой. Запустить программу: 98 ° C за 30 s, то 15 циклов для 10 98 ° c s, 60 ° C за 30 сек, 72 ° C за 30 s, 72 ° C за 5 минут провести на 4 ° C.
  8. Очистите образцы, добавляя 50 мкл объединить достаточно смешанные Спри бисера образец трубки и Пипетка. Разрешить реакция инкубировать на скамейке Топ 15 мин.
    1. Переместить трубки магнитного стенд и инкубировать до тех пор, пока жидкость оказывается ясно (~ 5 мин). Отменить 95 µL из супернатанта, оставив 5 мкл в пробирки.
    2. Оставьте трубки на магнитную подставку и мыть, добавляя 200 мкл 80% этанола. Позвольте сидеть в течение по крайней мере 30 s и затем удалить и удалить супернатант. Повторите этот шаг мыть. Оставьте на магнитные постоять 15 минут, чтобы дать высохнуть.
    3. Добавить в 32,5 мкл буфера ресуспендирования и перемешать до бусины полностью вновь приостановлено. Инкубируйте на скамейке за 2 мин, а затем перейти к магнитного стенд до жидкого оказывается ясно (~ 5 мин). Пипетка 30 мкл пример из каждой трубки в новой ПЦР-пробирку.
    4. Оценку качества и количества ДНК, повторив шаги 6.1 и 6.2 с соответствующим чипа. Перейти к объединению шаг (шаг 9).

8. Малые РНК библиотеки подготовка к sncRNAs. 17

Примечание: Протокол шаги на основе инструкции производителя17.

  1. Начать малых РНК библиотека prep с ~ 220 нг - ~1.1 мкг / мкл Глобин снижена РНК образцы (4 мкл).
  2. Перешнуровка переходник
    1. Перевязать 3'-адаптер, смешивая тщательно в 1 мкл адаптер, 2 мкл нуклеиназы свободной воды и 4 мкл Глобин снижена РНК образца. Инкубируйте на 70 ° C на 2 мин и затем сразу же место на льду.
    2. 10 мкл 2 x лигирование буфер, и 3 мкл лигирование фермент смесь, смешать и инкубировать 16 ° C для 18 h.
      Примечание: Время инкубации образца увеличение до 18 часов при более низкой температуре 16 ° C рекомендуется для исследования заинтересованы в метилированной РНК видов, таких как piwi РНК. Длиннее время инкубации позволяет для большей эффективности маточных труб вследствие класса изменений на этапе 3' адаптер перевязки.
    3. Мкл 1 обратной транскрипции грунт в 4,5 мкл воды, свободной от нуклеиназы лигирование смесь для предотвращения образования избыточного 3' адаптер адаптер димер.
    4. Инкубировать в разогретой тепловая велосипедист, запланированных на 5 мин при 75 ° C, 15 мин при 37 ° C, 15 мин при температуре 25 ° C и провести на 4° C.
    5. Денатурируйте 1 мкл предварительно разбавленного 5'-адаптер на сэмпл в тепловой циклователь при 70 ° C на 2 мин и затем сразу же место на льду.
    6. Добавьте 1 мкл денатурированного 5'-адаптер, 1 мкл 10 x 5' лигирование буфера и 2,5 мкл 5' лигирование фермента. Смешать и инкубировать и 25 ° C в течение 1 ч.
  3. синтез cDNA и усилители
    1. Тщательно перемешать путем дозирования 30 мкл 5′/3′ адаптер лигируют РНК, 8 мкл буфера перв стренги, 1 мкл битор РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы. Инкубировать смеси на 50 ° C в течение 60 мин приступить незамедлительно к амплификации PCR или тепла инактивирует реакции при 70 ° C 15 мин и хранить при температуре от-20 ° C.
    2. PCR усиливает 40 мкл обратной транскриптазы реакции, добавляя 50 мкл мастер смеси ПЦР, 2,5 мкл РНК PCR праймер, 2,5 мкл назначенных РНК PCR праймер индекса для выборки и свободной от нуклеиназы воды до общего объема 100 мкл. смешать, закупорить. Запуск ПЦР в тепловая велосипедист, используя следующие условия велосипедного: первоначальный денатурации на 94 ° C за 30 сек; 11 циклов 94 ° C 15 s, отжиг на 62 ° C 30 s, и расширение при 70 ° C 15 s; после чего окончательное расширение при 70 ° C за 5 мин; образцы могут быть проведены на 4 ° C в cycler.
    3. Примечание: Для цели объединения образец добавляются индексы.
  4. Пример очистки
    1. Комплект для очистки ДНК добавьте 500 мкл буфера привязки (5 M ГУ-HCl, 30% изопропиловый спирт) до 100 мкл ПЦР усиливается образца для включения эффективной привязки к мембране спин колонки.
      Примечание: Если в буфер привязки имеет pH индикатор включен убедитесь, что цвет смеси имеет желтый цвет.
    2. Пипетка 600 мкл смесь образца и привязки буфера в картридж фильтра внутри 2-мл пробирку коллекции, спина для 30-60 s на 17 900 x g в настольной центрифуги. Отказаться от потока через.
    3. Мыть картриджа фильтра в же коллекции трубку с 0,75 мл-поставленный комплект мыть буфера (рН 10 мм трис-HCl 7.5, 80% этанола), спиннинг в течение 30-60 s на 17 900 x g в настольной центрифуги и отменяя поток-через. Спиновые картриджа фильтра сухой для дополнительных 60 s.
    4. Поместите картридж фильтра в чистой 1,5 мл коллекции. Добавить 30 мкл буфера (10 мм трис-HCl рН 8,5), пусть столбце стенд для 60 s, а затем спина 60 s на 17 900 x g в настольной центрифуги.
  5. Оценить качество выборки, повторив шаги 6.1 и 6.2 с соответствующим чип ДНК. Перейти к объединению шаг (шаг 9).

9. пример объединения для виртуализации

  1. Бассейн перепутываются и QC'ed образцы, настроив и маркировки новые трубы (или 96 хорошо ПЦР-планшете) содержать образцов mRNA или ncRNA. Передать 13 мкл каждой библиотеки 10 Нм перепутываются соответствующие трубы (или скважин в новой пластинкой) за производителя инструкции16,17. Представить объединенные выборки для виртуализации, будьте уверены, чтобы выбрать подобные чтения длины, если образцы для запуска на одном чипе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Глобин и истощены Рибо цельной крови образцы репрезентативных выборок в нашем исследовании. Итоги представитель протокола состоит из Глобин обедненного библиотеки образца с номером целостности РНК (Рин) выше 7 (Рисунок 1) и 260/280 Нм показателями концентрации на уровне или выше 2 (рис. 1b и 1 c). Обобщение результатов выборки была выполнена с помощью спектрофотометра дать окончательный концентрации каждой библиотеки и чиповых электрофорез дать Рин количество вершин, которые показывают, какие молекулы (mRNA или ncRNA) были захвачены вместе с граф на основе Размер пластины в образце библиотеки до объединения и последовательности. Для текущего исследования был акцент на мРНК и малых ncRNAs только. Для библиотек мРНК представитель результат electropherogram пика ~ 280 bp (рис. 1d). Для представителя малого ncRNAs, результаты состоят из ряда пики от ~ 100-400 bp (Рисунок 1e), с пиками на ~ 143 и ~ 153 bp соответствуют адаптивной и piRNAs, соответственно. Наши результаты выборки показало, что наш оптимизированный метод привели в библиотеках с Рин числами, которые варьировались от 6.3 (субоптимальных) 9.2 (выше оптимального). Это оказалось улучшение по сравнению с другими исследованиями, которые использовали методы Глобин истощения и только удалось добиться Рин чисел в или около 6. На основе чипа электрофореза, результаты также показали, что от одной одной крови можно добиться захвата молекулы РНК пиков, представляющих мРНК и ncRNA (рисунки 1 d и 1e) и вставить размеры выборки, которые охвачены больших и малых -кодирование молекулы РНК. Эти результаты являются представитель оптимальные результаты Рин и вставьте размеров необходимо чтобы убедиться, что качество Стенограмма читает может виртуализированных из подготовленных библиотек для почти всех NGS РНК seq платформ.

Figure 1
Рисунок 1 : Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 1b
Рисунок 1b : Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 1c
Рисунок 1 c : Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 1d
Рисунок 1 d : Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 1e
Рисунок 1e : Представитель результаты для мРНК и некодирующих РНК выражение библиотеки из одного образцов свинину цельной крови. () электрофорез файл запуска резюме представления Рин номера предварительно Глобин сокращения и после Глобин. Представитель electropherograms (b) предварительной Глобин сокращение и (c) после Глобин сокращение образца единого свинину цельной крови. (d) представитель electropherograms Глобин и истощены Рибо цельной крови мРНК библиотеки образцов до объединения и последовательности. (e) представитель electropherograms Глобин обедненного sncRNA цельной крови библиотек образцов же признакам в Группа d до объединения и последовательности пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Первым важным шагом в протоколе, что сделал это оптимизированный включали добавлен Глобин истощения шаги, которые позволили получить качество читает пробах цельной крови. Одним из крупнейших ограничений на использование цельной крови в последовательности исследования являются большое количество чтений в образце, которые позволят сопоставить Глобин молекул и уменьшить чтений, которые можно сопоставить с другими молекулами интерес18. Таким образом в оптимизации протокола для нашего образца типа, нам необходимо включить шаг истощения глобина для обеспечения высшей возможной мРНК и РНК-кодирования захвата через последовательность. Все образцы были Глобин исчерпан счет для высоких уровней Глобин стенограммы с помощью свиные конкретных гемоглобина A и B (HBA и ГБД) олигонуклеотиды основанные на процедуре от Чой et al., 201414. Другим важным шагом было использование Рибо истощение добыча комплект, который допускается для способность удалить нежелательные молекулы РНК из наших образцов одновременно сохраняя polyadenylated-кодирования и вирусных молекул РНК экспериментальной интерес в рамках Наши библиотеки для секвенирования19. Кроме того мы смогли работать с одной пробы для создания кодирования (мРНК) и некодирующих библиотеки РНК (малых и длинные) путем удаления малых РНК обогащения и размер выделения шаги. Делая это, мы смогли максимально аликвоты РНК для объединения и гарантировать, что мы отправили достаточный объем для виртуализации. Оптимизация всех протоколов производителя были сделаны для увеличения мРНК и некодирующих РНК восстановления для создания течению библиотеки. Мы также оптимизирован небольшую часть некодирующих РНК течению анализа подготовки библиотека некодирующих РНК, добавив дополнительное время инкубации ПЦР в инструкции производителей для повышения эффективности лигирование метилированной РНК и вероятность восстановления piwi РНК.

Ограничения оптимизированный протокол коренятся в отсутствие конкретности, которая также делает его идеальным для нескольких анализов от одного образца. Удаляя обогащения и размер выделения части подготовки библиотеки РНК-кодирования, мы ограничиваем Роман малых РНК обнаружения20 , чтобы сбалансировать его против приобретения как малых, так и долго-кодирования молекул РНК. Следовательно, оптимизированный протокол дает хороший обзор типов некодирующих выражения, но требует дополнительной обработки в ходе аналитического этапа сопоставления, чтобы получить более конкретную информацию о классах и размеров некодирующих РНК выражение захвачен в Пример. Еще одним ограничением в метод объясняется включение Глобин истощения шагов, которые будут ниже общего числа Рин. Мы были в состоянии устранить это изучая Рин чисел до и после истощения Глобин, чтобы понять, как большие сокращения РНК целостности мы бы опыт. Это дало результаты, которые показали, мы могли бы опыт капля ~ 1-2 очков. Для учета этого падения мы дополнительно оптимизирован протокол истощения Глобин 6 мкг образца вместо рекомендованных 10 мкг. Это помогло улучшить наши номера Рин, а также сохранение образца. Кроме того мы также использовали Трубы тонкостенные microamp реакции и ледяной трубы сразу же после Первый денатурируя шаг. Это позволило нам утолить быстрее реакция, позволяя для улучшения Рин чисел на Глобин обедненного образцы.

Измененный Протокол, используемый в данном исследовании имеет ряд преимуществ над методами подготовки базовой библиотеки, используемые в других исследованиях, где только mRNA или РНК-кодирования изучаются отдельно. Изменения, которые мы сделали для оптимизации, для эффективного использования как наш образец типа цельной крови. Это выгодно для будущих исследований, потому что цельной крови как пример типа имеет меньше шаги для сбора и обработки, чем часть лейкоцитов крови. Кроме того цельной крови также имеет дополнительные преимущества позволяет исследователям изучить системные ответы и может быть многократно собранные от животных. Однако есть один нюанс на использование образцов цельной крови в том, что количество крови, собранные зависит от возраста и размера организма в вопросе. Меньшее количество крови приведет к снижению урожайности РНК, однако здесь представлены метод позволит создание двойной библиотеки от по крайней мере 2,5 мл цельной крови. Это позволило нам использовать один образец для расследования мРНК и некодирующих выражение и сопоставить оба к индивидуалу на моментальный снимок в время, эффективно, что позволяет нам собирать больше информации, чем традиционные библиотечные методы подготовки. Кроме того выполняя Рибо истощение мы сделали возможным сократить стенограммы, разрушающим последовательности читает, сохраняя при этом-кодирования и вирусных стенограмм, которые могут быть потеряны во время создания библиотеки традиционных для изучения мРНК. Таким образом наш оптимизированный протокол утраивает количество информации, которые могут быть получены от одного образца. Были другие существенные изменения, мы сделали в метод для облегчения захвата более РНК видов информации: изменение типа плиты PCR быстро остановить реакцию, которая улучшилась РНК чистоты доходности; длиннее Термоциклер инкубации увеличить перевязки для возможного восстановления метилированной РНК; и не используя выбор размера гель, чтобы для всех обнаружению ncRNAs определены независимо от их длины. Вниз по течению анализа это позволило для захвата нескольких молекул РНК-кодирования между 18nt-200nt в длину.

Используя этот метод оптимизации, наша группа смогла выдвинуть протокол, который может быть применен к транскриптомики анализов цельной крови и позволяют мРНК и РНК-кодирование от одного образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Торговые наименования или коммерческих продуктов в этой статье упоминаются исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Департаментом сельского хозяйства США. USDA — равных возможностей поставщика и работодателем.

Acknowledgments

Эта работа была главным образом поддержана USDA НИФА AFRI 2013-67015-21236 и частично путем USDA НИФА AFRI 2015-67015-23216. Это исследование отчасти поддержали назначение сельскохозяйственных исследований службы участие программа исследований ведении Окриджская институт науки и образования (ORISE) через межучрежденческое соглашение между (Министерство энергетики США Доу) и Департамент сельского хозяйства США. ORISE управляется Оук Ридж ассоциированных университетов по контракту Доу нет. ДЕ AC05-06OR2310.

Мы хотели бы поблагодарить д-р Кей Faaberg для HP-PRRSV инфекционные клоны, д-р Сьюзен Brockmeier за ее помощь с животными, участвующих в эксперименте и Сью Ohlendorf для секретарской помощи в подготовке рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAXgene Tubes PreAnalytix 762165
Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
mirVana miRNA Isolation Kit ThermoFisher AM1560
Rneasy MinElute Clean Up Kit QIAGEN 74204
100% Ethanol Decon Labs, Inc. 2716
0.2 mL thin-walled tubes ThermoFisher 98010540
1.5 mL RNase/DNase - free tubes Any supplier
Veriti 96-well Thermocycler ThermoFisher 4375786R
Globin Reduction Oligo (α 1) Any supplier Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (α 2) Any supplier Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1) Any supplier Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2) Any supplier Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
-KCl Millipore Sigma 60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
 -DTT ThermoFisher Y00147
 -MgCl2 Promega A351B
 -Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
RNase H ThermoFisher AM2292
SUPERase-IN ThermoFisher AM2694 Rnase inhibitor
EDTA Millipore Sigma E7889
Microcentrifuge Any supplier
 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument Agilent Technologies G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies 5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  Kit Agilent Technologies 5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero  Illumina RS-122-2201 mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A  (48 samples, 12 indexes)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide Illumina Available on-line
RNAClean XP Beads BeckmanCoulter A63987
AMPure XP Beads BeckmanCoulter A63880
MicroAmp Optical 8-tube Strip ThermoFisher N8010580 0.2 ml thin-walled tubes
MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap ThermoFisher N801-0535
RNase/DNase - free reagent reservoirs Any supplier
SuperScript II Reverse Transcriptase ThermoFisher 18064-014
MicroAmp Optical 96 well plates ThermoFisher N8010560 These were used in place of .3mL plates as needed
MicroAmp Optical adhesive film ThermoFisher 4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1)  New England Biolabs E73005 small RNA kit
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2)  New England Biolabs E75805 small RNA kit
QIAQuick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
96S Super Magnet Plate ALPAQUA A001322

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
  2. Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
  3. Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
  4. Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
  5. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  6. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  7. Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  8. Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf (2015).
  9. Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
  10. Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).
  11. Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
  12. Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
  13. Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
  14. Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
  15. Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf (2007).
  16. TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
  17. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018).
  18. Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
  19. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
  20. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 141 мРНК Non кодирования РНК РНК-Seq цельная кровь эпигенетических Глобин сокращение
Идентификация и кодирования кодирование классы РНК выражена в свином цельной крови
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fleming, D. S., Anderson, S. J.,… More

Fleming, D. S., Anderson, S. J., Miller, L. C. Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood. J. Vis. Exp. (141), e58689, doi:10.3791/58689 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter