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Immunology and Infection

स्वाइन पूरे रक्त में व्यक्त कोडिंग और गैर कोडिंग आरएनए कक्षाओं की पहचान

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58689
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, 2ORAU/ORISE

Summary

यहां, हम एक एकल पूरे रक्त नमूना से ग्लोबिन कम आरएनए-seq पुस्तकालयों के कोडिंग (mRNA) और गैर कोडिंग (ncRNA) के प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

अभिनव और तेजी से शक्तिशाली अगली पीढ़ी sequencing तकनीक के आगमन के लिए अंतर्निहित जीन ब्याज की जैविक प्रक्रियाओं से संबंधित अभिव्यक्ति की जांच करने की क्षमता में नए रास्ते खोल दिया है । इन नवाचारों न केवल शोधकर्ताओं mRNA अनुक्रम से अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने की अनुमति है कि जीन के लिए कोड है कि प्रभाव सेलुलर समारोह, लेकिन यह भी गैर कोडिंग आरएनए (ncRNA) अणु है कि untranslated रहते हैं, लेकिन अभी भी विनियामक कार्य किया है । हालांकि शोधकर्ताओं ने दोनों mRNA और ncRNA अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने की क्षमता है, यह एक अध्ययन के लिए एक या दूसरे पर ध्यान केंद्रित करने के लिए किया गया है । हालांकि, जब अध्ययन दोनों mRNA और ncRNA अभिव्यक्ति में रुचि रखते हैं, कई बार वे अलग नमूनों का उपयोग करने के लिए या तो कोडिंग या गैर कोडिंग पुस्तकालय की तैयारी में अंतर के कारण RNAs । यह समय, उपभोग्य सामग्रियों, और जानवरों के तनाव को बढ़ा सकते हैं जो अधिक नमूनों के लिए की जरूरत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, यह शोधकर्ताओं के लिए केवल एक विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने का फैसला करने के लिए कारण हो सकता है, आमतौर पर mRNA, जैविक प्रश्नों की संख्या सीमित है कि जांच की जा सकती है । हालांकि, ncRNAs mRNA अभिव्यक्ति प्रभाव नियामक भूमिकाओं के साथ एकाधिक क्लासेस अवधि । क्योंकि ncRNA में संक्रमण के दौरान इन प्रक्रियाओं के मौलिक जीवविज्ञान प्रक्रियाओं और विकार के लिए महत्वपूर्ण हैं, वे कर सकते हैं, इसलिए, चिकित्सकीय के लिए आकर्षक लक्ष्य बनाते हैं । इस पांडुलिपि पीढ़ी mRNA और गैर कोडिंग आरएनए अभिव्यक्ति पुस्तकालयों के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल, वायरल आरएनए सहित पूरे खून का एक नमूना से प्रदर्शित करता है । इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन, बेहतर आरएनए शुद्धता, methylated RNAs की वसूली के लिए वृद्धि हुई बंधाव, और अधिक आरएनए प्रजातियों पर कब्जा करने की अनुमति देने के लिए आकार चयन छोड़ दिया ।

Introduction

अगली पीढ़ी के sequencing (NGS) जैविक जीवों के जीनोमिक स्तर पर होने वाले परिवर्तनों की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । NGS तरीकों के लिए नमूना तैयारी जीव, ऊतक प्रकार, और अधिक महत्वपूर्ण बात यह शोधकर्ताओं को संबोधित करने के लिए उत्सुक हैं सवालों के आधार पर विविध किया जा सकता है । कई अध्ययनों से ऐसे स्वस्थ और बीमार व्यक्तियों के रूप में राज्यों के बीच जीन अभिव्यक्ति में मतभेदों का अध्ययन करने के एक साधन के रूप में NGS करने के लिए बदल गया है1,2,3,4। अनुक्रमण एक पूरे जीनोम के आधार पर जगह ले और एक शोधकर्ता सबसे अधिक कब्जा करने के लिए अनुमति देता है, नहीं तो सब, एक समय बिंदु पर एक विशेष आनुवंशिक मार्कर के लिए जीनोमिक जानकारी के ।

मनाया अभिव्यक्ति का सबसे आम मार्करों मैसेंजर RNAs (mRNAs) हैं । आरएनए-seq के लिए prepping पुस्तकालयों के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं शुद्धिकरण, विखंडन, और ligations5,6की एक श्रृंखला के उपयोग के माध्यम से mRNA अणुओं की वसूली के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । हालांकि, कैसे एक प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया जा रहा है पर निर्णय नमूना प्रकार पर भारी निर्भर करता है और सवाल के बारे में पेश किया जा रहा नमूना कहा । अधिकांश मामलों में कुल आरएनए निकाला जाता है; फिर भी, नहीं सभी आरएनए अणुओं ब्याज की और ऐसे मामलों में mRNA अभिव्यक्ति अध्ययन पीढ़ी प्रचुर मात्रा में आरएनए प्रजातियों के रूप में, राइबोसोमल RNAs (rRNA) की तरह mRNAs के साथ जुड़े जासूसी टेप की संख्या में वृद्धि करने के लिए हटा दिया जाना चाहिए. प्रचुर मात्रा में rRNA अणुओं को हटाने के लिए सबसे लोकप्रिय और व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि polyadenylated आरएनए की कमी है polyA घट7के रूप में निर्दिष्ट टेप । यह दृष्टिकोण mRNA अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से काम करता है क्योंकि यह mRNA टेप को प्रभावित नहीं करता है । हालांकि, पढ़ाई में जो नॉन कोडिंग या वायरल RNAs की दिलचस्पी है, polyA घट भी इन अणुओं को हटा देता है ।

कई अध्ययनों या तो mRNA अभिव्यक्ति (कोडिंग) या छोटे या बड़े गैर कोडिंग आरएनए के एक विशेष वर्ग की जांच करने के लिए आरएनए अनुक्रम पुस्तकालय तैयारी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुनते हैं । हालांकि वहां हमारे जैसे अंय प्रक्रियाओं8 है कि दोहरी नमूना तैयारी के लिए अनुमति देते हैं, कई अध्ययनों से अलग अध्ययन के लिए अलग नमूनों से पुस्तकालयों तैयार जब उपलब्ध है । हमारे जैसे एक अध्ययन के लिए, यह आम तौर पर कई रक्त के नमूने समय, उपभोग्य, और पशुओं के तनाव में वृद्धि की आवश्यकता होगी । हमारे अध्ययन के लक्ष्य को जानवरों से पूरे रक्त का उपयोग करने के लिए पहचान करने के लिए और दोनों mRNA और गैर कोडिंग आरएनए के विभिन्न वर्गों स्वस्थ और अत्यधिक रोगजनक सुअर का प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस (HP-PRRSV) के बीच व्यक्त करने में सक्षम होना था चुनौती9सूअरों,10 केवल एक ही पूरे रक्त का नमूना (प्रत्येक सुअर से २.५ मिलीलीटर) होने के बावजूद । आदेश में ऐसा करने के लिए, हम ठेठ निष्कर्षण और पुस्तकालय निर्माण प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए उचित डेटा उत्पंन करने के लिए दोनों mRNA और गैर कोडिंग आरएनए (ncRNA) अभिव्यक्ति11 के विश्लेषण के लिए एक एकल नमूना से अनुमति देने की जरूरत है ।

यह एक प्रोटोकॉल है कि mRNA और गैर कोडिंग आरएनए विश्लेषण के लिए अनुमति दी के लिए एक की जरूरत है क्योंकि उपलब्ध मानक किट और आरएनए के लिए तरीके-निष्कर्षण और पुस्तकालय निर्माण mRNA के लिए मुख्य रूप से इरादा थे और एक पाली-एक कमी चरण12का उपयोग करें । इस कदम के नमूने से गैर कोडिंग आरएनए या वायरल टेप को ठीक करने के लिए यह असंभव बना दिया होता । इसलिए, एक अनुकूलित विधि की जरूरत थी कि नमूना polyA कमी के बिना कुल आरएनए निष्कर्षण के लिए अनुमति दी । इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधि एक नमूना प्रकार के रूप में पूरे रक्त के उपयोग के लिए अनुमति देने के लिए और दोनों mRNA और छोटे और बड़े आकार के ncRNAs के लिए अनुक्रमण पुस्तकालयों का निर्माण करने के लिए अनुकूलित किया गया है । विधि सभी detectable गैर के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है RNAs कोडिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाद में जांच13के लिए वायरल RNAs बनाए रखने । सभी में, हमारे अनुकूलित पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल एक ही पूरे रक्त नमूना से कई आरएनए अणुओं की जांच के लिए अनुमति देता है ।

इस विधि के उपयोग के पीछे समग्र लक्ष्य एक प्रक्रिया है कि दोनों गैर कोडिंग आरएनए और पूरे रक्त का एक नमूना से mRNA के संग्रह के लिए अनुमति विकसित करने के लिए किया गया था । यह हमें mRNA, ncRNA, और हमारे अध्ययन में प्रत्येक जानवर के लिए वायरल आरएनए एक एकल नमूना9से स्रोत के लिए अनुमति देता है । यह, अंततः, अतिरिक्त पशु लागत के बिना अधिक वैज्ञानिक खोज के लिए अनुमति देता है और प्रत्येक व्यक्ति के नमूने की अभिव्यक्ति की एक और पूरी तस्वीर देता है । वर्णित विधि जीन अभिव्यक्ति के नियामकों की परीक्षा के लिए अनुमति देता है और साथ ही correlative दोनों mRNA और गैर कोडिंग आरएनए एक पूरे रक्त के नमूने का उपयोग कर अभिव्यक्ति की तुलना अध्ययन के पूरा होने की अनुमति के रूप में । हमारे अध्ययन इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया वायरल संक्रमित 9 सप्ताह पुराने पुरुष वाणिज्यिक सूअरों में जीन अभिव्यक्ति और संभव epigenetic नियामकों में परिवर्तन की जांच ।

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Protocol

पशु प्रोटोकॉल राष्ट्रीय पशु रोग केंद्र (USDA-ARS-NADC) पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. स्वाइन रक्त नमूनों का संग्रह

  1. आरएनए ट्यूब में रक्त के नमूने ले लीजिए । इकट्ठा ~ २.५ मिलीलीटर या अधिक अगर बड़ा संग्रह ट्यूबों उपलब्ध हैं ।

2. सूअर के रक्त के नमूनों का प्रसंस्करण

  1. ५,०२० एक्स जी में कमरे के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए रक्त ट्यूबों केंद्रापसारक । यदि प्रसंस्करण जमे हुए नमूनों 2 ज की एक ंयूनतम के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब केंद्रापसारक से पहले ।
  2. supernatant निकालें और गोली के लिए RNase मुक्त पानी की 8 मिलीलीटर जोड़ें । बंद करो और गोली भंवर जब तक यह दिख भंग है । ५,०२० x g पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना ट्यूबों गोली ठीक करने के लिए । सभी supernatant त्यागें और गोली की रक्षा ।

3. कुल आरएनए और लघु आरएनए (miRNA आइसोलेशन किट) के लिए कार्बनिक निष्कर्षण

  1. lysis बाध्यकारी बफर के pipetting ३०० µ एल द्वारा चरण २.२ से गोली को कुल आरएनए निष्कर्षण शुरू करो ।
  2. भंवर और एक नई बला १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब के मिश्रण हस्तांतरण । किट से homogenate additive के 30 µ एल जोड़ें । भंवर ट्यूब और बर्फ पर 10 मिनट के लिए जगह है ।
  3. ट्यूब निकालें और ३०० µ एल एसिड-phenol: क्लोरोफॉर्म एजेंट किट से जोड़ें । भंवर ट्यूब मिश्रण करने के लिए । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १०,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  4. ध्यान से जलीय चरण (300-350 µ एल) एक ताजा ट्यूब को हटा दें । अगले चरण के लिए वॉल्यूम नोट करें ।

4. कुल आरएनए अलगाव प्रक्रिया

  1. जलीय वसूली (300-350 µ एल) की राशि के आधार पर १००% (~ ३७५ µ एल) के 1.25 x मात्रा जलीय चरण इथेनॉल जोड़ें । एक पिपेट का उपयोग कर नमूना मिश्रण ।
  2. सेट अप नए संग्रह प्रत्येक नमूने के लिए एक फिल्टर कारतूस युक्त ट्यूब । पिपेट ~ ६७५ फिल्टर कारतूस पर lysate/इथेनॉल के मिश्रण के µ एल ।
    नोट: एक समय में फ़िल्टर कारतूस के लिए > ७०० µ एल मत जोड़ें । बड़ी मात्रा के लिए उत्तराधिकार में लागू होते हैं ।
  3. केंद्रापसारक संक्षेप में (~ 15-20 एस) १०,००० एक्स जी में फिल्टर के माध्यम से तरल पास । इस से अधिक कठिन स्पिन मत करो ।
  4. के माध्यम से प्रवाह त्यागें और, यदि आवश्यक हो, तो शेष lysate/इथेनॉल मिश्रण के साथ इस केंद्रापसारक को दोहराने जब तक यह सब लागू किया गया है । अगले कदम के लिए एक ही फिल्टर कारतूस और संग्रह ट्यूब को बनाए रखने ।
  5. फिल्टर कारतूस के लिए किट से धो समाधान 1 के ७०० µ एल जोड़ें और संक्षेप में (~ 10 एस) के लिए फिल्टर के माध्यम से खींच । के माध्यम से प्रवाह त्यागें और एक ही फिल्टर कारतूस और संग्रह ट्यूब को बनाए रखने ।
  6. जोड़ें ५०० µ धो समाधान 2/3 के एल । फिल्टर कारतूस के माध्यम से तरल आकर्षित करने के लिए केंद्रापसारक । के माध्यम से प्रवाह त्यागें । धो चरण दोहराएँ.
  7. विकट एक ही ट्यूब, फिल्टर कारतूस एक अतिरिक्त ६० फिल्टर से किसी भी अवशिष्ट तरल हटाने के लिए एस स्पिन । एक ताजा संग्रह ट्यूब के लिए फिल्टर कारतूस हस्तांतरण ।
  8. जोड़ें १०० पूर्व के µ एल गरम (९५ डिग्री सेल्सियस) nuclease-फिल्टर कारतूस के केंद्र के लिए मुफ्त पानी । लगभग 20-30 s के लिए स्पिन के ऊपर के स्तर पर अधिकतम गति केंद्रापसारक ।
    नोट: आरएनए eluate में निहित है और अब आगे संसाधित किया जा सकता है या पर संग्रहीत-20 ° c या नीचे. छोटे RNAs के लिए संवर्धन नहीं किया गया ।

5. ग्लोबिन कमी (सुअर का पूरे रक्त के नमूनों के लिए अनुकूलित एक प्रोटोकॉल के आधार पर)14,15

नोट: ग्लोबिन कमी की गई है ताकि पुस्तकालयों के साथ अधिक आबादी नहीं है ग्लोबिन जीन है, जो अधिक से अधिक ब्याज14,15 के अंय जीनों के लिए नक्शे उपलब्ध पढ़ता की संख्या कम होगा मानचित्रण पढ़ता है ।

  1. संकरण ग्लोबिन कमी ओलिगोस्पर्मिया
    1. आरएनए (6 µ g आरएनए नमूना अधिकतम 7 µ l मात्रा में) एक ०.२ मिलीलीटर पतली घिरी nuclease-मुक्त प्रतिक्रिया ट्यूब में निकाली नमूना pipetting द्वारा और 2 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकिल चालक में रखने के लिए प्रकृति । यह इष्टतम आरएनए गुणवत्ता के लिए पहली स्वभाव कदम के तुरंत बाद बर्फ ट्यूबों के लिए महत्वपूर्ण है । कोई DNase उपचार की जरूरत है ।
    2. जबकि ट्यूब कूल तैयार एक ४०० µ l के 10x ग्लोबिन कमी oligo मिश्रण: १०० µ l प्रत्येकी दोन बांधणी ओलिगोस्पर्मिया (5 '-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3 ', आणि 5 '-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3 ') 30 µ मी, दोन HBB ओलिगोस्पर्मिया (5 '-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3 ', आणि 5 '-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3 ') पर १२० µ मी प्रति प्रतिक्रिया, ७.५ µ मी बांधणी ओलिगोस्पर्मिया व 30 µ m HBB ओलिगोस्पर्मिया की अंतिम एकाग्रता पावरफुल आहे. तैयार 10x oligo संकरण बफर: १०० mM Tris-एचसीएल, पीएच ७.६; २०० मिमी KCl ।
    3. संकरण मिश्रण तैयार करें: आरएनए नमूना के 6 µ जी (अधिकतम 7 µ एल मात्रा), 2 µ एल के ४०० µ एल के 10x ग्लोबिन कमी oligo मिश्रण (अंतिम एकाग्रता 2x), 1 µ एल के 10x oligo संकरण बफर (अंतिम एकाग्रता 1x). 10 µ के एक अंतिम खंड के लिए nuclease-मुफ्त पानी जोड़ें l
    4. 5 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर thermocycler सेट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए तुरंत शांत और RNase एच पाचन के लिए आगे बढ़ें ।
  2. RNase एच पाचन
    1. पतला 10x RNase एच (10 U/µ एल) 1x RNase एच के साथ 1x RNase एच बफर ।
      नोट: RNase बफर 10x पर आता है और उपयोग करने से पहले 1x के लिए 1x RNase एच बफर के साथ पतला होने की आवश्यकता होगी ।
    2. के संयोजन से RNase एच रिएक्शन मिक्स तैयार: 10x RNase बफर के 2 µ एल, 1x RNase एच के 2 µ एल में RNase अवरोधक के 1 µ एल, और µ के 5 nuclease एल-एक कुल मात्रा को मुफ्त पानी 10 µ एल
    3. RNase एच रिएक्शन मिश्रण के 10 µ l के साथ ग्लोबिन कमी संकरण नमूनों को अच्छी तरह से मिक्स करें और 10 min. Cool करने के लिए 4 ° c के लिए ३७ ° c पर डाइजेस्ट करें ।
    4. बंद करो पाचन १.० ०.५ मीटर के µ एल के अलावा प्रत्येक नमूने को EDTA और सफाई कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ना ।
  3. RNase एच इलाज कुल आरएनए सफाई ।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक सिलिका-झिल्ली आधारित रेफरेंस शुद्धि सफाई किट का उपयोग कर RNase H स्वास्थ्यकर्मी आरएनए को शुद्ध करें । Premix बफ़र्स: हल्के वाशिंग बफर के लिए, १००% इथेनॉल के ४४ मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. नमूना एक नई ट्यूब करने के लिए स्थानांतरित नहीं करते । जोड़ने के ८० µ l के RNase-मुक्त पानी और ३५० µ l के lysis बफर. पतला आरएनए के लिए १००% इथेनॉल के २५० µ एल जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
      नोट: केंद्रापसारक मत करो । कदम 5.3.3 के लिए तुरंत आगे बढ़ें ।
    3. अब एक रेफरेंस फ़िल्टर एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रखा कारतूस के लिए ७०० µ एल नमूना स्थानांतरण के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा । ≥ ८,००० x gपर 15 एस के लिए केंद्रापसारक प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    4. एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रेफरेंस फिल्टर कारतूस रखकर इस दोहराएं । फिल्टर कारतूस के लिए हल्के धोने बफर के ५०० µ एल जोड़ें और 15 के लिए केंद्रापसारक ≥ ८,००० एक्स जी में आदेश फिल्टर कारतूस झिल्ली धोने के लिए । प्रवाह के माध्यम से त्यागें । चरण 5.3.5 में संग्रह ट्यूब पुन: उपयोग ।
    5. अब एक ही नमूना ट्यूब का उपयोग कर, फ़िल्टर कारतूस के लिए ८०% इथेनॉल के एक और ५०० µ एल जोड़ें । इस बार ≥ ८,००० एक्स जीमें 2 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक अगले कदम के लिए रेफरेंस स्पिन कॉलम लीजिए और दोनों प्रवाह के माध्यम से और संग्रह ट्यूब त्यागें ।
    6. एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में अंतिम चरण से रेफरेंस फिल्टर कारतूस रखो । ढक्कन फिल्टर कारतूस पर खुला छोड़ दो, और 5 मिनट के लिए पूरी गति से स्पिन कॉलम झिल्ली सूखी और इथेनॉल को रोकने पर ले जाने के लिए केंद्रापसारक । प्रवाह के माध्यम से और संग्रह ट्यूब त्यागें ।
      नोट: नुकसान कोण ढक्कन से बचने के लिए एक दिशा में सामने बात करने के लिए रोटर की है ।
    7. एक नया १.५ मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में सूखे फिल्टर कारतूस और जगह ले लो । RNase के 14 µ एल जोड़ें-फिल्टर कारतूस को नि: शुल्क पानी के लिए RNase मुक्त पानी सीधे केंद्र को जोड़ने यकीन कर । पूरी गति से ६० एस के लिए केंद्रापसारक elute ।
  4. ग्लोबिन-कम आरएनए नमूनों की गुणवत्ता का आकलन (चरण 6). mRNA नमूना तैयार करने के लिए आगे बढ़ें (चरण 7) और लघु आरएनए पुस्तकालय तैयारी (चरण 8)16,17.
    नोट: ग्लोबिन-कम आरएनए नमूने अब-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है, हालांकि भंडारण-८० डिग्री सेल्सियस लंबी अवधि के संरक्षण के लिए सिफारिश की है ।

6. आरएनए का मूल्यांकन

  1. एक spectrophotometer का उपयोग कर आरएनए एकाग्रता बढ़ाता है । २६० और २८० एनएम के तरंग दैर्ध्य अनुपात की जांच करें । ~ 2 या अधिक के अनुपात आरएनए के लिए शुद्ध माना जाता है और कम मूल्यों कुछ संदूषण संकेत मिलता है । साधन इस अनुपात का उपयोग करता है के रूप में आरएनए एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एनजी/µ एल
  2. एक उचित चिप पर नमूना के 1 µ एल (१०० एनजी) का उपयोग करके आरएनए गुणवत्ता का आकलन करें । अंतिम उत्पाद ~ 2 या उच्चतर और mRNA एकल पढ़ने के पुस्तकालयों के लिए ~ २८० nt पर एक चोटी के एक रिण होना चाहिए; १४३ पर लघु आरएनए पुस्तकालयों चोटियों miRNAs करने के लिए संगत ।

7. असहाय कुल आरएनए नमूना mRNA और लंबी ncRNA पुस्तकालयों के लिए तैयारी । 16

  1. नोट: कमरे के तापमान पर रेफरेंस बफर और rRNA रिमूवल मोतियों को लाएं । पूर्व लेबल 0.2 मिलीलीटर पतली दीवार वाली पीसीआर ट्यूब (प्लेट्स भी इस्तेमाल किया जा सकता है) । निर्माता के निर्देश पर आधारित प्रोटोकॉल चरण16.
    1. ग्लोबिन-कम आरएनए के 4 µ एल के साथ शुरू करो । nuclease के 6 µ l जोड़ें-मुफ्त पानी, rRNA बाध्यकारी बफर के 5 µ एल, और ट्यूब (1सेंट ट्यूब) प्रति µ हटाने के मिश्रण के 5 rRNA एल. मिश्रण और री-कैप को पिपेट । ६८ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १०० ° c गरम ढक्कन के साथ thermocycler में प्लेस । निकालें और ६० एस के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें ।
    2. भंवर द्वारा rRNA हटाने मोती resuspend; 2एन डी ट्यूब में मोतियों पर 1सेंट ट्यूबों से नई (2एन डी) पीसीआर ट्यूब और पिपेट नमूना के लिए मोतियों की ३५ µ एल जोड़ें । 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2एन डी पीसीआर ट्यूब मशीन । 7 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर प्लेस ।
      नोट: प्रत्येक नमूना अच्छी तरह से इष्टतम rRNA कमी के लिए pipetting द्वारा मिश्रण । स्टैंड में ट्यूब बढ़ाने/तेज जुदाई प्रक्रिया में मदद मिल सकती है ।
    3. 3rd पीसीआर ट्यूब मिलान करने के लिए 2एन डी पीसीआर ट्यूब से supernatant हस्तांतरण और ६० एस की एक न्यूनतम के लिए चुंबकीय स्टैंड पर जगह है. स्थानांतरण को एक नई पीसीआर ट्यूब में दोहराएं तभी मोतियों को ट्यूब साइड में नहीं ले जाया जाता ।
    4. भंवर द्वारा मिश्रण नमूना शुद्धि मोती; प्रत्येक 3rd पीसीआर ट्यूब के लिए ९९ µ एल जोड़ें । 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए अनुमति दें 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर प्लेस. मोती पक्षों को ले जाता है सुनिश्चित करें । पिपेट को त्याग supernatant ।
    5. 3rd ट्यूब चुंबकीय स्टैंड पर सेट रखें । जोड़ें २०० µ ७०% इथेनॉल whilst के मोती झटका नहीं सावधान किया जा रहा है । supernatant को छोड़ने के लिए कम से 30 एस और पिपेट के लिए बैठने की अनुमति दें । दोहराएँ चरण.
    6. चुंबकीय स्टैंड पर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखे के लिए नमूना की अनुमति दें । ६०० एक्स जीमें 5 एस के लिए किट रेफरेंस बफर केंद्रापसारक ट्यूब निकालें और अच्छी तरह से मिलाते हुए रेफरेंस बफर के 11 µ एल जोड़ें । बेंच पर 2 मिनट के लिए गर्मी तो कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड पर कम से 5 मिनट ।
    7. supernatant 3rd से एक नया (4वें) पीसीआर ट्यूब के लिए स्थानांतरण ८.५ µ एल । Elute/प्रधानमंत्री के ८.५ µ एल जोड़ें/किट से उच्च मिश्रण । अच्छी तरह मिलाएं । कैप और ९४ डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए पूर्व गर्म ढक्कन के साथ एक thermocycler में जगह, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो । निकालें और संक्षेप में केंद्रापसारक ।
  2. संश्लेषित प्रथम किनारा सीडीएनए
    1. कमरे के तापमान के लिए आने के लिए किट से पहला किनारा संश्लेषण मिश्रण की अनुमति दें और 5 एस के लिए ६०० × जी पर केंद्रापसारक करने के लिए $7 के हस्तांतरण ५० µ l रिवर्स transcriptase के पहले किनारा संश्लेषण मिश्रण में. रिवर्स transcriptase 1:9 के अनुपात में पहली किनारा संश्लेषण के लिए जोड़ा जा सकता है ।
    2. पिपेट 8 µ l के संयुक्त रिवर्स transcriptase/पहला किनारा संश्लेषण मिश्रण के साथ 4 ट्यूब में नमूना. कैप और केंद्रापसारक 5 एस के लिए ६०० एक्स जी thermocycler में पूर्व-गरम ढक्कन सेट के साथ १०० डिग्री सेल्सियस पर जगह । के लिए भागो: 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, ४२ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट, ७० डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर आराम करो । अंतिम मात्रा में अच्छी तरह से प्रति ~ 25 µ एल है । अगले चरण पर तुरंत ले जाएं ।
  3. संश्लेषित दूसरा किनारा सीडीएनए
    1. अंत मरंमत एजेंट लाओ (अं) और दूसरा किनारा मिश्रण (एसएसएम) कमरे के तापमान के लिए, और 5 एस के लिए ६०० x g पर केंद्रापसारक मिश्रण 1:50 कमजोर पड़ने पर reagent बफर के साथ गलती । Uncap 4गु ट्यूब और प्रत्येक को एसएसएम के पतला अं और 20 µ l के 5 µ l को जोड़ें; पिपेट को अच्छी तरह मिला लें । अंतिम volume ~ ५० µ एल डी एस सीडीएनए ।
    2. 16 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए thermocycler में कैप और मशीन । जब चक्र पूरा हो गया है, टोपियां हटाने और बेंच शीर्ष पर कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. ds सीडीएनए क्लीन-अप चरण
    1. ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (SPRI) भंवर द्वारा paramagnetic मोती मिश्रण से शुरू करो । 4वेंट्यूब (डी एस सीडीएनए) और मिश्रण में नमूने के लिए मोतियों की ९० µ एल स्थानांतरण । अंतिम मात्रा १४० µ एल है ट्यूबों के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मशीन के लिए बैठने की अनुमति ~ 5 मिनट । निकाल ~ १३५ प्रत्येक कुआं से supernatant के µ l प्रत्येक कुआं में 5 µ l को छोड़ देना चाहिए ।
    2. चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब छोड़ दो और ८०% इथेनॉल के २०० µ एल जोड़कर धो लो । 30 एस के लिए बैठने की अनुमति दें तो निकालें और supernatant त्यागें । धो चरण दोहराएँ. 15 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों छोड़ शुष्क करने की अनुमति ।
    3. कमरे के तापमान में आने के बाद 5 एस के लिए ६०० x g पर resuspension बफर केंद्रापसारक । स्टैंड से ट्यूबों निकालें । स्थानांतरण १७.५ µ ट्यूब और मिश्रण करने के लिए resuspension बफर के एल । चलो ट्यूबों 2 मिनट के लिए बेंच शीर्ष पर तो मशीन 5 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड के लिए कदम ।
    4. पिपेट 15 µ एल के नए सेट करने के लिए डी एस सीडीएनए नमूने युक्त supernatant के (5वें) ०.२ मिलीलीटर पतली दीवारों ट्यूबों । अगले कदम तुरंत करने के लिए ले जाएँ या सील और 7 दिन से अधिक नहीं के लिए-15 डिग्री सेल्सियस के लिए-25 डिग्री सेल्सियस की दुकान ।
  5. Adenylate 3 ' समाप्त होता है ।
    1. पिपेट २.५ µ एल कमरे के तापमान resuspension नमूना ट्यूब में बफर फिर गल ए पूंछ मिश्रण के १२.५ µ एल जोड़ें । पूरी तरह से pipetting द्वारा मिश्रण ।
      नोट: कोई A-पुच्छ नियंत्रण उपयोग किया जाता है ।
    2. कैप और १०० ° c पूर्व गर्म ढक्कन के साथ एक thermocycler में मशीन । 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर चलाने के लिए, तो ७० डिग्री सेल्सियस पर गर्म ढक्कन के साथ 5 मिनट के लिए । thermocycler को 4 डिग्री सेल्सियस पर आराम करने की अनुमति दें ।
  6. Ligate इंडेक्स एडेप्टर्स
    1. कमरे के तापमान के लिए आरएनए अनुकूलक ट्यूबों और स्टॉप बंधाव बफर मिश्रण लाओ । प्रत्येक के लिए, 5 एस के लिए ६०० x g पर केंद्रापसारक उपयोग के लिए तैयार जब तक फ्रीजर में बंधाव मिश्रण छोड़ दें । अनुक्रमण के लिए नमूना पूलिंग व्यवस्था ज्ञात किया जाना चाहिए ।
    2. एक नमूना ट्यूब के लिए बंधाव मिश्रण के २.५ µ एल resuspension बफर और २.५ µ एल जोड़ें । अब प्रत्येक नमूना ट्यूब में उचित आरएनए एडेप्टर के २.५ µ l में पिपेट. एडेप्टर चयन चुने गए किट के लिए निर्माता के निर्देशों के द्वारा किया जाना चाहिए ।
    3. संक्षिप्त और 1 मिनट के लिए २८० x gपर केंद्रापसारक द्वारा मिश्रण 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक थर्मल साइकिल चालक में मशीन । प्रतिक्रिया को रोकने और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए नमूने के लिए Stop बंधाव बफर के 5 µ एल जोड़ें ।
    4. ६० एस के लिए भंवर द्वारा SPRI paramagnetic मोती मिश्रण से साफ-अप शुरू ४२ प्रत्येक ट्यूब के लिए मोतियों की µ एल हस्तांतरण । मिश्रण thoroughlythen पीठ शीर्ष पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
    5. चुंबकीय स्टैंड के लिए ट्यूबों हटो और छोड़ तरल जब तक स्पष्ट (~ 5 मिनट) बदल जाता है । एक बार साफ़ निकालें और supernatant के ७९.५ µ l को छोड़ें । चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों छोड़ दो और ८०% इथेनॉल के २०० µ एल जोड़कर धो लो । के लिए बैठने की अनुमति दें कम से 30 एस तो हटाने और supernatant त्यागें । धो चरण दोहराएँ. अतिरिक्त ~ 15 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर छोड़ने के लिए सुखाने के लिए अनुमति देते हैं । धोने चरणों के दौरान मोती बाधित मत करो ।
    6. नमूना ट्यूब करने के लिए resuspension बफर के ५२.५ µ एल जोड़ें और मोतियों को पूरी तरह से फिर से निलंबित कर रहे हैं जब तक मिश्रण. बेंच शीर्ष पर 2 मिनट के लिए मशीन । तरल स्पष्ट है जब तक नमूना ट्यूब वापस चुंबकीय स्टैंड को ले जाएँ (~ 5 मिनट).
    7. स्टैंड पर छोड़ दो और धीरे पिपेट ५० µ एल supernatant के नए (6वें) ट्यूबों । भंवर SPRI मोतियों की ५० µ एल जोड़ें । 15 मिनट के लिए बेंच शीर्ष पर मशीन की अनुमति दें ।
    8. चुंबकीय स्टैंड के लिए ले जाएँ और प्लेट तरल (~ 5 मिनट) स्पष्ट बदल जाता है जब तक रहने दो । त्यागें ९५ के µ l को छोड़ supernatant 5 µ l प्रत्येक ट्यूब में.
    9. चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों छोड़ दो और ८०% इथेनॉल के २०० µ एल जोड़कर धो लो । अनुमति ट्यूब 30 एस के लिए बैठने के लिए तो निकालें और supernatant त्यागें । धो दोहराएं । चलो ट्यूबों 15 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर सूखी ।
    10. २२.५ µ एल में जोड़ें resuspension बफर और मोतियों को जब तक मिश्रण निलंबित कर रहे हैं । 2 मिनट के लिए बेंच पर मशीन तो चुंबकीय स्टैंड के लिए कदम जब तक तरल (~ 5 मिनट) स्पष्ट हो जाता है । नई पीसीआर ट्यूबों (7th) में सैंपल की पिपेट 20 µ एल.
  7. कमरे के तापमान के लिए आवश्यक किट घटकों लाओ । पीसीआर प्राइमरी मिक्स और पीसीआर मास्टर मिक्स के 25 µ एल के 5 µ l को किट से नमूना (7th पीसीआर ट्यूब) अनुक्रमित नमूनों से युक्त स्थानांतरण । मिक्स नमूना और कैप ट्यूब ।
    1. थर्मल साइकिल चालक में पूर्व गर्म ढक्कन के साथ ट्यूबों प्लेस । भागो कार्यक्रम: ९८ ° c के लिए 30 s, तो 15 चक्र के लिए ९८ ° c 10 s, ६० ° c के लिए 30 s, ७२ ° c के लिए 30 s, ७२ ° c के लिए 5 min. 4 ° c पर होल्ड करें.
  8. नमूना ट्यूब और पिपेट गठबंधन करने के लिए पर्याप्त रूप से मिश्रित SPRI मोतियों की ५० µ एल जोड़कर नमूनों को साफ. 15 मिनट के लिए बेंच शीर्ष पर मशीन के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति दें ।
    1. एक चुंबकीय खड़ा करने के लिए ट्यूब ले जाएँ और जब तक तरल स्पष्ट (~ 5 मिनट) बदल जाता है । त्यागें ९५ के µ l को छोड़ supernatant 5 µ l प्रत्येक ट्यूब में.
    2. चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब छोड़ दो और ८०% इथेनॉल के २०० µ एल जोड़कर धो लो । के लिए बैठने की अनुमति दें कम से 30 एस और फिर हटाने और supernatant त्यागें । इस वाश चरण को दोहराएं । 15 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर छोड़ शुष्क करने की अनुमति ।
    3. resuspension बफर और मिश्रण के ३२.५ µ एल में जोड़ें जब तक मोती पूरी तरह से फिर से निलंबित कर रहे हैं । 2 मिनट के लिए बेंच पर मशीन तो चुंबकीय स्टैंड के लिए कदम जब तक तरल (~ 5 मिनट) स्पष्ट हो जाता है । पिपेट एक नई पीसीआर ट्यूब में प्रत्येक ट्यूब से नमूना के 30 µ एल ।
    4. उचित चिप के साथ ६.१ और ६.२ कदम दोहराकर डीएनए मात्रा और गुणवत्ता का आकलन करें । चरण (चरण 9) पूलिंग के लिए ले जाएँ ।

8. लघु आरएनए पुस्तकालय sncRNAs के लिए तैयारी । 17

नोट: निर्माता के निर्देश पर आधारित प्रोटोकॉल चरण17.

  1. लघु आरएनए पुस्तकालय तैयारी के साथ शुरू ~ २२० एनजी-~ १.१ µ g/µ एल के ग्लोबिन-कम आरएनए नमूने (4 µ l).
  2. एडेप्टर बंधाव
    1. Ligate 3 '-अनुकूलक मिश्रण द्वारा अच्छी तरह से 1 µ एल के अनुकूलक, 2 µ एल के nuclease-मुक्त पानी, और 4 µ एल की ग्लोबिन-कम आरएनए नमूना. 2 मिनट के लिए ७० ° c पर मशीन और फिर तुरंत बर्फ पर जगह है ।
    2. 2x बंधाव बफर के 10 µ एल जोड़ें, और बंधाव एंजाइम मिश्रण के 3 µ एल, मिश्रण और 18 एच के लिए 16 डिग्री सेल्सियस की मशीन ।
      नोट: 16 डिग्री सेल्सियस के कम तापमान पर 18 घंटे के लिए नमूना मशीन समय में वृद्धि इस तरह के piwi RNAs के रूप में methylated आरएनए प्रजातियों, में रुचि अध्ययन के लिए सिफारिश की है. अब मशीन समय अधिक से अधिक बंधाव दक्षता 3 ' अनुकूलक बंधाव चरण के दौरान संशोधनों के वर्ग के कारण के लिए अनुमति देता है ।
    3. nuclease के ४.५ µ l में रिवर्स प्रतिलेखन प्राइमर के 1 µ एल जोड़ें-बंधाव मिश्रण करने के लिए नि: शुल्क पानी के एडेप्टर-डिमर गठन को रोकने के लिए अतिरिक्त 3 ' अनुकूलक ।
    4. ७५ डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट में ३७ डिग्री सेल्सियस, 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ में 5 मिनट के लिए क्रमादेशित एक कचौरी थर्मल साइकिल चालक में मशीन ।
    5. प्रकृति 1 µ एल के पूर्व पतला 5 '-७० ° c पर एक थर्मल साइकिल चालक में नमूना प्रति 2 मिनट के लिए अनुकूलक और फिर तुरंत बर्फ पर जगह है ।
    6. इसमें 1 µ l को विकृत 5 '-अनुकूलक, 1 µ l का 10x 5 ' बंधाव बफर और २.५ µ l का 5 ' बंधाव एंजाइम जोड़ें. मिश्रण और 1 एच के लिए 25 डिग्री सेल्सियस गर्मी ।
  3. सीडीएनए संश्लेषण आणि प्रवर्धन
    1. pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण 30 µ एल के 5 '/3 ′-अनुकूलक-ligated आरएनए, 8 µ एल के पहले किनारा बफर, 1 µ एल के RNase अवरोधक और रिवर्स µ के 1 transcriptase एल. ६० मिनट के लिए ५० ° c पर मिश्रण की मशीन । पीसीआर प्रवर्धन या गर्मी के लिए तुरंत आगे बढ़ें 15 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को निष्क्रिय और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. पीसीआर ने ४० µ एल रिवर्स Transcriptase रिएक्शन को जोड़कर ५० µ पीसीआर मास्टर मिक्स के एल, २.५ µ एल आरएनए पीसीआर प्राइमर, के लिए नामित आरएनए पीसीआर प्राइमर सूचकांक के २.५ µ एल जोड़ने के लिए नमूना है, और nuclease द्वारा १०० µ एल मिश्रण की कुल मात्रा को pipetting से मुक्त पानी. थर्मल साइकिल चालक में पीसीआर चलाने निम्नलिखित सायक्लिंग शर्तों का उपयोग: प्रारंभिक विकार ९४ ° c 30 s के लिए; 15 एस के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस के 11 चक्र, 30 एस के लिए ६२ डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और विस्तार के लिए ७० ° c पर 15 s; 5 मिनट के लिए ७० ° c पर एक अंतिम विस्तार से पीछा किया; नमूने साइकिल चालक में 4 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जा सकता है ।
    3. नोट: इंडेक्स नमूना पूलिंग के उद्देश्य के लिए जोड़े जाते हैं ।
  4. नमूना साफ-अप
    1. डीएनए सफाई किट से ५०० µ एल बंधन बफर के जोड़ें (5 एम गुजरात-एचसीएल, 30% isopropanol) पीसीआर के १०० µ एल करने के लिए संवर्धित नमूना स्पिन-स्तंभ झिल्ली के लिए सक्षम करने के लिए बाध्यकारी ।
      नोट: यदि बाइंडिंग बफ़र में pH संकेतक शामिल है जांच करें कि मिश्रण का रंग पीला है ।
    2. पिपेट ६०० µ एल नमूना और बाध्यकारी बफर का मिश्रण एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब के अंदर एक फिल्टर कारतूस में, 30-60 एस के लिए स्पिन १७,९०० एक्स जी में एक तालिका के ऊपर केंद्रापसारक में । प्रवाह-थ्रू छोड़ें ।
    3. किट धोने बफर की आपूर्ति की ०.७५ मिलीलीटर के साथ एक ही संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस धो (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५, ८०% इथेनॉल) 30-60 एस के लिए कताई द्वारा १७,९०० एक्स जी में एक तालिका के ऊपर केंद्रापसारक और प्रवाह के माध्यम से खारिज । एक अतिरिक्त ६० एस के लिए फिल्टर कारतूस सूखी स्पिन ।
    4. एक साफ १.५ मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में फिल्टर कारतूस प्लेस । रेफरेंस बफर के 30 µ l को जोड़ें (10 mM Tris-HCl pH ८.५), कॉलम को ६० s के लिए खड़े होने दें, और फिर ६० s के लिए स्पिन को १७,९०० x g पर एक तालिका में रखें ।
  5. उचित डीएनए चिप के साथ कदम ६.१ और ६.२ दोहरा द्वारा नमूना गुणवत्ता का आकलन करें । कदम पूलिंग (चरण 9) के लिए ले जाएँ ।

9. sequencing के लिए नमूना पूलिंग

  1. पूल और बारकोड की स्थापना और लेबलिंग नई ट्यूबों (या एक ९६ अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट) द्वारा QC'ed नमूने या तो mRNA या ncRNA नमूने शामिल हैं । निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रत्येक बारकोड 10nM पुस्तकालय के 13 µ l को इसी ट्यूबों (या कुओं को नई प्लेट में) अंतरण16,17. अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत नमूनों जमा, समान पढ़ें लंबाई का चयन करने के लिए कुछ हो सकता है अगर नमूने एक ही चिप पर चलाने के लिए कर रहे हैं.

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Representative Results

हमारे अध्ययन में प्रतिनिधि नमूने ग्लोबिन और राइबो-समाप्त पूरे रक्त के नमूने हैं । प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि परिणाम 7 से ऊपर एक आरएनए अखंडता संख्या (रिन) के साथ एक ग्लोबिन समाप्त पुस्तकालय नमूना के होते हैं (चित्रा 1ए) और पर या 2 से ऊपर 260/280 एनएम एकाग्रता अनुपात (चित्रा 1बी और 1c). नमूना परिणाम के सत्यापन spectrophotometer का उपयोग कर प्रत्येक पुस्तकालय और चिप के अंतिम एकाग्रता देने के लिए प्रदर्शन किया गया था आधारित ट्रो चोटियों कि दिखाने के ग्राफ के साथ रिण संख्या देने के लिए जो अणुओं (mRNA या ncRNA) के आधार पर कब्जा कर लिया गया पूलिंग और sequencing करने से पहले लायब्रेरी नमूना में आकार सम्मिलित करें । वर्तमान अध्ययन के लिए ध्यान mRNA और छोटे ncRNAs पर ही रखा गया था । mRNA पुस्तकालयों प्रतिनिधि परिणाम के लिए ~ २८० bp पर एक electropherogram चोटी है (चित्रा 1डी) । छोटे ncRNAs प्रतिनिधि परिणामों के लिए ~ १४३ और ~ १५३ बीपी पर चोटियों के साथ ~ 100-400 bp (चित्रा 1ई) से चोटियों की एक श्रृंखला से मिलकर बनता है, क्रमशः miRNAs और पि्रंस के अनुरूप है । हमारे नमूना परिणाम से पता चला कि हमारे अनुकूलित तकनीक रिण संख्या है कि ६.३ से लेकर (उप इष्टतम) ९.२ (इष्टतम ऊपर) के साथ पुस्तकालयों के परिणामस्वरूप । यह अंय अध्ययनों कि ग्लोबिन कमी तरीकों का इस्तेमाल किया और केवल पर या 6 के पास रिण संख्या प्राप्त करने में सक्षम थे की तुलना में एक सुधार साबित हुआ । चिप आधारित ट्रो परिणाम यह भी पता चला है कि एक एकल रक्त नमूना से यह दोनों mRNA और ncRNA का प्रतिनिधित्व चोटियों की आरएनए अणु कब्जा प्राप्त करने के लिए संभव है (1 d और 1e), और नमूना सम्मिलित आकार है कि दोनों छोटे और बड़े कवर गैर-आरएनए अणु कोडिंग । इन परिणामों इष्टतम रिण स्कोर और डालने के लिए गुणवत्ता की प्रतिलिपि सुनिश्चित करने की जरूरत आकार के प्रतिनिधि है लगभग सभी NGS आरएनए-seq प्लेटफार्मों के लिए तैयार पुस्तकालयों से अनुक्रम कर सकते है पढ़ता है ।

Figure 1
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Figure 1b
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Figure 1c
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Figure 1d
चित्र 1 d : कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 1e
चित्रा 1e : सुअर का पूरे रक्त के एकल नमूनों से mRNA और गैर कोडिंग आरएनए अभिव्यक्ति पुस्तकालयों के लिए प्रतिनिधि परिणाम । (क) ट्रो फ़ाइल चलाने के सारांश प्रतिनिधित्व रिण संख्या पूर्व ग्लोबिन कमी और पोस्ट-ग्लोबिन कमी । प्रतिनिधि electropherograms (ख) प्री-ग्लोबिन कमी और (ग) पद-ग्लोबिन कमी एक एकल सुअर का पूरे रक्त का नमूना. (घ) ग्लोबिन और राइबो के प्रतिनिधि electropherograms-समाप्त पूरे रक्त mRNA पुस्तकालय नमूनों पूलिंग और अनुक्रमण करने से पहले. (ङ) ग्लोबिन समाप्त sncRNA के प्रतिनिधि electropherograms एक ही नमूने के पैनल डी में छपी के पूरे रक्त पुस्तकालयों पूलिंग और अनुक्रमण करने से पहले कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम है कि यह बनाया अनुकूलित जोड़ा ग्लोबिन कमी कदम है, जो यह संभव गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए पूरे रक्त के नमूनों से पढ़ता शामिल थे । sequencing अध्ययन में पूरे रक्त का उपयोग करने पर सबसे बड़ी सीमाओं में से एक नमूना है कि ग्लोबिन अणुओं को नक्शा और कम पढ़ता है कि ब्याज18के अंय अणुओं को मैप सकता है में पढ़ता है की उच्च संख्या रहे हैं । इसलिए, हमारे नमूना प्रकार के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन में, हम एक ग्लोबिन कमी कदम को शामिल करने के लिए उच्चतम संभव mRNA और अनुक्रमण के माध्यम से गैर-कोडन आरएनए कब्जा सुनिश्चित करने की जरूरत है । नमूनों की सभी ग्लोबिन टेप सुअर का विशिष्ट हीमोग्लोबिन ए और बी (बांधणी और HBB) oligonucleotides एट अलसे प्रक्रिया के आधार पर, २०१४14का उपयोग कर के उच्च स्तर के लिए खाते के लिए समाप्त ग्लोबिन थे । एक और महत्वपूर्ण कदम एक राइबो-घट निष्कर्षण किट जो क्षमता हमारे नमूनों से अवांछित आरएनए अणुओं को हटाने के लिए अनुमति के उपयोग के साथ-साथ polyadenylated गैर कोडिंग और प्रयोगात्मक ब्याज की वायरल आरएनए अणुओं को बनाए रखने के भीतर था अनुक्रमण के लिए हमारे पुस्तकालयों19. इसके अतिरिक्त, हम छोटे आरएनए संवर्धन और आकार चयन चरणों को हटाने के द्वारा दोनों कोडिंग (mRNA) और गैर कोडिंग (छोटे और लंबे) आरएनए पुस्तकालयों बनाने के लिए एक नमूने के साथ काम करने में सक्षम थे । ऐसा करके, हम पूलिंग के लिए आरएनए aliquots को अधिकतम करने में सक्षम थे और हम अनुक्रमण के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त मात्रा भेजा गारंटी करने के लिए. निर्माता के सभी प्रोटोकॉल के अनुकूलन के बहाव पुस्तकालय निर्माण के लिए mRNA और गैर कोडिंग आरएनए वसूली बढ़ाने के लिए किया गया था । हम भी methylated RNAs की बंधाव दक्षता बढ़ाने के लिए निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार पीसीआर मशीन के लिए अतिरिक्त समय जोड़कर हमारे बहाव विश्लेषण के छोटे गैर कोडिंग आरएनए भाग के लिए गैर कोडिंग आरएनए पुस्तकालय तैयारी अनुकूलित और piwi-RNAs से उबरने की संभावना ।

अनुकूलित प्रोटोकॉल की सीमाओं विशिष्टता है कि यह भी एक नमूना से कई विश्लेषण के लिए आदर्श बनाता है की कमी में निहित हैं । गैर कोडिंग आरएनए पुस्तकालय तैयारी के संवर्धन और आकार चयन भागों को दूर करके, हम दोनों छोटे और लंबे गैर-कोडिंग आरएनए अणु प्राप्त करने के खिलाफ यह संतुलन के लिए उपन्यास लघु आरएनए डिस्कवरी20 सीमित कर रहे हैं । इसलिए, अनुकूलित प्रोटोकॉल के प्रकार का एक अच्छा सिंहावलोकन देता है गैर कोडिंग अभिव्यक्ति लेकिन, मानचित्रण के विश्लेषणात्मक चरण के दौरान अतिरिक्त प्रसंस्करण की आवश्यकता है और वर्गों और गैर के आकार-कोडिंग आरएनए अभिव्यक्ति में कब्जा कर लिया पर अधिक विशिष्ट जानकारी हासिल नमूना. विधि के लिए एक और सीमा ग्लोबिन कमी कदम है, जो समग्र रिण संख्या कम हो जाएगा के शामिल करने के कारण है । हम पहले और ग्लोबिन कमी के बाद पहले रिण संख्या की जांच द्वारा इस समस्या निवारण के लिए कैसे आरएनए अखंडता में कमी के बड़े हम अनुभव होगा समझने में सक्षम थे । यह परिणाम है कि हम ~ 1-2 अंक की एक बूंद का अनुभव कर सकता दिखाया उपज । इस ड्रॉप के लिए खाते में हम आगे की सिफारिश की 10 µ जी के बजाय नमूना के 6 µ g करने के लिए ग्लोबिन कमी प्रोटोकॉल अनुकूलित यह हमारे रिण संख्या में सुधार करने के लिए, साथ ही, नमूना संरक्षण में मदद की । इसके अतिरिक्त, हम भी पतली घिरी microamp प्रतिक्रिया ट्यूबों का इस्तेमाल किया और तुरंत पहले denaturing कदम के बाद ट्यूब ठंडी । यह हमें प्रतिक्रिया जल्दी बुझाने के लिए अनुमति दी, ग्लोबिन समाप्त नमूनों पर बेहतर रिण संख्या के लिए अनुमति ।

इस अध्ययन में प्रयुक्त संशोधित प्रोटोकॉल आधार पुस्तकालय तैयारी अन्य अध्ययनों में इस्तेमाल किया तरीकों पर कई लाभ है, जहां केवल mRNA या गैर कोडिंग आरएनए अलग से अध्ययन कर रहे हैं. हम अनुकूलन के लिए हमारे नमूना प्रकार के रूप में पूरे रक्त के कुशल उपयोग के लिए अनुमति दी परिवर्तन । यह भविष्य के अध्ययनों के लिए लाभप्रद है क्योंकि एक नमूना प्रकार के रूप में पूरे रक्त रक्त के ल्युकोसैट भाग से संग्रह और प्रसंस्करण के लिए कम कदम है । इसके अतिरिक्त, पूरे रक्त भी शोधकर्ताओं प्रणालीगत प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए अनुमति देने के अतिरिक्त लाभ है और बार जानवर से एकत्र किया जा सकता है । हालांकि, वहाँ में पूरे रक्त के नमूनों के उपयोग के लिए एक चेतावनी है कि रक्त एकत्र की राशि प्रश्न में जीव की उम्र और आकार पर निर्भर है । रक्त की छोटी मात्रा कम आरएनए पैदावार के लिए नेतृत्व करेंगे, लेकिन यहाँ प्रस्तुत विधि पूरे रक्त की कम से २.५ मिलीलीटर से दोहरी पुस्तकालय निर्माण की अनुमति देगा । यह हमारे लिए अनुमति दी दोनों mRNA और गैर कोडिंग अभिव्यक्ति की जांच और एक व्यक्ति को दोनों समय में एक स्नैपशॉट पर सहसंबंधी बनाना, प्रभावी रूप से हमें पारंपरिक पुस्तकालय तैयारी के तरीकों से अधिक जानकारी एकत्र करने की अनुमति के लिए एक नमूना का उपयोग करें । इसके अलावा, राइबो-घट प्रदर्शन हम यह टेप है कि sequencing घट सकता है कम करना संभव बनाया, जबकि अभी भी गैर-कोडिंग और वायरल टेप है कि पारंपरिक पुस्तकालय के निर्माण के दौरान खो दिया जा सकता है mRNA अध्ययन को बनाए रखने के । इस तरह हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल जानकारी है कि एक एकल नमूने से प्राप्त किया जा सकता है की राशि ट्रिपल । हम अधिक आरएनए प्रजातियों के कब्जे की सुविधा के लिए विधि के लिए किए गए अन्य महत्वपूर्ण परिवर्तनों की जानकारी थे: पीसीआर प्लेट के प्रकार को बदलने जल्दी प्रतिक्रिया है, जो बेहतर आरएनए शुद्धता उपज को रोकने के लिए; methylated RNAs की संभव वसूली के लिए बंधाव बढ़ाने के लिए एक लंबा thermocycler की मशीन; और एक आकार चयन जेल को रोजगार नहीं है, की पहचान करने के लिए सभी जासूसी ncRNAs के लिए अनुमति देने के लिए लंबाई की परवाह किए बिना । बहाव विश्लेषण के लिए यह कई गैर के कब्जा के लिए अनुमति दी 18nt-200nt के बीच लंबाई में कोडिंग RNAs ।

इस विधि को अनुकूलित रोजगार के द्वारा, हमारे समूह को आगे एक प्रोटोकॉल है कि पूरे रक्त transcriptomic विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है और mRNA और गैर एक एकल नमूने से-कोडिंग आरएनए के लिए अनुमति देने में सक्षम था ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस लेख में व्यापार के नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख केवल विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के प्रयोजन के लिए है और अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा सिफारिश या समर्थन मतलब नहीं है । USDA एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है ।

Acknowledgments

यह काम मुख्य रूप से usda निफा आफरी 2013-67015-21236 द्वारा समर्थित था, और भाग में usda निफा आफरी 2015-67015-23216 द्वारा । इस अध्ययन के भाग में कृषि अनुसंधान सेवा अनुसंधान भागीदारी ओक रिज संस्थान द्वारा प्रशासित विज्ञान और शिक्षा (ORISE) के लिए अमेरिका के ऊर्जा विभाग के बीच एक समझौता समझौते के माध्यम से प्रबंध कार्यक्रम के लिए एक नियुक्ति द्वारा समर्थित किया गया था ( डो) और अमेरिका के कृषि विभाग । ORISE द्वारा प्रबंधित किया जाता है ओक रिज संबद्ध विश्वविद्यालयों के तहत डो अनुबंध सं. DE-AC05-06OR2310 ।

हम HP-PRRSV संक्रामक क्लोन के लिए dr. Kay Faaberg शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, डॉ Susan Brockmeier प्रयोग में शामिल पशुओं के साथ उसकी मदद के लिए, और मुकदमा Ohlendorf पांडुलिपि की तैयारी में सचिवीय सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAXgene Tubes PreAnalytix 762165
Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
mirVana miRNA Isolation Kit ThermoFisher AM1560
Rneasy MinElute Clean Up Kit QIAGEN 74204
100% Ethanol Decon Labs, Inc. 2716
0.2 mL thin-walled tubes ThermoFisher 98010540
1.5 mL RNase/DNase - free tubes Any supplier
Veriti 96-well Thermocycler ThermoFisher 4375786R
Globin Reduction Oligo (α 1) Any supplier Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (α 2) Any supplier Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1) Any supplier Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2) Any supplier Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
-KCl Millipore Sigma 60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
 -DTT ThermoFisher Y00147
 -MgCl2 Promega A351B
 -Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
RNase H ThermoFisher AM2292
SUPERase-IN ThermoFisher AM2694 Rnase inhibitor
EDTA Millipore Sigma E7889
Microcentrifuge Any supplier
 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument Agilent Technologies G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies 5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  Kit Agilent Technologies 5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero  Illumina RS-122-2201 mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A  (48 samples, 12 indexes)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide Illumina Available on-line
RNAClean XP Beads BeckmanCoulter A63987
AMPure XP Beads BeckmanCoulter A63880
MicroAmp Optical 8-tube Strip ThermoFisher N8010580 0.2 ml thin-walled tubes
MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap ThermoFisher N801-0535
RNase/DNase - free reagent reservoirs Any supplier
SuperScript II Reverse Transcriptase ThermoFisher 18064-014
MicroAmp Optical 96 well plates ThermoFisher N8010560 These were used in place of .3mL plates as needed
MicroAmp Optical adhesive film ThermoFisher 4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1)  New England Biolabs E73005 small RNA kit
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2)  New England Biolabs E75805 small RNA kit
QIAQuick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
96S Super Magnet Plate ALPAQUA A001322

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४१ mRNA गैर कोडिंग आरएनए आरएनए-Seq पूरे रक्त Epigenetic ग्लोबिन कमी
स्वाइन पूरे रक्त में व्यक्त कोडिंग और गैर कोडिंग आरएनए कक्षाओं की पहचान
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Fleming, D. S., Anderson, S. J., Miller, L. C. Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood. J. Vis. Exp. (141), e58689, doi:10.3791/58689 (2018).

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