Summary
ここで、(mRNA) を符号化の処理のために最適化されたプロトコルを提案する、非コーディング (ncRNA) グロビンが単一の全血のサンプルから RNA シーケンス ライブラリを削減します。
Abstract
革新的でますます強力な次世代シーケンシング技術の出現は、興味の生物学的プロセスに関連する根本的な遺伝子発現を調べる能力に新たな道をオープンしました。これらの技術革新だけでなく、遺伝子の効果細胞機能をコードする mRNA シーケンスから式を観察する研究者が、無変換、それでも残っている非コーディングの RNA (ncRNA) 分子が規制機能を持っているも。研究者には、mRNA および ncRNA の表現を観察する能力があるが、どちらか一方に焦点を当てる研究の慣習だった。ただし、研究 mRNA および ncRNA の表現に興味を持っていると、何度も使用別サンプル コーディングまたは非コード Rna ライブラリの準備で差を調べる。これは時間、消耗品、および動物のストレスを高めることができるより多くのサンプルの必要性につながることができます。さらに、研究者は通常、mRNA を調べることができます生物の質問の数を制限する 1 つだけ分析用サンプルを準備することがあります。しかし、ncRNAs はその効果発現調節的役割を持つ複数のクラスに します。NcRNA は伝染の間に基本的な生物学的プロセスおよびこれらのプロセスの障害が重要なので、治療のための魅力的なターゲットを下す可能性があります、したがって。この原稿は、世代のための修正されたプロトコルを示します mRNA と非コード RNA 発現ライブラリー、全血の 1 つのサンプルからウイルスの RNA を含みます。このプロトコルの最適化 RNA の純度を改善、メチル化された Rna の回復のための結紮を増加しより多くの RNA 種の捕獲を許可するように、サイズの選択を省略すると。
Introduction
次世代シーケンシング (NGS) は、生物のゲノムのレベルで発生する変更の調査のための強力なツールとして浮上しています。NGS メソッドのサンプル準備は、生体組織の種類によって様々 なことより重要な質問、研究者に注目しているアドレスです。多くの研究は、健康と病気の個人1,2,3、4などの状態の間の遺伝子発現の差異を検討するための手段として、NGS になっています。すべて一度に特定の遺伝標識のゲノム情報のシーケンスを全ゲノム的に配置し、ほとんどのキャプチャを研究者を許可しない場合。
観察式の最も一般的なマーカーは、メッセンジャー Rna (Mrna) です。RNA シーケンスの準備中のライブラリの最もよく使われるプロシージャは、浄化、断片化、および5,6のシリーズを使用して mRNA 分子の回復に最適です。ただし、プロトコルが実行される方法の決定は、サンプルの種類及び当該サンプルについての質問に大きく依存します。ほとんどの場合では、総 RNA を抽出する;しかし、すべての RNA 分子は、関心のある、mRNA 発現研究などの場合過度に豊富な rna、リボソーム Rna (rRNA) のようなは、Mrna に関連付けられている検出成績の数を増やすために削除する必要があります。豊富な rRNA 分子を除去する最も人気のあると広く使用されている方法は、ポリア枯渇7と呼ばれる polyadenylated RNA 転写産物の減少です。このアプローチは、mRNA のコピーには影響しません、mRNA 発現の解析のためによく動作します。ただし、非コーディングやウイルスの Rna に興味がある学部で polyA 枯渇がまたこれらの分子を削除します。
多くの研究は、(コーディング) いずれかの mRNA の発現を RNA シーケンス ライブラリの準備や小規模または大規模な非コーディングの RNA の特定のクラスに集中する選択します。デュアル試料調製を可能にする我々 のような他の手順8にありますが、多くの研究は利用可能な独立した研究個別のサンプルからライブラリを準備します。我々 のような研究、これは通常時間、消耗品、および動物のストレスを増加して複数の血液サンプルを必要があります。私たちの研究の目標は動物から全血を使用して識別および両方の mRNA の異なるクラスを定量化することができる、および非コーディングの RNA 発現健康と高病原性豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス (PRRSV-HP) の間各豚からのみ 1 つの全血のサンプル (2.5 mL) を持っていることにもかかわらず豚9,10に挑戦。これを行うには、一般的な抽出と mRNA と非コード RNA (ncRNA) 式11 1 つのサンプルからの両方の分析を許可する適切なデータを生成するライブラリ作成プロトコルを最適化する必要があります。
これは mRNA のために主に意図されていた、ポリ A 枯渇ステップ12を使用して、入手可能な標準的なキットと RNA 抽出とライブラリを作成するためのメソッド、mRNA の非コーディングの RNA 解析できるプロトコルの必要性を求めてください。このステップしたらサンプルから非コーディングの RNA やウイルスの成績証明書を回復することは不可能。したがって、最適化されたメソッドが必要だったサンプル polyA 枯渇せず総 RNA の抽出に使用できます。本稿で紹介した方法は、サンプルの種類と全血の使用を可能にし、mRNA の小規模および大規模サイズの ncRNAs シーケンス ライブラリを構築する最適化されています。メソッドは、以降の調査13ウイルス Rna を保持と同様、すべての検出可能な非コード Rna の解析を可能にする最適化されています。すべてでは、私たちの最適化されたライブラリの準備のプロトコルは、単一の全血のサンプルから複数の RNA 分子の調査のためことができます。
このメソッドを使用しての背後にある全体的な目標は、全血のサンプルから非コード RNA と mRNA のコレクションに対して許可プロセスを開発しました。これにより、9つのサンプルから本研究では mRNA、ncRNA とそれぞれの動物のウイルスの RNA があります。これは最終的に、動物の追加費用なしより多くの科学的発見は、それぞれの個々 のサンプルの式のより完全な画像を与えます。記載されているメソッドを使用する両方の比較相関研究の完了を可能にすると同様、遺伝子発現の規制当局の検査のため mRNA および非コーディングの RNA 発現単一の全血サンプルを使用して。我々 の研究は、遺伝子発現の変化を調べるにこのプロトコルを使用し、可能なエピジェネティックな規制当局、9 週間の古い男性商業豚ウィルスに感染します。
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Protocol
動物のプロトコルは、国立動物病センター (米国農務省-アルス-NADC) 動物のケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 豚の血のコレクションをサンプルします。
- RNA の管に血液サンプルを収集します。大きい採血管が使用可能な場合、~2.5 mL 以上を収集します。
2. 豚血の処理をサンプルします。
- 室温 (15-25 ° C) で 10 分間 5,020 x gで血液チューブを遠心します。場合は冷凍処理のサンプルでは、チューブは最小遠心分離前に 2 時間の室温で孵化させなさい。
- 上清を除去し、ペレットに RNase フリー水 8 mL を追加します。閉じると渦が目に見えて解散したときまでのペレット。5,020 x gペレットを回復するために室温で 10 分間のサンプル チューブを遠心します。すべての上澄みを廃棄し、ペレットを維持します。
3. 総 RNA の小さな RNA (miRNA 分離キット) 有機抽出
- 手順 2.2 からペレットにバインディングの換散バッファーの 300 μ L 分注による総 RNA の抽出を開始します。
- 渦と転送の新しい混合物は 1.5 mL 遠心チューブにラベル付けされます。キットからホモジネート添加物の 30 μ L を追加します。渦管と 10 分間氷の上の場所です。
- チューブを削除し、酸フェノールの 300 μ L を追加: クロロホルム試薬キットから。渦管を混在させること。室温で 5 分間 10,000 × gで遠心分離機します。
- 新鮮なチューブに液相 (300-350 μ L) を慎重に取り外します。次のステップのボリュームに注意してください。
4. 総 RNA の隔離プロシージャ
- 水性回復 (300-350 μ L) の量に基づく水相にエタノール 100% (~ 375 μ L) の 1.25 x ボリュームを追加します。ピペットを使用してサンプルをミックスします。
- 各サンプルのフィルター カートリッジを含むセットアップ新しいコレクション チューブ。ピペット ~ 675 μ L フィルター カートリッジにライセート/エタノール混合物の。
注:> 700 μ L フィルター カートリッジを同時に追加しないでください。大量の連続適用します。 - 簡単に遠心分離機 (15 ~ 20 s) 液体のフィルターを通過する 10,000 x gで。これより回転しません。
- 流れを破棄し、必要に応じて、それがすべて適用されるまで残りのライセート/エタノールの混合物を遠心分離を繰り返します。次のステップの同じフィルター カートリッジ、コレクション チューブを保持します。
- フィルター カートリッジにキットから洗浄ソリューション 1 の 700 μ L を追加し、簡単に遠心分離機 (~ 10 s) をフィルターを通りぬけた。流れを破棄し、同じフィルター カートリッジ、コレクション チューブを保持します。
- 500 μ L の洗浄ソリューション 2/3 を追加します。フィルター カートリッジを通って液体を描画する遠心分離します。流れを破棄します。洗浄ステップを繰り返します。
- 同じ管において、スピン フィルター カートリッジ追加 60 s フィルターから任意の残留液体を削除します。新鮮なコレクションの管にフィルター カートリッジを転送します。
- フィルター カートリッジの中心に予熱 (95 ° C) ヌクレアーゼ フリー水の 100 μ L を追加します。卓上型遠心分離機の最大速度で約 20-30 秒のスピン。
注:RNA 溶出液に含まれるとすることができます今さらに処理されたり、以下-20 ° C で保管します。低分子 Rna の濃縮は実行されませんでした。
5. グロビン減少 (ブタの全血サンプル用に最適化プロトコルに基づく)14,15
注: グロビン削減は実行されるので、ライブラリがないと人口過密は、大きい興味14,15の他の遺伝子にマップできる読み取り数を引き下げるグロビン遺伝子へのマッピングを読み取ります。
- グロビン減少 oligos との交配
- 0.2 mL ヌクレアーゼ無料反応の薄肉管に抽出されたサンプルをピペッティングし、2 分の 70 ° C で熱 cycler で置くことによって RNA (最大 7 μ L のボリュームで 6 μ g RNA サンプル) を変化させなさい。最適な RNA の品質のための最初の denature ステップの直後にチューブを氷へキーであります。DNase 処理は必要ありません。
- チューブ クール グロビン還元オリゴ ミックス x 10 の 400 μ L を準備する間: 100 μ それぞれ 2 つのHBA oligos (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3'、5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA - 3 ') 2 つのHBB oligos 30 μ M で (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3' と5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3') 反応あたり 120 μ M で降伏 7.5 μ M HBA oligos と 30 μ M HBB oligos の最終的な集中。10 x oligo 交配バッファーを準備: 100 mM トリス-HCL、pH 7.6;200 mM KCl です。
- 交配の組合せを準備: RNA のサンプル (最大 7 μ L 容積)、グロビン還元オリゴ ミックス (最終濃度 2 X) 10 x oligo 交配バッファーの 1 μ L x 10 の 400 μ L の 2 μ L の 6 μ g (最終濃度 1 x)。10 μ L の最終巻にヌクレアーゼ フリー水を追加します。
- すぐに、4 ° C 5 分クールな 70 ° C でたちを設定し、RNase H 消化に進みます。
- リボヌクレアーゼ H 消化
- 希釈するリボヌクレアーゼ H x 10 (10 U/μ L) x RNase H バッファー 1 で RNase H x 1。
注: 1 x を使用する前に RNase H バッファーの RNase バッファーが 10 倍になるし、1 倍で希釈する必要があります。 - 組み合わせることで RNase H 反応混合物の準備: 2 μ L の RNase バッファー、RNase H x 1 の 2 μ L で RNase 阻害剤の 1 μ L、ヌクレアーゼ フリー水容量 10 μ L の 5 μ L × 10。
- リボヌクレアーゼ H 反作用の組合せの 4 ° C に 10 分クールの 37 ° C でダイジェスト 10 μ L で徹底的にグロビン減少交配サンプルをミックスします。
- 各サンプルに 0.5 M の EDTA の 1.0 μ L 添加による消化を停止し、すぐにクリーンアップの手順に進みます。
- 希釈するリボヌクレアーゼ H x 10 (10 U/μ L) x RNase H バッファー 1 で RNase H x 1。
- RNase H 処理総 RNA のクリーンアップ。
- 浄化 RNase H 処理の製造元の指示に従って石英膜溶出浄化クリーンアップ キットを使用して RNA。バッファーをプレミックス: 軽度洗浄バッファー 100% エタノールの 44 mL を追加。
- 新しいチューブにサンプルを転送しません。RNase フリーの水の 80 μ L と 350 μ L の換散バッファーの追加します。ピペッティングでよく 100% エタノールの 250 μ L を希釈の RNA とミックスに追加します。
注: はない遠心分離機します。5.3.3 をステップに進んでください。 - 今コレクションの 2 mL 管を通して流れを収集するために、溶出フィルター カートリッジ 700 μ L のサンプルを転送します。15 遠心 ≥ 8,000 x gで s。流れを破棄します。
- 溶出フィルター カートリッジを新しい 2 mL のコレクションの管に配置することによって、この手順を繰り返します。フィルター カートリッジと 15 の遠心分離機に穏やかな洗浄液 500 μ L を追加フィルター カートリッジ膜を洗浄するために ≥ 8,000 x gで s。流れを破棄します。5.3.5 の手順でコレクション チューブを再利用します。
- 今同じサンプル チューブを使用してフィルター カートリッジに 80% エタノール 500 μ L 別を追加します。今回は、≥ 8,000 × gで 2 分間チューブを遠心分離機します。次のステップの溶出スピン列を収集し、フロースルーとコレクションの両方のチューブを破棄します。
- 最後のステップから溶出フィルター カートリッジを新しい 2 mL のコレクションの管に置きます。蓋はフィルター カートリッジの開きスピン列膜を乾燥し、エタノールを防ぐため 5 分間全速力で遠心分離機を残すが引き継ぐ。流を通じて、コレクション チューブを破棄します。
注:避けるために損傷角度回転子の反対の方向で指す蓋にします。 - 乾燥フィルター カートリッジを取り出して、新しい 1.5 mL のコレクションの管にします。直接センターに RNase フリー水を追加することを確かめるカートリッジ膜フィルターに RNase フリー水の 14 μ L を追加します。60、遠心分離溶出が RNA にフルスピードで s。
- グロビン減少の RNA のサンプル (ステップ 6) の質を評価します。MRNA サンプル作製 (ステップ 7) と小さな RNA 図書館準備 (手順 8)16,17に進みます。
注: グロビン減少の RNA のサンプルは、長期保存用は-80 ° C で保管して下さいしかし、-20 ° C で保存今できます。
6. RNA の評価
- 分光光度計を用いた RNA 濃度を定量化します。260 と 280 nm の波長の比率を調べます。〜 2 以上の比率は、RNA の純粋と見なされますより低い値を示すいくつかの汚染。楽器では、この比率を使ってとして ng/μ L の RNA 濃度を決定します。
- 1 μ L を用いて RNA の品質を評価する (100 ng) の適切なチップのサンプル。最終製品は、~ 280 ピーク 〜 2 以上のリンをする必要がありますライブラリを読む 1 つの mRNA の nt143 に小さな RNA ライブラリ ピークは、miRNAs に対応します。
7. mRNA と長い ncRNA ライブラリの総 RNA サンプル準備を足止め。16
- 注:部屋の温度に溶出バッファーと rRNA ・除去ビーズをもたらします。事前 (プレートも使用されるかもしれない) 0.2 ml 薄肉 PCR チューブ ラベルを付けます。製造元の手順16に基づくプロトコル手順。
- グロビン減少 RNA の 4 μ L で開始します。ヌクレアーゼ フリー水の 6 μ L、5 μ L rRNA 結合バッファーの rRNA 除去ミックス (1st管) あたりの 5 μ L を追加します。ミックスして再キャップ ピペットします。100 ° C での 68 ° c. の削除で 5 分間加熱蓋付きたちで配置し、室温 60 で残して s。
- 渦によって rRNA 除去ビードを再停止しなさい新しい (2nd) PCR チューブにビーズの 35 μ L を追加し、ピペットの 2nd管内ビーズ 1st管からのサンプル。3 分間室温で 2nd PCR チューブを孵化させなさい。7 分のマグネット スタンドに配置します。
注:最適な rRNA 枯渇のピペッティングによって各サンプルを徹底的にミックスします。スタンドでチューブの向上/低下は、分離プロセスを促進するため役立つことがあります。 - 転送清 2nd PCR チューブから一致する 3rd PCR チューブと磁気に場所に立つ 60 s. 繰り返しの最小新しい PCR チューブに転送ビードがチューブの側面に移動されない場合にのみ。
- 渦によるミックス サンプル精製ビーズ99 μ L を各 3rd PCR チューブに追加します。両側に確実ビーズ移動 5 分マグネット スタンドに 15 分位室温で座ることができます。ピペットで上澄みを廃棄します。
- 3rdチューブ マグネット スタンドにセットをしてください。ビーズを押し合うように気をつけながら、70% エタノール 200 μ L を追加します。少なくとも 30 s やピペットで上澄みを廃棄のため座ることができます。手順を繰り返します。
- マグネット スタンドで 15 分間室温で乾燥するためにサンプルを許可します。5 キット溶出バッファーを遠心分離機 600 x gで s。チューブを削除し、徹底的に混合溶出バッファーの 11 μ L を追加します。ベンチに 2 分後室温でマグネット スタンドに、少なくとも 5 分間インキュベートします。
- 3rdから上澄みの 8.5 μ L を新しい (4th) に転送 PCR チューブ。キットから想定し, 浸出液/プライム/フラグメント高ミックスの 8.5 μ L を追加します。よく混ぜます。キャップと予熱でたち 94 ° C で 8 分の蓋、4 ° C で保持の場所削除し、遠心分離機の簡潔にします。
- 最初繊維の cDNA を合成します。
- 室温に来るし、最初の鎖合成ミックスに逆転写酵素の 5 s. 転送 50 μ L 用 600 × gで遠心分離機にキットから最初の鎖合成ミックスができます。逆転写酵素は、最初繊維の 1:9 の割合で合成に追加できます。
- 結合された逆転写酵素の 8 μ L をピペット/最初繊維の合成 4 サンプル管にミックス。キャップし、100 ° C で設定事前に加熱されたふた付きたちに 5 s. 場所の 600 x gを遠心分離機実行: 4 ° C の 25 ° c、42 ° c、70 ° C で 15 分 15 分 10 分置きます最終巻は ~ 25 μ L/ウェルです。次のステップにすぐに移動します。
- 第 2 繊維の cDNA を合成します。
- 部屋の温度に終わり修理試薬 (ERR) や第 2 鎖ミックス (SSM) を持参し、600 × g で遠心分離機のために 5 s のミックスを誤る再懸濁バッファーと 1:50 で希釈。上限 4回チューブを取り除くし、をそれぞれ 5 μ L の希釈 ERR と SSM の 20 μ L を追加よく混ぜてピペット。最終巻 〜 50 μ L ds cDNA。
- キャップし、たちの 16 ° C で 1 時間インキュベートサイクルが完了したら、キャップをはずし、ベンチの上に室温に来るようにします。
- ds cDNA クリーン アップ ステップ
- 渦による固体可逆的相固定 (スプリング) 常磁性ビーズを混合することによって開始します。4thチューブ (ds cDNA) のサンプルにビーズの 90 μ L を転送し、ミックスします。最終巻は 140 μ。 許可 15 分室温に坐るためチューブ 〜 5 分にマグネット スタンドを孵化させなさい。各ウェルから清 ~ 135 μ L を削除します。5 μ L の各ウェルに残ってください。
- マグネット スタンドにチューブを残すし、80% エタノール 200 μ L を追加することで洗浄します。30 s し削除破棄培養上清中に座ることができます。洗浄ステップを繰り返します。15 分乾燥させてから、マグネット スタンドに管を残します。
- 5 600 x gで再懸濁バッファーを遠心室温に来ることの後の s。スタンドからチューブを取り外します。チューブに再懸濁バッファーの 17.5 μ L を転送し、ミックスします。2 分、5 分のためのマグネット スタンドに移動ベンチ上孵化させない。
- 新しい薄肉セット (5回) の 0.2 mL チューブに ds cDNA サンプルを含む上清の 15 μ L をピペットします。速やかに次のステップに移動やシールは-25 ° c-15 ° C 以上 7 日間の保存します。
- アデニル酸 3' 端。
- サンプル チューブに室温再懸濁バッファーの 2.5 μ L をピペット、解凍、テーリング ミックスの 12.5 μ L を追加します。ピペッティングで完全に混ぜます。
注: A テーリング コントロールを使用します。 - キャップし、100 ° C 予熱ふた付きたちで孵化させなさい。70 ° C の温水ふた付き 5 分で 30 分の 37 ° C で実行します。4 ° C で残りの部分にたちを許可します。
- サンプル チューブに室温再懸濁バッファーの 2.5 μ L をピペット、解凍、テーリング ミックスの 12.5 μ L を追加します。ピペッティングで完全に混ぜます。
- インデックス アダプターを縛る
- 部屋の温度に RNA アダプター チューブと結紮バッファーの停止のミックスをもたらします。ごとに、使用の準備が整うまで冷凍庫で 5 s. のまま結紮ミックス 600 × gで遠心分離機します。インデックス作成のための整理をプーリング サンプルは知られている必要があります。
- 各サンプル管に再懸濁バッファーの 2.5 μ L と結紮ミックスの 2.5 μ L を追加します。今の各サンプル チューブに適切な RNA アダプターの 2.5 μ L のピペットします。アダプターの選択は、選ばれたキットの製造元の指示により行わなければなりません。
- 要約し、ミックス 280 × gで 1 分間遠心します。30 ° c. で 10 分のサーマルサイクラーでインキュベートします。結紮バッファーの停止の 5 μ L を反応を停止し、ミックスもサンプルに追加します。
- 開始クリーン アップ各管にビーズの 60 s. 転送 42 μ L の渦による SPRI 磁性ビーズを混合することによって。ミックス thoroughlythen ベンチ上に 15 分間インキュベートします。
- マグネット スタンドにチューブを移動し、液体になりますクリア (~ 5 分) までのまま。一度クリアを削除し、上清の 79.5 μ L を破棄します。マグネット スタンドにチューブを残すし、80% エタノール 200 μ L を追加することで洗浄します。少なくとも 30 s し削除破棄培養上清中に座ることができます。洗浄ステップを繰り返します。乾燥を許可する追加の ~ 15 分にマグネット スタンドを残します。洗浄手順の中にビーズを中断しません。
- サンプル チューブに再懸濁バッファーの 52.5 μ l 添加しミックスまでビーズが完全に再懸濁。卓上型 2 分間インキュベートします。液体になるまでマグネット スタンドに戻って移動のサンプル チューブが明確な (~ 5 分)。
- スタンドに残すし、優しく新しい (6th) に清の 50 μ L をピペット管。Vortexed SPRI ビーズの 50 μ L を追加します。ベンチ上 15 分間インキュベートすることができます。
- マグネット スタンドに移動し、プレートが液体になりますクリア (~ 5 分) までください。各チューブに 5 μ L を残して破棄 95年 μ L の上澄み。
- マグネット スタンドにチューブを残すし、80% エタノール 200 μ L を追加することで洗浄します。30 のために管を許可する s を削除し、上清を捨てます。洗浄を繰り返します。15 分にマグネット スタンドを乾燥させない。
- 22.5 μ L 再懸濁バッファーを追加し、ミックス ビーズが中断されるまで。ベンチを 2 分間インキュベートし、明確な液体のターンまでマグネット スタンド (~ 5 分) に移動します。新しい PCR チューブ (7th) にサンプルの 20 μ L をピペットします。
- 必要なキットのコンポーネントを室温に戻します。サンプル キットから 5 μ L の PCR プライマー ミックスと PCR マスター ミックスの 25 μ に転送 (7回PCR チューブ) インデックスのサンプルを含みます。サンプルとキャップのチューブをミックスします。
- 事前に加熱されたふた付きサーマルサイクラーにチューブを配置します。プログラムを実行: 98 ° C、30 s、15 サイクル 98 ° C の 10 s、60 ° C、30 s、72 ° C、30 s、4 ° C で 5 分保持のための 72 ° C
- 結合するチューブのサンプルやピペットを十分に混合 SPRI ビーズの 50 μ L を追加することによってサンプルをクリーンアップします。ベンチ上 15 分間インキュベートする反応を許可します。
- マグネット スタンドにチューブを移動し、液体になりますクリア (~ 5 分) までを孵化させなさい。各チューブに 5 μ L を残して破棄 95年 μ L の上澄み。
- マグネット スタンドにチューブを残すし、80% エタノール 200 μ L を追加することで洗浄します。少なくとも 30 s とし、削除および破棄上清に座ることができます。このステップを繰り返します。15 分乾燥させてからマグネット スタンドを残します。
- 再懸濁バッファーの 32.5 μ L の追加し、ミックスまでビーズが完全に再懸濁。ベンチを 2 分間インキュベートし、明確な液体のターンまでマグネット スタンド (~ 5 分) に移動します。新しい PCR チューブに各管からのサンプルの 30 μ L をピペットします。
- 6.1 と 6.2 適切なチップを搭載した手順を繰り返すことによって DNA 量と質を評価します。プール (手順 9) に進みます。
8. 小さな RNA 図書館準備、sncRNAs。17
注: プロトコル手順を製造元の手順17に基づきます。
- ~ 220 と小さな RNA 図書館準備を開始 ng - ~1.1 μ g/μ L の RNA のグロビン減少サンプル (4 μ L)。
- アダプター結紮
- アダプター、ヌクレアーゼ フリー水 2 μ L、4 μ L の RNA サンプルのグロビン減少の徹底的に 1 μ L を混合することによって 3' アダプターを縛る。70 ° C の 2 分間インキュベートし、すぐに氷の上。
- 結紮バッファー x 2 の 10 μ L を追加して 18 h の 16 ° C の孵化結紮酵素ミックスの 3 μ L ミックスします。
注: piwi Rna などのメチル化 RNA 種に興味を持って研究には、16 ° C の低温で 18 時間増加サンプル インキュベーション時間の使用をお勧めします。長い培養時間は 3' アダプター結紮フェーズ中に結紮術の効率の変更のためのクラスことができます。 - 余分な 3' アダプター アダプター ダイマー形成を防ぐために結紮混合物には、ヌクレアーゼ フリー水の 4.5 μ L の逆のトランスクリプションのプライマーの 1 μ L を追加します。
- 4 ° C で押し 75 ° C、25 ° C で 15 分間、37 ° C で 15 分で 5 分間プログラム予熱した熱 cycler でインキュベート
- 希釈 5'-アダプターの 2 分の 70 ° C でサーマルサイクラーにサンプルあたり 1 μ L を変化させなさい、すぐに氷の上を置きます。
- 変性 5'-アダプターの 1 μ L、10 x 5' 結紮バッファーの 1 μ L および 5' 結紮酵素の 2.5 μ L を追加します。ミックスし、25 ° C 1 時間孵化させなさい。
- cDNA 合成と増幅
- RNA の 5 '・ 3' アダプター結紮、最初繊維のバッファーの 8 μ L、RNase 阻害剤の 1 μ L、逆転写酵素の 1 μ L の 30 μ L 分注で徹底的にミックスします。60 分進む PCR 増幅にすぐに 50 ° C で混合物を孵化させなさいまたは熱 15 分 70 ° C で反応を不活性化し、-20 ° C で保存
- PCR 増幅 40 μ L、2.5 μ L の RNA PCR プライマー PCR マスター ミックスの 50 μ L を追加 2.5 μ L のサンプルでは、指定された RNA PCR プライマー インデックスを追加することによって逆転写酵素反応のヌクレアーゼ フリー水を 100 μ L の総ボリューム ピペッティングで混ぜます。サーマルサイクラー次サイクリング条件で PCR を実行: 初期変性 94 ° c 30 s;11 サイクル 94 ° C の 15 秒、30 秒と 15 の 70 ° C で拡張子 62 ° C で熱処理 s;5 分; 70 ° C で最終的な拡張が続くサンプルは、cycler の 4 ° C で開催できます。
- 注: インデックスのサンプル プールの目的が追加されます。
- サンプルのクリーンアップ
- DNA クリーンアップ キットから追加結合バッファーの 500 μ L (5 M 区塩酸 30% イソプロパノール) スピン列膜への効率的なバインディングを有効にする PCR 増幅されたサンプルを 100 μ l 添加します。
注: 結合バッファー pH 指示薬が含まれていることを確認がある場合の混合物の色は黄色です。 - サンプルと 2 mL のコレクション チューブ、卓上遠心分離機で 17,900 x gで 30-60 秒のスピンの内部フィルター カートリッジに結合バッファーのピペット 600 μ L 混合物。流れを破棄します。
- 卓上遠心分離機で 17,900 x gで 30-60 秒の回転し、流れを破棄して 0.75 mL のキット付属の洗浄バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 7.5、80% エタノール) と同じコレクションの管にフィルター カートリッジを洗う-を介して。追加 60 乾燥フィルター カートリッジをスピン s。
- きれいな 1.5 mL 採取管にフィルター カートリッジを配置します。追加 30 μ L の溶出バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.5) の 60 のために立つ列 s、および 60 のため、スピン卓上遠心分離機で 17,900 x gで s。
- DNA クリーンアップ キットから追加結合バッファーの 500 μ L (5 M 区塩酸 30% イソプロパノール) スピン列膜への効率的なバインディングを有効にする PCR 増幅されたサンプルを 100 μ l 添加します。
- 適切な DNA チップと 6.1 と 6.2 の手順を繰り返すことによってサンプルの質を評価します。(手順 9) をプールに移動します。
9. サンプル順序のためのプーリング
- プール バーコードと QC'ed サンプルをセットアップし、mRNA や ncRNA のいずれかのサンプルを含む新しいチューブ (または 96 ウェル PCR プレート) のラベルです。製造元の指示16,17あたり 10 nm にある各バーコードのライブラリの 13 μ L を対応する管 (または新しいプレートの井戸) に転送します。シーケンスのためのプールされたサンプルを提出、サンプルが同一のチップ上で実行する場合と同様の読み取りの長さを選択する必要があります。
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Representative Results
我々 の研究の代表的なサンプルは、グロビンとリボ枯渇全血サンプルです。プロトコルの代表的な結果は、7 (図 1、) と 260/280 nm 濃度比 2 (図 1b と 1 c) 以上で上記 RNA 整合性数 (鈴) とグロビン劣化ライブラリのサンプルで構成されています。分光光度計を使用して各ライブラリの最終的な集中を提供するサンプル結果の検証を行ったし、りん数 (mRNA または ncRNA) 分子が捕獲されたを示すピークのグラフと一緒にチップを使った電気泳動に基づくプールおよびシーケンスの前にライブラリのサンプル サイズを挿入します。現在の研究の焦点は、mRNA と小さな ncRNAs のみに置かれました。代表の結果は、mRNA ライブラリ ~ 280 一塩ピーク bp (図 1d)。結果 100 〜 400 からピークの範囲から成っている小さい ncRNAs 代表 143 〜 と 〜 153 bp でピークを持つ (図 1e)、bp はそれぞれ Mirna と piRNAs に対応します。サンプル結果 〜 6.3 (最適) (最適) 上記 9.2 鈴数字図書館で本の最適化手法が起因しました。これはグロビン枯渇メソッドを使用し、鈴番号または 6 近くを達成できた他の研究と比較して改善することが分かった。結果はまた 1 つの単一の血液サンプルから mRNA と ncRNA (図 1 d ・ 1 e)、代表ピークの RNA 分子のキャプチャを達成するために可能な限りがあることを示したチップを使った電気泳動および両方の小規模および大規模なカバー サンプル挿入サイズ非コーディングの RNA 分子。これらの結果は最適な鈴スコアの代表である、NGS RNA シーケンスのほぼすべてのプラットフォームの準備のライブラリからシーケンスできます品質成績証明書を読み取りことを確認するために必要なサイズを挿入します。
図 1:この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 1b:この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 1 c:この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 1 d:この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 1e: ブタの全血の単一サンプルから mRNA および非コーディングの RNA 発現ライブラリーの代表の結果します。(a) 電気泳動ファイルは実行鈴番号事前グロビン減少と後グロビン減少の概要表現です。代表エレクトロフェロ (b) 事前グロビン削減と単一豚全血サンプルの (c) 後グロビン減少。(d) 代表エレクトロフェロ グロビンとプーリングおよびシーケンスの前に全血のリボ枯渇 mRNA ライブラリのサンプルの。(グロビンの e) 代表エレクトロフェロ枯渇 sncRNA 全血ライブラリ パネル プーリングおよびシーケンスの前に d で紹介同じサンプルのこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
最適化は、プロトコルの最初の重要なステップには、全血のサンプルから品質の読み取りを取得する可能追加グロビン枯渇の手順が含まれています。配列研究に全血を使用しての最大の制限の 1 つは高いグロビン分子にマップし、金利18の他の分子にマップ可能性があります読み取りを減らしたサンプルの読み取り数です。したがって、我々 のサンプルのタイプのプロトコルの最適化で最高の可能な mRNA および非コーディングの RNA シーケンスをキャプチャできるようにグロビン枯渇ステップを組み込む必要があります。すべてのサンプルは、グロビン グロビン成績チェら、2014年14からの手順に基づいて豚特定ヘモグロビン A と B (HBA と HBB) オリゴヌクレオチドを使用しての高レベルのアカウントに枯渇だった。もう一つの重要なステップだった能力内で実験的関心の polyadenylated 非コーディングとウイルス RNA の分子を同時に維持しながら、サンプルから不要な RNA の分子を削除するための許可リボ枯渇抽出キットの使用シーケンス19の私たちのライブラリ。さらに、小さな RNA の濃縮とサイズ選択のステップを削除することによってコーディング (mRNA) と非コーディング (小さくて長い) RNA のライブラリを作成するための単一のサンプルで動作することができました。これにより、プーリングのための RNA の因数を最大化してシーケンス処理を可能にするのに十分なボリュームを送信我々 を保証することができました。製造元のプロトコルのすべての最適化は、mRNA と下流のライブラリを作成するための非コード RNA 回復を高めるため行われました。我々 はまたメチル化 Rna のライゲーション効率を高めるため製造業者の指示に従って PCR 培養する余分な時間を追加することによって下流解析の小さな非コーディングの RNA 部分の非コード RNA ライブラリの準備、最適化、piwi Rna を回復する可能性です。
最適化されたプロトコルの制限は、1 つのサンプルから複数の解析に最適なことができます特異性の欠如に根ざしています。濃縮、非コーディングの RNA ライブラリの準備のサイズ選択の部分を外して、新しい小さな RNA 検出20小さく、長い非コード RNA の分子の取得に対してバランスを制限しています。したがって、最適化されたプロトコル非コード式の型の良い概要を説明、クラスの具体的な情報を得るためにマップの分析の段階で余分な処理が必要ですが、非コーディングの RNA 発現のサイズでキャプチャ、サンプルです。メソッドに別の制限は、全体的なリン数値を下げるグロビンの枯渇手順定款によるものです。我々 の経験が RNA 整合性の削減の大きさを理解するグロビン枯渇の前後に最初は、凛番号を調べるとトラブルシューティングを行うことができました。我々 は 1 〜 2 滴を発生可能性がありますを示す結果が得られたこのポイント。このドロップを考慮してさらに推奨される 10 μ g ではなくサンプルの 6 μ g にグロビン枯渇プロトコルを最適化しました。これは、私たち鈴数字を向上させるだけでなく、サンプルを節約を助けた。また、我々 はまた薄肉マイクロ アンペア反応管を使用し、最初変化のステップの直後にチューブをアイスします。これは速い反応を抑制することができました、サンプルを枯渇、グロビンの改善の鈴数字を可能にします。
本研究で使用される変更されたプロトコルには、mRNA または非コーディングの RNA のみが別々 に研究が他の研究で使用される基本ライブラリの準備方法と比べていくつかの利点があります。我々 のサンプルのタイプとして全血の効率的な使用できる最適化のため変更。サンプル タイプとして全血血液の白血球の部分よりも収集と処理のため以下の手順を持っているので、これは今後の研究に有利です。また、全血はまた全身性反応を調べる研究者を許可する追加の利点があります、繰り返し動物から収集することができます。ただし、集められた血の量は年齢と問題の有機体のサイズに依存しているという点で、全血サンプルを使用する注意点があります。血液の量は少なく RNA の収量の低下につながる、全血の少なくとも 2.5 mL からデュアル ライブラリの作成は、しかし方法はここで紹介します。これは効果的に伝統的なライブラリ作製法より多くの情報を収集するために私たちをことができます私たち mRNA と非コード式の両方を調査し、時間で個々 のスナップショットの両方に関連付ける 1 つのサンプルを使用するため許可されて。また、リボ枯渇を行いしました使い果たし、配列読み取り、mRNA を研究、伝統的なライブラリ作成中に失われることが非コードやウイルスの成績を維持しながら成績を減らすことが可能。この方法で私たちの最適化されたプロトコルは 1 つのサンプルから得られる情報量をトリプルします。多くの RNA 種情報の取得を容易にするメソッドに加えた他の重要な変更があった: RNA 純度収量; 改善の反応をすぐに停止する PCR プレートの種類を変更します。メチル化 Rna; の復興を結紮しやすく長くたちインキュベーション・長さに関係なく識別できるようにすべての検出可能な ncRNAs のために、ゲルのサイズ選択を採用していません。下流解析のためこれは長さ 18nt 200nt 間の複数の非コード Rna のキャプチャできました。
この最適化の手法を採用し、当社グループ全血トランスクリプトーム解析に適用することができますし、mRNA および単一のサンプルからの非コーディングの RNA のプロトコルを転送することができた。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
商号またはこの資料の商用製品の言及は固有の情報を提供する目的は、勧告または米国農務省によって承認とは限りません。米国農務省は、機会均等のプロバイダーと雇用者です。
Acknowledgments
この作品は主に支えられ、米国農務省 NIFA アフリカ 2013年-67015-21236 によって、一部は米国農務省 NIFA アフリカ 2015年 67015 23216 によって。本研究は、農業研究サービス研究参加プログラム、米国エネルギー省 (間の省庁間協定により科学と教育 (ORISE) のオークリッジ国立研究所によって管理に任命によって部分で支えられましたDOE)、米国農務省。ORISE は、オーク リッジ関連大学によってない DOE の契約の下で管理されます。デ-AC05-06OR2310。
HP PRRSV 感染クローン、動物実験では、関与と彼女の助けのための博士スーザン Brockmeier と原稿の準備でセクレタリーのスー オーレンドルフ博士ケイ Faaberg に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase - free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase - free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
References
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