Summary
여기, 우리가 코딩 (mRNA)의 처리를 위해 최적화 된 프로토콜을 제시 하 고 비 코딩 (ncRNA) globin 단일 전체 혈액 샘플에서 RNA-seq 라이브러리를 감소.
Abstract
점점 더 강력 하 고 혁신적인 다음 세대 시퀀싱 기술의 출현 관심의 생물학 프로세스에 관련 된 기본 유전자 발현 검사 하는 기능으로 새로운 길을 열었습니다. 이러한 혁신 뿐만 아니라 그 효과 세포 기능, 유전자에 대 한 코드는 mRNA 시퀀스에서 관찰 하는 연구원을 허용 하지만 또한 비 코딩 RNA (ncRNA) 분자 번역, 하지만 여전히 남아 있는 규정 하는 기능. 연구자는 mRNA와 ncRNA 식 관찰 하는 능력, 그것은 하나 또는 다른에 집중 하는 연구에 대 한 관습 되었습니다. 그러나, 연구는 mRNA와 ncRNA 식으로 관심이 있다, 여러 번 사용 별도 샘플 검사 코딩 또는 비 코딩 RNAs 라이브러리 준비에 차이 때문에. 이 시간, 소모품 및 동물 스트레스를 증가 시킬 수 있는 더 많은 샘플에 대 한 필요 발생할 수 있습니다. 또한, 그것은 하나의 분석, 일반적으로 mRNA, 조사 될 수 있는 생물 학적 질문의 수를 제한에 대 한 샘플을 준비 하기로 하는 연구자를 발생할 수 있습니다. 그러나, ncRNAs 효과 mRNA 식 규제 역할을 가진 여러 클래스를 스팬. 중요 하기 때문에 ncRNA 기본적인 생물 학적 프로세스와 이러한 프로세스에서의 장애를 감염 하는 동안, 그들은 따라서, 치료제에 대 한 매력적인 목표를 만들 수 있습니다. 이 원고는 세대에 대 한 수정된 프로토콜을 보여줍니다 mRNA 및 비 코딩 RNA 식 라이브러리, 전 혈의 단일 샘플에서 바이러스 성 RNA를 포함 하 여. 이 프로토콜의 최적화 RNA의 순도 향상, 갠 RNAs의 복구용 결 찰을 증가 하 고 더 많은 RNA의 캡처 수 있도록 크기 선택, 생략.
Introduction
다음 차세대 시퀀싱 (NGS) 생물학 유 기체의 게놈 수준에서 발생 하는 변경의 수사를 위한 강력한 도구로 떠오르고 있다. NGS 메서드에 대 한 샘플 준비 유기 체, 조직 유형에 따라 변화 될 수 있습니다 그리고 더 중요 한 것은 질문 연구원은 촉각을 곤두세우고 있다 주소. 많은 연구 결과 건강 하 고 아픈 개인1,2,,34같은 국가 사이 유전자 발현의 차이 공부 하는 수단으로 NGS를 아닙니다. 시퀀싱 걸릴 전체 게놈으로 놓고, 대부분 캡처 연구원 수 없다면, 한 번에 특정 유전자 표식에 대 한 게놈 정보의 포인트.
관찰 하는 식의 가장 일반적인 표시는 메신저 RNAs (mRNAs). RNA-seq에 대 한 준비 라이브러리에 대 한 가장 많이 사용 된 절차 purifications, fragmentations, 및 ligations5,6의 시리즈를 통해 mRNA 분자의 복구를 위해 최적화 되어 있다. 그러나, 수행 하는 프로토콜은 어떻게에 결정 샘플 유형과 말했다 샘플에 대해 제기 되는 질문에 무 겁 게 의존 합니다. 대부분의 경우에서 총 RNA 추출; 그러나, 관심의 모든 RNA 분자는 고 mRNA 식 연구 같은 경우에 리보솜 RNAs (rRNA) 같은 지나치게 풍부한 RNA 종 감지 성적표는 mRNAs와 관련 된의 수를 늘리기 위해 제거 될 필요가 있다. 풍부한 rRNA 분자를 제거 하기 위한 가장 대중적이 고 널리 사용 방법은 polyadenylated RNA 사본 polyA 고갈7로의 감소 이다. 이 접근은 mRNA 발현의 분석으로 mRNA 사본에는 영향을 주지 않습니다. 그러나, 비 코딩 또는 바이러스 성 RNAs에 관심이 있는 연구에 polyA 고갈이이 분자도 제거 합니다.
많은 연구는 RNA 순서 라이브러리 준비 검사 (코딩) mRNA 식 이거나 또는 작은 또는 큰 비 코딩 RNA의 특정 클래스에 초점을 선택 합니다. 듀얼 샘플 준비에 대 한 허용 하는 우리 같은 다른 절차8 있지만, 많은 연구 가능한 경우 별도 연구에 대 한 별도 샘플에서 라이브러리를 준비 합니다. 우리 같은 연구에 대 한이 일반적으로 여러 개의 혈액 샘플, 소모품, 시간과 동물 스트레스 증가 요구할 것입니다. 우리의 연구의 목표를 사용 하 여 전체 혈액 동물에서 식별 하 고 두 mRNA의 다른 클래스를 계량 수 되었고 건강 하 고 높은 병원 성 돼지 재생산과 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV HP) 사이 비 코딩 RNA 표현 도 불구 하 고만 하나의 전체 혈액 샘플 (2.5 mL) 각 돼지에서 돼지9,10 도전. 이 위해서 우리 일반적인 추출 및 mRNA 및 비 코딩 RNA (ncRNA) 식11 단일 샘플에서의 분석에 대 한 있도록 적절 한 데이터를 생성 하기 위해 라이브러리 생성 프로토콜을 최적화 하기 위해 필요 합니다.
이 때문에 RNA 추출 및 라이브러리 생성을 위한 방법과 사용할 수 있는 표준 키트 mRNA를 위해 주로 예정 되었다 폴 리 A 고갈 단계12를 사용 하 여 mRNA 및 비 코딩 RNA 분석에 대 한 허용 하는 프로토콜에 대 한 필요 라는 메시지가 나타납니다. 이 단계 만들었을 것입니다 그것은 비 코딩 RNA 바이러스 증명서 샘플에서 복구 불가능. 따라서, 최적화 방법 필요 했다 샘플 polyA 고갈 없이 총 RNA 추출에 대 한 허용. 이 원고에 표시 메서드에 mRNA를 소형 및 대형 크기의 ncRNAs 시퀀싱 라이브러리를 빌드를 샘플 형식으로 전체 혈액의 사용 하 고 최적화 되었습니다. 메서드는 모든 감지 비 코딩 RNAs의 분석에 대 한 허용 하 고 이후 수사13에 대 한 바이러스 성 RNAs를 유지 최적화 되었습니다. 모두 있음, 우리의 최적화 된 라이브러리 준비 프로토콜 단일 전체 혈액 샘플에서 여러 개의 RNA 분자의 조사에 대 한 수 있습니다.
이 메서드를 사용 하 여 뒤에 전반적인 목표는 전체 혈액의 1 개의 샘플에서 비 코딩 RNA와 mRNA의 컬렉션에 대 한 허용 하는 프로세스를 개발 했다. 우리의 연구는 단일 샘플9에서 공급에 mRNA, ncRNA, 및 각 동물에 대 한 바이러스 성 RNA를가지고 수 있습니다. 이, 궁극적으로, 동물 추가 비용 없이 더 많은 과학적 발견에 대 한 허용 하 고 각 개별 샘플의 식의 더 완전 한 그림을 제공 합니다. 설명 된 메서드를 모두 비교 하는 상호 학문의 완료에 대 한 허용 뿐만 아니라 유전자 발현의 레 귤 레이 터의 시험에 대 한 수 있습니다 mRNA 및 비 코딩 RNA 식 단일 전체 혈액 샘플을 사용 하 여. 우리의 연구는 유전자 발현에 변화를 검사 하이 프로토콜을 사용 하 고 가능한 후 레 귤 레이 터는 9 주 된 남성 상업 돼지에 virally 감염 된.
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Protocol
동물 프로토콜 국립 동물 질병 센터 (미국 농 무부-ARS-NADC) 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 돼지 혈액의 수집 샘플링
- RNA 튜브로 혈액 샘플을 수집 합니다. 수집 ~2.5 mL 또는 더 큰 컬렉션 튜브를 사용할 수 있는 경우.
2. 돼지 혈액의 처리 샘플
- 5,020 x g 실 온 (15-25 ° C)에서 10 분 동안에 혈액 튜브 원심 만약 냉동 처리 샘플 튜브는 최소 원심 분리 이전 2 h의에 대 한 실 온에서 품 어.
- 상쾌한을 제거 하 고 펠 릿에 RNase 무료 물 8 mL를 추가 합니다. 닫기 하 고 소용돌이 펠 릿 눈 녹아 때까지. 샘플 튜브는 펠 릿을 복구를 실 온에서 10 분 동안 5,020 x g 에서 원심 모든 상쾌한 무시 하 고 펠 릿을 보존 한다.
3. 유기 추출 총 RNA와 작은 RNA (miRNA 격리 키트)
- 2.2 단계에서 세포 바인딩 버퍼의 pipetting 300 µ L에 의해 펠 릿 총 RNA 추출을 시작 합니다.
- 소용돌이 전송 하는 새로운 혼합 이라는 1.5 mL 원심 분리기 튜브. 키트에서 homogenate 첨가제의 30 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 관과 10 분 동안 얼음에 장소.
- 튜브를 제거 하 고 산 페 놀의 300 µ L를 추가: 클로 프롬 시 약 키트에서. 소용돌이를 섞어 튜브입니다. 실 온에서 5 분 동안 10000 x g 에서 원심.
- 수성 단계 (300-350 µ L) 신선한 튜브를 조심 스럽게 제거. 다음 단계에 대 한 볼륨 note
4. 총 RNA 격리 절차
- 수성 복구 (300-350 µ L)의 금액에 따라 수성 단계로 100% (~ 375 µ L) 에탄올의 1.25 x 볼륨을 추가. 피 펫을 사용 하 여 샘플을 믹스.
- 설정 새로운 컬렉션 튜브 포함 하는 각 샘플에 대 한 필터 카트리지. 피 펫 ~ 675 µ L 필터 카트리지로 lysate/에탄올 혼합물의.
참고: 추가 하지 마십시오 > 700 µ L 필터 카트리지를 한 번에. 더 큰 볼륨에 대 한 연속적으로 적용 됩니다. - 짧게 원심 (~ 15-20 s) 10000 x g 필터를 통해 액체를 통과에서. 이것 보다 더 회전 하지 않습니다.
- 통해 흐름을 무시 하 고 필요한 경우 반복 하 여 나머지 lysate/에탄올 혼합 원심 모두 적용 된. 다음 단계에 대 한 동일한 필터 카트리지 및 컬렉션 튜브를 유지 합니다.
- 필터 카트리지에 키트에서 세척 솔루션 1의 700 µ L을 추가 하 고 간단히 원심 (~ 10 s) 필터를 이겨낼. 통해 흐름을 무시 하 고 동일한 필터 카트리지 및 수집 관을 유지.
- 세척 솔루션 2/3의 500 µ L를 추가 합니다. 필터 카트리지를 통해 액체를 그리는 원심 분리기. 삭제를 통해 흐름. 세척 단계를 반복 합니다.
- 기계가 동일 관, 스핀 필터 카트리지는 추가 60 필터에서 모든 잔여 액체를 제거 하는 s. 신선한 수집 튜브에 필터 카트리지를 전송.
- 필터 카트리지의 센터에 미리가 열된 (95 ° C) nuclease 무료 물 100 µ L를 추가 합니다. 탁상 원심 분리기 최대 속도에서 약 20-30 s에 대 한 스핀.
참고: RNA는 eluate에 포함 하 고 수 지금 될 추가 처리 또는 저장-20 ° C 이하로. 작은 RNAs에 대 한 농축은 수행 되지 않습니다.
5. globin 감소 (돼지 전체 혈액 샘플에 대 한 최적화 된 프로토콜에 따라)14,15
참고: 있도록 라이브러리와 overpopulated 하지는 감소를 수행 하는 Globin globin 유전자, 큰 관심14,15 의 다른 유전자를 매핑하는 데 사용할 수 있는 읽기의 수를 낮은 것에 대 한 매핑을 읽습니다.
- Globin 감소 oligos와 교 잡
- (최대 7 µ L 볼륨에서 6 µ g RNA 샘플) RNA 추출된 샘플 0.2 mL nuclease 무료 반응 얇은 벽 관에 pipetting으로 2 분 동안 70 ° C에서 열 cycler에서 변성. 최적의 RNA 품질에 대 한 첫 번째 denature 단계 직후 튜브 아이스 하 키입니다. DNase 치료 필요 합니다.
- 튜브 멋진 globin 감소 올리고 믹스 x 10의 400 µ L를 준비 하는 동안: 100 µ L 각 두 개의 HBA oligos의 (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3', 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3 ') 30 µ M, 두 HBB oligos에 (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3', 그리고 5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3')에서 반응 당 120 µ M, 7.5 µ M HBA oligos 30 µ M HBB oligos의 최종 농도 저조한. 10 x oligo 교 잡 버퍼 준비: 100 mM Tris HCL, pH 7.6; 200 m m KCl입니다.
- 교 잡 믹스 준비: RNA 샘플 (최대 7 µ L 볼륨), globin 감소 올리고 믹스 (최종 농도 2 배), 1 µ L 10 x oligo 교 잡 버퍼의 x 10의 400 µ L의 2 µ L의 6 µ g (최종 농도 1 x). 10 µ L의 최종 볼륨을 nuclease 무료 물을 추가 합니다.
- 70 ° C 5 분 쿨 즉시 4 ° C에서 thermocycler를 설정 하 고 RNase H 소화를 진행.
- RNase H 소화
- RNase H x 10 희석 (10 U / µ L) 버퍼 RNase H x 1과 RNase H x 1를.
참고: 버퍼 10 x에서 온다 고 1x로 희석 될 필요가 있을 것 이다 RNase RNase H 1 x는 사용 전에 버퍼링 합니다. - RNase H 반응 혼합 결합 하 여 준비: 2 µ L x RNase 버퍼, RNase H x 1의 2 µ L에서 RNase 억제제의 1 µ L nuclease 무료 물 총 볼륨 10 µ L에 5 µ L 10의.
- RNase H 반응 혼합 및 4 ° c 10 분 쿨에 대 한 37 ° C에서 다이제스트 10 µ L Globin 감소 교 잡 샘플 철저 하 게 혼합
- 각 샘플에 0.5 M EDTA의 1.0 µ L의 추가 의해 소화를 중지 하 고 즉시 정리 단계를 수행 하십시오.
- RNase H x 10 희석 (10 U / µ L) 버퍼 RNase H x 1과 RNase H x 1를.
- RNase H 처리 총 RNA 정리입니다.
- 정화 RNase H RNA 제조업체의 지침에 따라 실리 카 멤브레인 기반 차입 정화 청소 키트를 사용 하 여 처리. 버퍼를 공기로: 가벼운 세척 버퍼에 대 한 100% 에탄올의 44 개 mL를 추가.
- 새로운 튜브에 샘플을 전송 하지 않습니다. RNase 무료 물 80 µ L 350 µ L의 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 잘 pipetting으로 희석 RNA를 혼합 100% 에탄올의 250 µ L를 추가 합니다.
참고: 원심 하지 마십시오. 5.3.3 단계로 바로 진행 합니다. - 이제 2 mL 컬렉션 튜브를 통해 흐름을 수집에 배치 하는 차입 필터 카트리지를 700 µ L 샘플을 전송 합니다. 원심 분리기 15 ≥ 8000 x g에서 s. 흐름을 통해 삭제 합니다.
- 새로운 2 mL 컬렉션 튜브로 차입 필터 카트리지를 배치 하 여이 반복 합니다. 필터 카트리지 및 15에 대 한 원심 분리기에 가벼운 세척 버퍼의 500 µ L를 추가 s ≥ 8000 x g 필터 카트리지 막 세척 하기 위하여. 흐름을 통해 삭제 합니다. 5.3.5 단계에서 컬렉션 튜브를 다시 사용 합니다.
- 이제 동일한 샘플 튜브를 사용 하 여 필터 카트리지를 80% 에탄올의 또 다른 500 µ L를 추가 합니다. 이 시간 원심 ≥ 8000 x g2 분에 대 한 관. 다음 단계에 대 한 차입 스핀 열을 수집 하 고 흐름을 통해와 수집 튜브를 삭제.
- 새로운 2 mL 컬렉션 튜브에 마지막 단계에서 차입 필터 카트리지를 넣어. 두고 뚜껑 열고 필터 카트리지에 스핀 열 막 건조 방지 에탄올을 5 분 최고 속도로 원심이 월. 흐름을 통해 및 컬렉션 튜브를 삭제 합니다.
참고: 피하기 위해 손상 각도 터의 반대 방향으로 가리키도록 뚜껑. - 말린된 필터 카트리지를가지고 고 새로운 1.5 mL 수집 관으로 장소. 14 µ L RNase 무료 물 필터 카트리지 막 RNase 무료 물 센터에 직접 추가 추가 합니다. 원심 분리기 60 s elute RNA를 최고 속도로.
- RNA 샘플 globin 감소 (6 단계)의 품질을 평가 합니다. MRNA 샘플 준비 (7 단계)와 작은 RNA 라이브러리 준비 (8 단계)16,17를 진행 합니다.
그러나 참고: Globin 감소 RNA 샘플 지금 저장할 수 있습니다-20 ° C에 저장-80 ° C에서 장기 보존을 위한 것이 좋습니다.
6입니다. RNA의 평가
- RNA 농도 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량. 260과 280 nm의 파장 비율을 확인 합니다. 고 ~ 2 이상 비율 RNA에 대 한 순수한 간주 됩니다 낮은 값을 나타내는 몇 가지 오염. 악기는 ng / µ L로 RNA 농도 결정 하기 위해이 비율을 사용 합니다.
- 1 µ L를 사용 하 여 RNA 품질 평가 (100 ng) 적절 한 칩에 샘플의. 최종 제품 있어야 ~ 2 이상 린 ~ 280에서 피크 단일 mRNA에 대 한 nt 읽기 라이브러리; 143에서 작은 RNA 라이브러리 봉우리 miRNAs에 해당합니다.
7. 좌초 mRNA 및 긴 ncRNA 라이브러리에 대 한 총 RNA 샘플 준비. 16
- 참고: 차입 버퍼와 가져올 rRNA 제거 구슬 실내 온도에. 미리 레이블을 0.2 ml 얇은-벽으로 PCR 튜브 (번호판도 사용할 수 있습니다). 프로토콜 단계 제조 업체의 지침16에 따라.
- Globin 감소 RNA의 4 µ L로 시작 합니다. 6 µ L nuclease 무료 물, rRNA 바인딩 버퍼의 5 µ L 및 튜브 (1st 관) 당 rRNA 제거 믹스의 5 µ L를 추가 합니다. 혼합 하 고 다시 뚜껑 플라스틱. 68 ° C. 제거에 5 분 동안 100 ° C가 열 뚜껑 thermocycler 놓고 60 실 온에 두고 s.
- 의해 소용돌이; rRNA 제거 구슬 resuspend 새로운 2 (nd) PCR 튜브에 구슬의 35 µ L을 추가 하 고 샘플 2nd 튜브에 구슬에 1st 튜브에서 플라스틱. 3 분 동안 실 온에서 2차 PCR 튜브를 품 어. 7 분 마그네틱 스탠드에 놓습니다.
참고: 최적의 rRNA 고갈에 대 한 pipetting으로 각 샘플을 철저 하 게 혼합. 높이 낮추기 튜브 스탠드에서 분리 과정을 신속 하 게 하는 데 도움이 있습니다. - 일치 3rd PCR 튜브 및 자석에 장소는 상쾌한 2nd PCR 튜브에서 전송 서 최소 60 미 반복에 대 한 새로운 PCR 관으로 전송 구슬 튜브 양쪽에 이동 되지 않습니다 경우에.
- 소용돌이;에 의해 혼합 샘플 정화 구슬 각 3rd PCR 튜브를 99 µ L를 추가 합니다. 확인 구슬 이동 면 실 온에 5 분에 대 한 자기 서 15 분 장소에 대 한에 앉아 수 있습니다. 폐기는 상쾌한 피 펫입니다.
- 3rd 튜브를 마그네틱 스탠드에 설정 하십시오. 되 고자 구슬 하지 않도록 주의 하는 동안 70% 에탄올의 200 µ L를 추가 합니다. 적어도 30 s 및 폐기는 상쾌한 피 펫 앉아 허용. 단계를 반복 합니다.
- 마그네틱 스탠드에 15 분 동안 실내 온도에 건조 하는 샘플을 수 있습니다. 5에 대 한 키트 차입 버퍼 원심 600 x g에서 s. 튜브를 제거 하 고 철저 하 게 혼합 하는 차입 버퍼의 11 µ L를 추가 합니다. 벤치에 2 분 후 5 분 이상 실 온에서 마그네틱 스탠드에 품 어.
- 새로운 (4일)에 3rd 에서 상쾌한의 8.5 µ L를 전송 PCR 튜브. 키트에서 Elute/프라임/조각 높은 믹스 8.5 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스. 모자 및 장소에 미리가 열 된 thermocycler 94 ° C에서 8 분 뚜껑, 4 ° c.에서 개최 제거 하 고 짧게 원심.
- 첫번째 물가 cDNA를 합성
- 실내 온도에 서 첫 번째 가닥 합성 혼합으로 역전사의 5 미 전송 50 µ L에 대 한 600 × g 에서 원심을 키트 첫 번째 가닥 합성 혼합을 수 있습니다. 먼저 1: 9의 비율로 종합 물가를 역전사를 추가할 수 있습니다.
- 플라스틱의 결합된 역전사 8 µ L/처음 합성 혼합 샘플 4 관으로 가닥. 뚜껑과 100 ° c.에 설정 미리가 열 뚜껑 thermocycler로 600 x g 5 미 장소에 대 한 원심 실행: 25 ° C, 42 ° C, 70 ° C에서 15 분에서 15 분에서 10 분 후 4 ° c.에 휴식 마지막 볼륨은 잘 당 25 µ L. 즉시 다음 단계로 이동 합니다.
- 두 번째 가닥 cDNA를 합성
- 실내 온도, 고 5 s. 믹스 잘못 물의 resuspension 버퍼 1시 50분에 대 한 600 x g에서 원심 끝 복구 시 약 (ERR)와 두 번째 가닥 믹스 (SSM) 희석. 4번째 튜브를 벗기다; 각 5 µ L 희석된 ERR의 SSM의 20 µ L을 추가 하 고 잘 섞어 피 펫입니다. 마지막 볼륨 ~ 50 µ L ds cDNA
- 모자와 16 ° c.에 1 시간 동안 thermocycler에서 품 어 주기가 완료 되 면 모자를 제거 하 고 벤치 위에 실내 온도에 올 수 있게.
- ds cDNA 정리 단계
- 소용돌이 의해 단단한 단계 가역 동원 정지 (SPRI) 상자성 구슬 혼합 하 여 시작 합니다. 4번째튜브 (ds cDNA)에 샘플을 구슬의 90 µ L를 전송 하 고 섞으십시오. 마지막 볼륨은 140 µ L. 허용 관을 실 온에서 15 분 동안 앉아 ~ 5 분 마그네틱 스탠드에 품 어. 각 우물에서의 상쾌한 ~ 135 µ L을 제거 합니다. 5 µ L 각 우물에 남아 해야 합니다.
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 두고 80% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 여 세척. 30 s 다음 제거 하 고 표면에 뜨는 폐기 앉아 허용. 세척 단계를 반복 합니다. 15 분 건조 있도록 마그네틱 스탠드에 튜브를 남겨 주세요.
- 600 x g 5에서 물의 resuspension 버퍼 원심 후 실내 온도에 오는 s. 스탠드에서 튜브를 제거 합니다. 튜브를 물의 resuspension 버퍼의 17.5 µ L를 전송 하 고 섞으십시오. 튜브 2 분 후 5 분 동안 마그네틱 스탠드 이동 벤치 위에 품 어 보자.
- 15 µ L의 상쾌한 새로운 얇은 벽 (5회) 세트 0.2 mL 튜브에 ds cDNA 샘플 포함 된 플라스틱 다음 단계로 신속 하 게 또는 인감 이동한-25 ° c-15 ° C에서 7 일 동안 저장 합니다.
- Adenylate 3' 끝입니다.
- 샘플 튜브에 실내 온도 물의 resuspension 버퍼의 2.5 µ L 플라스틱 다음 해 동된 A-미행 믹스의 12.5 µ L를 추가 합니다. 완전히 pipetting으로 혼합.
참고: 없음 A-미행 제어 사용입니다. - 모자 하 고 100 ° C 미리가 열 뚜껑 thermocycler에서 품 어. 다음 온수 뚜껑을 5 분 동안 70 ° C에서 30 분 동안 37 ° C에서 실행 합니다. 4 ° c.에 휴식 thermocycler 허용
- 샘플 튜브에 실내 온도 물의 resuspension 버퍼의 2.5 µ L 플라스틱 다음 해 동된 A-미행 믹스의 12.5 µ L를 추가 합니다. 완전히 pipetting으로 혼합.
- 인덱스 어댑터 선
- 실내 온도에 RNA 어댑터 튜브와 결 찰 버퍼 중지 믹스를 가져와. 각각에 대 한 사용을 위해 준비 될 때까지 냉동 실에 5 미 휴가 내 고 믹스에 대 한 600 x g 에서 원심. 샘플 배열 인덱싱 풀링 알려져야 한다.
- 각 샘플 튜브를 물의 resuspension 버퍼의 2.5 µ L 및 2.5 µ L의 결 찰 믹스를 추가 합니다. 이제 각 샘플 튜브에 적절 한 RNA 어댑터의 2.5 µ L에 플라스틱. 어댑터 선택 선택한 키트에 대 한 제조업체의 지침에 의해 수행 되어야 한다.
- 요점 되풀이 하 고 280 x g에서 1 분 동안 원심 분리에 의해 혼합. 30 ° c.에서 10 분에 대 한 열 cycler에 품 어 반응을 정지 하 여 잘 혼합 샘플에 그만 결 찰 버퍼의 5 µ L를 추가 합니다.
- 시작 정리 SPRI 상자성 구슬 구슬 각 튜브의 60 미 전송 42 µ L에 대 한 소용돌이 의해 혼합 하 여. 혼합 thoroughlythen 벤치 위에 15 분 동안 품 어.
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 이동 하 고 액체 회전 취소 (~ 5 분) 때까지. 분명 한 번 제거 하 고 상쾌한의 79.5 µ L를 삭제. 마그네틱 스탠드에 튜브를 두고 80% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 여 세척. 적어도 30 s 다음 제거 하 고 표면에 뜨는 폐기 앉아 허용. 세척 단계를 반복 합니다. 추가 ~ 15 분 건조 있도록 마그네틱 스탠드에 둡니다. 세척 단계 동안 구슬을 방해 하지 않습니다.
- 샘플 튜브를 물의 resuspension 버퍼의 52.5 µ L을 추가 하 고 구슬 완전히 다시 중단 될 때까지 혼합. 벤치 위에 2 분 동안 품 어. 액체까지 마그네틱 스탠드를 다시 이동 샘플 튜브 분명 하다 (~ 5 분).
- 스탠드에 두고 부드럽게 상쾌한 새로운 (6일)에 50 µ L 플라스틱 튜브. Vortexed SPRI 구슬의 50 µ L를 추가 합니다. 허용 15 분 동안 벤치 위에 품 어.
- 마그네틱 스탠드를 이동 하 고 액체 회전 취소 (~ 5 분) 때까지 접시를 보자. 각 관에서 5 µ L를 떠나 버리기 95 µ L의 상쾌한.
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 두고 80% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 여 세척. 허용 30 앉아 튜브 s 다음 제거 하 고 상쾌한 삭제. 세척을 반복 합니다. 튜브 마그네틱 스탠드 15 분에 건조 하자.
- 물의 resuspension 버퍼의 22.5 µ L에 추가 하 고 구슬 일시 중단 때까지 섞는다. 2 분 동안 벤치에 incubate 다음 마그네틱 스탠드 명확한 액체 회전까지 (~ 5 분)로 이동 합니다. 새로운 PCR 튜브 (7일)으로 20 µ L의 샘플을 플라스틱.
- 실내 온도에 필요한 키트 구성 요소를가지고. 샘플 키트에서 PCR 뇌관 믹스의 5 µ L 및 PCR 마스터 믹스의 25 µ L를 전송 (7번째 PCR 튜브) 포함 하는 인덱싱된 샘플. 샘플 및 캡 튜브를 혼합.
- 미리가 열 뚜껑 열 cycler에 튜브를 놓습니다. 프로그램 실행: 98 ° C 30에 대 한 s, 다음 10 98 ° C의 15 주기 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C에 4 ° c.에서 5 분 대기에 대 한
- 결합 하 여 충분히 혼합된 SPRI 구슬 튜브 샘플 및 플라스틱의 50 µ L을 추가 하 여 샘플을 정리 합니다. 15 분 동안 벤치 위에 품 어에 반응을 수 있습니다.
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 이동 하 고 액체 회전 취소 (~ 5 분) 때까지 품 어. 각 관에서 5 µ L를 떠나 버리기 95 µ L의 상쾌한.
- 마그네틱 스탠드에 관을 두고 80% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 여 세척. 적어도 30 s 다음 제거와 삭제는 상쾌한 앉아 허용. 이 세 단계를 반복 합니다. 15 분 건조 있도록 마그네틱 스탠드에 둡니다.
- 물의 resuspension 버퍼의 32.5 µ L에 추가 하 고 구슬 완전히 다시 중단 될 때까지 혼합. 2 분 동안 벤치에 incubate 다음 마그네틱 스탠드 명확한 액체 회전까지 (~ 5 분)로 이동 합니다. 새로운 PCR 튜브에 각 관에서 샘플의 30 µ L 플라스틱.
- 6.1 및 6.2 적절 한 칩을 단계를 반복 하 여 DNA 수량 및 품질을 평가 합니다. 풀링을 단계 (9 단계)로 이동.
8. 작은 RNA 라이브러리는 sncRNAs에 대 한 준비. 17
참고: 프로토콜 단계 제조 업체의 지침17에 따라.
- 작은 RNA 라이브러리 준비 시작 ~ 220 ng-~1.1 µ g / µ L globin 감소 RNA의 샘플 (4 µ L).
- 어댑터 결 찰
- 3'-어댑터 어댑터, nuclease 무료 물, 2 µ L 그리고 globin 감소 RNA 샘플의 4 µ L의 철저 하 게 1 µ L를 혼합 하 여 선. 2 분 동안 70 ° C에서 품 어 하 고 즉시 얼음에 놓습니다.
- 결 찰 버퍼, x 2의 10 µ L을 추가 하 고 3 µ L의 결 찰 효소 혼합, 혼합 및 18 h 16 ° C를 품 어.
참고: 16 ° C의 낮은 온도에서 18 시간 증가 샘플 보육 시간 연구 갠 RNA 종, piwi RNAs에에서 관심이 적합 합니다. 장시간 보육 단계 3' 어댑터 결 찰 결 찰 효율성 때문에 수정의 클래스에 대 한 수 있습니다. - 초과 3' 어댑터의 어댑터-이합체 형성을 방지 하기 위해 결 찰 혼합물에 nuclease 무료 물 4.5 µ L에서 반전 녹음 방송 뇌관의 1 µ L를 추가 합니다.
- 75 ° C, 37 ° C, 25 ° C에서 15 분에서 15 분에서 5 분 동안 프로그램 데워 열 cycler에서 incubate 및 4 ° c.에서 개최
- 미리 희석된 5'-어댑터의 2 분 동안 70 ° C에서 열 cycler에서 샘플 당 1 µ L를 변성 하 고 즉시 얼음에 놓습니다.
- 변성된 5'-어댑터의 1 µ L, 10 x 5' 결 찰 버퍼의 1 µ L 5' 결 찰 효소의 2.5 µ L를 추가 합니다. 혼합 하 고 1 시간에 25 ° C를 품 어.
- cDNA 합성 및 증폭
- 5 ' / 3-어댑터-출혈 RNA, 첫 번째 가닥 버퍼의 8 µ L, RNase 억제제의 1 µ L의 역전사의 1 µ L pipetting 30 µ L에 의해 철저 하 게 혼합. 60 분 진행 즉시 PCR 증폭을 위한 50 ° C에 혼합물을 품 어 또는 열 비활성화 15 분 동안 70 ° C에서 반응 하 고-20 ° c.에 저장
- PCR 증폭 PCR 마스터 믹스, RNA PCR 뇌관의 2.5 µ L의 50 µ L 추가 지정 된 RNA PCR 뇌관 인덱스 샘플의 2.5 µ L을 추가 하 여 역전사 반응의 40 µ L과 nuclease 무료 물 100 µ L. 총 볼륨에 pipetting으로 혼합. 다음 자전거 조건을 사용 하 여 열 cycler에서 실행 하는 PCR: 30 94 ° C에서 초기 변성 s; 15 94 ° C의 11 주기 30 s, 및 15에 대 한 70 ° C에서 확장 하는 62 ° C에서 어 닐 링 s s; 70 ° c 5 분;에 대 한 최종 확장명 샘플은 cycler에 4 ° C에서 개최 될 수 있습니다.
- 참고: 인덱스 샘플 풀링의 목적에 대 한 추가 됩니다.
- 샘플 정리
- DNA 정리 키트에서 500 µ L 바인딩 버퍼의 추가 (5 M 구-HCl, 30% 소 프로 파 놀) 스핀-열 막에 효율적인 바인딩 수 있도록 PCR 증폭된 샘플의 100 µ L를.
참고: 바인딩 버퍼 인디케이터가 pH 포함 되어 있는지 확인 하는 경우는 혼합물의 색 노란색 이다. - 샘플 및 필터 카트리지 2 mL 수집 관, 스핀 탁상 원심 분리기에 17,900 x g 에서 30-60 s 안쪽에 바인딩 버퍼의 피 펫 600 µ L 혼합물. 흐름을 통해 삭제 합니다.
- 30-60 s 17,900 x g 탁상 원심 분리기에서 회전 하 고 흐름을 무시 하 여 제공 하는 키트 워시 버퍼 (10 mM Tris HCl pH 7.5, 80% 에탄올)의 0.75 mL와 같은 컬렉션 튜브에 필터 카트리지를 씻어-통해. 회전 필터 카트리지는 추가 60 건조 s.
- 깨끗 한 1.5 mL 컬렉션 튜브에서 필터 카트리지를 놓습니다. 차입 버퍼 (10 mM Tris HCl pH 8.5) 30 µ L 60에 대 한 서 열 게 추가 s, 그리고 60 다음 스핀 17,900 x g 탁상 원심 분리기에서 s.
- DNA 정리 키트에서 500 µ L 바인딩 버퍼의 추가 (5 M 구-HCl, 30% 소 프로 파 놀) 스핀-열 막에 효율적인 바인딩 수 있도록 PCR 증폭된 샘플의 100 µ L를.
- 적절 한 DNA 칩 6.1 및 6.2 단계를 반복 하 여 샘플 품질을 평가 합니다. 풀링을 단계 (9 단계)로 이동 합니다.
9입니다. 샘플 시퀀싱 풀링
- 수영장 barcoded 그리고 QC'ed 샘플을 설정 하 고 레이블 새 튜브 (또는 96 잘 PCR 플레이트) mRNA 또는 ncRNA 샘플을 포함 하 여. 제조 업체의 지침16,17당 해당 튜브 (또는 새로운 플레이트에 웰 스) 각 바코드 10nM 라이브러리의 13 µ L를 전송 합니다. 시퀀싱에 대 한 풀링된 샘플을 제출, 특정 샘플 동일한 칩에서 실행 하는 경우 비슷한 읽기 길이 선택할 수 있습니다.
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Representative Results
우리의 연구에서 대표 샘플 globin ribo 고갈 전체 혈액 샘플은. 7 (그림 1을)와 260/280 nm 농도 비율 2 (그림 1b와 1 c) 이상에 RNA 무결성 번호 (린)와 globin 고갈된 라이브러리 샘플 프로토콜의 대표적인 결과 의하여 이루어져 있다. 유효성 검사 샘플 결과의 각 도서관의 최종 농도 주고 분 광 광도 계를 사용 하 여 수행한 및 칩 기반 그래프 표시 (mRNA 또는 ncRNA)는 분자 캡처된 봉우리의 린 번호를 주고 전기 이동 법에 따라 풀링 및 시퀀싱 전에 라이브러리 샘플 크기를 삽입 합니다. 현재 연구에 대 한 초점 mRNA와 작은 ncRNAs만 배치 했다. MRNA 라이브러리에 대 한 대표적인 결과 ~ 280에서 electropherogram 피크는 bp (그림 1의d). 결과 범위 ~ 100-400에서 봉우리로 이루어져 작은 ncRNAs 대표 bp (그림 1e), 143 ~와 ~ 153 bp에서 봉우리와 해당 miRNAs와 piRNAs, 각각. 우리의 샘플 결과 우리의 최적화 기술 라이브러리 (위 최적의) 9.2 (최적의) 6.3 ranged 린 숫자 결과 보여주었다. 이 개선 globin 고갈 메서드를 사용 하 고 린 숫자에 또는 근처에 6 달성 못했습니다만 다른 연구에 비해 것으로 판명. 칩 기반 전기 결과 또한 보여 주고는 하나의 단일 혈액 샘플에서 mRNA와 ncRNA (그림 1 d와 1e), 대표 하는 봉우리의 RNA 분자 캡처를 얻을 수 및 소형 및 대형 덮여 샘플 삽입 크기 비 코딩 RNA 분자입니다. 이러한 결과 최적의 린 점수를 하 고 삽입 크기 수 품질 대 본 읽고 보장 하기 위해 필요한 거의 모든 NGS RNA-seq 플랫폼 준비 라이브러리에서 시퀀스.
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그림 1 c : 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 1 d : 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 1e : 대표 돼지 전 혈의 단일 샘플에서 mRNA 및 비 코딩 RNA 식 라이브러리에 대 한 결과. (a) 전기 파일 린 숫자 사전 globin 절감 및 사후 globin 감소의 요약 표현을 실행 합니다. 대표 electropherograms (b) 사전 globin 감소 고 단일 돼지 전체 혈액 샘플의 (c) 후 globin 감소. (d) 대표 globin 및 풀링 및 시퀀싱 전에 전체 혈액 ribo 고갈 mRNA 라이브러리 샘플의 electropherograms. (e) 대표 electropherograms globin의 고갈 sncRNA 전체 혈액 라이브러리 패널 풀링 및 시퀀싱 전에 d에 등장 하는 동일한 샘플의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
만든 최적화 된 프로토콜의 첫 번째 중요 한 단계 추가 globin 고갈 단계, 전체 혈액 샘플에서 품질 읽기를 가능 하 게 포함 되어 있습니다. 전 혈을 사용 하 여 시퀀싱 연구에서에 가장 큰 한계 중 하나는 globin 분자에 지도 하 고 관심18의 다른 분자에 매핑할 수 있는 읽기를 줄이기 위해 샘플에서 읽기의 높은 숫자입니다. 따라서, 우리의 샘플 유형에 대 한 프로토콜을 최적화, 우리는 가장 높은 가능한 mRNA 및 비 코딩 RNA 시퀀싱을 통해 캡처 되도록 globin 고갈 단계를 통합 하 필요 합니다. 모든 샘플 globin globin 성적 돼지 특정 헤모글로빈 A와 B (HBA 및 HBB) oligonucleotides 최 외., 201414에서 절차에 따라 사용 하 여 높은 수준에 대 한 계정에 고갈 했다. 또 다른 중요 한 단계는 능력 polyadenylated 비 코딩 및 바이러스 성 RNA 분자 내에서 실험을 동시에 하면서 우리의 샘플에서 원하지 않는 RNA 분자를 제거 하는 동안 허용 되는 ribo-고갈 추출 키트를 사용 하 여 시퀀싱19에 대 한 우리의 라이브러리입니다. 또한, 우리 작은 RNA 농축 및 크기 선택 단계를 제거 하 여 코딩 (mRNA) 및 비 코딩 (작고 긴) RNA 라이브러리를 만들 단일 샘플 작업할 수 있었다. 이렇게 함으로써, 우리는 합동 RNA aliquots를 최대화 하 고 우리 시퀀싱에 대 한 있도록 충분 한 볼륨을 전송 되도록 수 있었다. 모든 제조 업체의 프로토콜 최적화 mRNA 및 비 코딩 RNA 복구 다운스트림 라이브러리 만들기에 대 한 증가를 완료 했다. 우리는 또한 갠 RNAs의 결 찰 효율성을 증가 하는 제조 업체의 지시 당 PCR 인큐베이션을 추가 시간을 추가 하 여 다운스트림 분석의 작은 비 코딩 RNA 부분에 대 한 비 코딩 RNA 라이브러리 준비를 최적화 하 고 piwi RNAs를 복구의 유사도입니다.
최적화 된 프로토콜의 한계 또한 적합 한 샘플에서 여러 분석에 대 한 특이성의 부족에 기인 합니다. 농축 및 비 코딩 RNA 라이브러리 준비의 크기 선택 부분을 제거 하 여 우리 소설 작은 RNA 발견20 작은 고 오래 비 코딩 RNA 분자를 인수 하는 것에 대 한 균형을 제한 하는. 따라서, 최적화 된 프로토콜 비 코딩 식의 종류의 좋은 개요를 제공 하지만, 매핑 클래스에 대 한 보다 구체적인 정보를 얻기 위해의 분석 단계 동안 추가 처리 요구 및 비 코딩 RNA 표현의 크기에서 캡처한는 샘플입니다. 또 다른 한계는 메서드에 globin 고갈 단계를 전체 린 숫자를 낮은 것의 설립 예정 이다. 우리는 첫 번째 검사 린 숫자 RNA 무결성에 있는 감소의 크기 우리 경험을 이해 하는 globin 고갈 전후 하 여이 문제를 해결 수 있었다. 결과 우리 ~ 1-2의 하락을 경험 수를 굴복이 포인트. 이 드롭 다운에 대 한 계정 우리 더 최적화 globin 고갈 프로토콜의 권장된 10 µ g 대신 샘플 6 µ g. 이것은 우리의 린 숫자를 개선 뿐 아니라, 샘플 보존 도움이. 또한, 우리는 또한 얇은 벽 마이크로 암페어 반응 튜브를 사용 하 고 첫 번째 변성 단계 후에 즉시 튜브 아이스. 이 반응 빨리 풀기 위해 우리, 샘플 고갈는 globin에 향상 된 린 숫자를 허용 합니다.
이 연구에서 사용 하는 수정 된 프로토콜 어디 mRNA 또는 비 코딩 RNA만 별도로 공부는 다른 연구에 사용 된 기본 라이브러리를 준비 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 변경 우리는 우리의 샘플 형식으로 전체 혈액의 효율적 사용 최적화에 대 한 만든. 이것은 미래의 연구에 유리 샘플 형식으로 전체 혈액 혈액의 백혈구 부분 보다 수집 및 처리에 대 한 더 적은 단계에 있다. 또한, 전체 혈액 또한 연구 조직의 응답을 검사 하는 허용의 추가 장점 있으며 동물에서 반복적으로 수집 될 수 있습니다. 그러나, 거기입니다 전체 혈액 샘플의 사용에 주의 해야 수집 된 혈액의 양을 연령과 문제의 유기 체의 크기에 따라 달라 집니다. 그러나 메서드를 여기에 제시 된 전체 혈액의 적어도 2.5 mL에서 듀얼 라이브러리 생성 하면, 혈액의 작은 양의 RNA 수익률 낮은 이어질 것입니다. 이를 사용 하 여 하나의 샘플 mRNA 및 비 코딩 식 조사 하 고, 시간에 스냅숏으로에서 개인에 게 모두 상관 우리 효과적으로 전통적인 도서관 준비 방법 보다 더 많은 정보를 수집할 수 있도록 허용. 또한, ribo 소모를 수행 하 여 우리 가능 하 게 그것은 mRNA를 공부 하는 전통적인 도서관 창조 동안 손실 될 수 있다 비 코딩 및 바이러스 성 내용은 유지 하면서 연속 읽기 고갈 수 있는 성적을 줄이기 위해. 이런 방식으로 우리의 최적화 된 프로토콜 단일 샘플에서 얻을 수 있는 정보의 양을 세 배. 다른 중요 한 변경 우리가 방법에 더 많은 RNA 종 정보의 캡처를 촉진 했다: 신속 하 게 개선 RNA 순도 수율; 반응 중지 PCR 접시의 유형 변경 결 찰 갠 RNAs;의 가능한 복구에 대 한 증가를 더 이상 thermocycler 인큐베이션 그리고 길이에 식별 모든 감지 ncRNAs 있도록 젤 크기 선택을 고용 하지. 다운스트림 분석에 대 한이 18nt-200nt 길이 사이 여러 비 코딩 RNAs의 캡처 허용.
이 최적화 된 메서드를 사용 하 여 우리의 그룹 전체 혈액 transcriptomic 분석에 적용 될 수 있으며 mRNA 및 비 코딩 RNA 단일 샘플에서 프로토콜을 앞으로 넣어 수 있었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
상호 또는이 문서에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 미국 농 무부에 의해 승인 또는 추천을 의미 하지는 않습니다. 미국 농 무부는 평등한 기회 제공 및 고용주입니다.
Acknowledgments
이 작품에 의해 주로 지원 되었다에 의해 미국 농 무부 NIFA AFRI 2013-67015-21236, 그리고 일부 USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216 여. 이 연구는 농업 연구 서비스 연구 참여 프로그램은 미국 에너지 부 (사이 부처간 합의 통해 과학 교육 (ORISE)에 대 한 오크 리 지 연구소에 의해 관리 하는 약속에 의해 부분적으로 지원 되었다 미상)와 미국 농 무부. ORISE는 관리 오크 리 지 연관 된 대학에 의해 DOE 계약에서 더. 드-AC05-06OR2310입니다.
우리는 HP PRRSV 전염 성 클론, 박사 수잔 Brockmeier에 대 한 그녀의 동물 실험에 관련 된 도움말 및 비서 지원 원고 준비에 대 한 고소 Ohlendorf 닥터 케이 Faaberg 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase - free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase - free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
References
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