Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identifiering av kodning och icke-kodande RNA klasser uttryckta i svin helblod

Published: November 28, 2018 doi: 10.3791/58689
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Virus and Prion Research Unit, National Animal Disease Center, USDA, Agricultural Research Service, 2ORAU/ORISE

Summary

Här presenterar vi ett protokoll optimerad för bearbetning av kodning (mRNA) och icke-kodande (ncRNA) globinzinkinsulin minskat RNA-seq bibliotek från ett enda hela blodprov.

Abstract

Tillkomsten av innovativ och allt mer kraftfulla nästa generations sekvensering teknik har öppnat nya vägar till möjlighet att undersöka de underliggande genuttryck relaterade till biologiska processer av intresse. Dessa innovationer inte bara tillåter forskare att iaktta uttryck från de mRNA-sekvenser som kodar för gener att effekt cellulär funktion, men också de icke-kodande RNA (ncRNA)-molekyler som förblir oöversatta, men ändå har tillsynsuppgifter. Även om forskare har möjlighet att iaktta både mRNA och ncRNA uttryck, har det varit brukligt för en studie för att fokusera på ena eller andra. Men när studierna är intresserad av både mRNA och ncRNA uttryck, använda många gånger de separata prover för att undersöka antingen kodning eller icke-kodande RNAs på grund av skillnaden i biblioteket preparat. Detta kan leda till behov av fler prover som kan öka tid, förbrukningsvaror och djurens stress. Det kan dessutom orsaka forskare att välja att förbereda prover för endast en analys, vanligtvis mRNA, begränsa antalet biologiska frågor som kan undersökas. Dock ncRNAs spänner över flera klasser med föreskrivande roller att effekt mRNA uttryck. Eftersom ncRNA är viktiga grundläggande biologiska processer och störning i dessa processer i under infektion, kan de alltså göra attraktiva mål för therapeutics. Detta manuskript visar ett modifierat protokoll för generation mRNA och icke-kodande RNA uttryck bibliotek, inklusive viral RNA, från ett enda prov av helblod. Optimering av detta protokoll, förbättrad RNA renhet, ökade ligering för återvinning av metylerade RNAs och utelämnas storlek urval, för att tillåta fångst av fler RNA arter.

Introduction

Nästa generations sekvensering (NGS) har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för undersökningen av de förändringar som sker på genomisk nivå av biologiska organismer. Provberedning för NGS metoder kan varieras beroende på organismen, vävnadstyp, och viktigare frågorna forskarna är angelägen om att adressen. Många studier har vänt sig till NGS som ett sätt att studera skillnader i genuttryck mellan stater som friska och sjuka individer1,2,3,4. Den sekvensering ta plats på basis av hela genomet och tillåter forskare att fånga mest, om inte alla, genomisk information för en viss genetisk markör i taget pekar.

De vanligaste markörerna för uttryck som observerats är de messenger RNA (mRNA). De mest använda förfarandena för prepping bibliotek för RNA-seq är optimerade för återvinning av mRNA-molekyler med hjälp av en serie av reningar, splittringarna och nering5,6. Men är beslutet om hur ett protokoll ska utföras starkt beroende provtypen och frågor som om nämnda exempel. I de flesta fall är total-RNA extraherade; ännu, inte alla RNA-molekyler är av intresse och i sådana fall som mRNA uttryck studier alltför riklig RNA arter, som ribosomalt RNA (rRNA) måste tas bort för att öka antalet detekterbara avskrifter är associerad med mRNA. Den mest populära och mest använda metoden för att ta bort de rikliga rRNA-molekylerna är minskningen av polyadenylated RNA avskrifter som polyA utarmning7. Denna metod fungerar bra för analys av mRNA uttryck eftersom det inte påverkar mRNA avskrifter. Dock i studier som är intresserad av icke-kodande eller viral RNAs, polyA utarmning tar också bort dessa molekyler.

Många studier väljer att fokusera på RNA-sekvens bibliotek beredning att undersöka antingen mRNA uttryck (kodning) eller en särskild klass av små eller stora icke-kodande RNA. Det finns andra förfaranden8 som vår som tillåter dubbla provpreparering, förbereda många studier bibliotek från separata prover för separata studier när det är tillgängligt. För en studie som vår kräver detta normalt flera blodprov öka tid, förbrukningsvaror och djurens stress. Syftet med vår studie var att kunna använda helblod från djur att identifiera och kvantifiera de olika klasserna av både mRNA och icke-kodande RNA uttryckt mellan friska och högpatogen porcin reproduktions- och respiratorisk virus (HP-PRRSV) utmanade svin9,10 trots att endast ett enda helblod prov (2,5 mL) från varje gris. För att göra detta, behövs vi för att optimera de typiska utvinning och bibliotek skapande protokoll att generera korrekt data för analys av både mRNA och icke-kodande RNA (ncRNA) uttryck11 från ett enda prov.

Detta föranledde ett behov av ett protokoll som möjliggjorde mRNA och icke-kodande RNA analys eftersom tillgängliga standard kit och metoder för RNA-extraktion och bibliotek skapande var huvudsakligen avsedda för mRNA och använda en poly-A utarmning steg12. Detta steg skulle ha gjort det omöjligt att återställa icke-kodande RNA eller viral avskrifter från provet. Därför behövdes en optimerad metod som tillåts för total RNA-extraktion utan provet polyA utarmning. Metoden presenteras i detta manuskript har optimerats för användning av helblod som en Provtyp och bygga sekvensering bibliotek för både mRNA och ncRNAs av små och stora storlekar. Metoden har optimerats för att möjliggöra analys av alla detekterbara icke-kodande RNAs samt behålla viral RNAs för senare undersökning13. I alla tillåter vår optimerade bibliotek förberedelse protokoll för utredning av flera RNA-molekyler från ett enda hela blodprov.

Det övergripande målet bakom användningen av denna metod var att utveckla en process som tillåts för insamling av både icke-kodande RNA och mRNA från ett prov av helblod. Detta tillåter oss att ha mRNA, ncRNA och viral RNA för varje djur i vår studie som anskaffas från en enda prov9. Detta, i slutändan, möjliggör mer vetenskapliga upptäckter utan animaliska merkostnader och ger en mer komplett bild av uttrycket av varje enskilt prov. Den beskrivna metoden tillåter för undersökning av regulatorerna av genuttryck samt möjliggör komplettering av korrelat studier jämför både mRNA och icke-kodande RNA uttryck helblod prov. Vår studie använde detta protokoll för att undersöka förändringar i genuttryck och möjliga epigenetiska tillsynsmyndigheter i viralt infekterade 9 - veckor gammal kommersiella galtar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djur protokoll godkändes av National Animal Disease Center (USDA-ARS-NADC) djur vård och användning kommittén.

1. insamling av svin blod prover

  1. Samla in blodprover i RNA-rör. Samla in ~2.5 mL eller mer om större samling rör finns tillgängliga.

2. behandling av svin blod prover

  1. Centrifugera blodet rören vid 5 020 x g under 10 minuter vid rumstemperatur (15-25 ° C). Om bearbetning frysta prover Inkubera röret i rumstemperatur i ett minimum av 2 h före centrifugering.
  2. Ta bort supernatanten och lägga till 8 mL RNase-fritt vatten i pelleten. Stäng och vortex pelleten tills det är synbart upplöst. Centrifugera provrör 5 020 x g under 10 minuter vid rumstemperatur för att återställa pelleten. Ignorera alla supernatanten och bevara pelleten.

3. ekologisk extraktion för Total-RNA och små RNA (miRNA isolering Kit)

  1. Börja totala RNA-extraktion av pipettering 300 μl lyseringsbuffert bindande pelleten från steg 2.2.
  2. Vortex och överföring blandningen till en ny märkta 1,5 mL centrifugrör. Tillsätt 30 µL av Homogenatet additiv från kit. Vortex röret och plats på isen i 10 min.
  3. Ta bort röret och tillsätt 300 µL av den syra-fenol: kloroform reagens från kit. Vortex röret att blanda. Centrifugera 10 000 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
  4. Ta försiktigt bort vattenfasen (300-350 µL) till en ny tub. Notera volymen för nästa steg.

4. total-RNA isolering förfarande

  1. Baserat på mängden aqueous återhämtning (300-350 µL) lägga till 1,25 x volym 100% (~ 375 µL) etanol i vattenfasen. Blanda provet med pipett.
  2. Set-up nya samling rör som innehåller en filterpatron för varje prov. Pipett ~ 675 µL av lysat/etanol blandningen på filterpatronen.
    Obs: Lägg inte till > 700 µL till filterpatronen i taget. För större volymer gäller i följd.
  3. Centrifugera kort (~ 15-20 s) vid 10 000 x g vätska passera filtret. Inte snurra hårdare än detta.
  4. Kassera flödet genom och, om nödvändigt, upprepa centrifugeringen med resterande lysate/etanol blandningen tills den har alla använts. Behålla samma patron och samling filterröret för nästa steg.
  5. Lägg till 700 µL av tvätta lösning 1 från kit till filterpatronen och centrifugera kort (~ 10 s) att dra genom filtret. Kassera flödet genom och behålla samma patron och samling filterröret.
  6. Tillsätt 500 µL tvättlösning 2/3. Centrifugera Rita av vätskan genom filterpatronen. Kassera flödet genom. Upprepa tvättningen.
  7. Inthe samma tub, snurra filterpatronen en ytterligare 60 s för att ta bort eventuella kvarvarande vätskan från filtret. Överföra filterpatronen till en färsk insamling tube.
  8. Tillsätt 100 µL föruppvärmd (95 ° C) nuclease-fritt vatten till mitten av filterpatronen. Snurra för cirka 20-30 s med bordsskiva centrifug max hastighet.
    Obs: RNA kan finns i eluatet och nu ytterligare bearbetas eller lagras vid-20 ° C eller lägre. Berikning för små RNAs utfördes inte.

5. globinzinkinsulin minskning (baserad på ett protokoll som optimerats för svin hela blodprov)14,15

Obs: Globinzinkinsulin minskning utförs så att biblioteken inte är överbefolkat med läser mappning till globin gener, som skulle sänka antalet läsningar tillgängliga att mappa till andra gener av större intresse14,15 .

  1. Hybridisering med globinzinkinsulin minskning oligos
    1. Denature RNA (6 µg RNA prov i maxvolym 7 µL) genom pipettering extraherade provet i en 0,2 mL tunnväggiga nuclease-fri reaktionsröret och placera i en termocykel vid 70 ° C i 2 min. Det är nyckeln till is rör omedelbart efter det första denature för optimal RNA kvalitet. Ingen DNAS behandling behövs.
    2. Medan rören cool förbereder en 400 µL 10 x globinzinkinsulin minskning oligo mix: 100 µL varje två HBA oligos (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3', och 5'-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3') vid 30 µM, två HBB oligos (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3', och 5'-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3') på 120 µM per reaktion, vilket ger en slutlig koncentration på 7,5 µM HBA oligos och 30 µM HBB oligos. Förbereda 10 x oligo hybridisering buffert: 100 mM Tris-HCL, pH 7,6; 200 mM KCl.
    3. Förbereda hybridisering mixen: 6 µg av RNA-prov (7 µL maxvolymen), 2 µL av de 400 µL 10 x globinzinkinsulin minskning oligo mix (slutlig koncentration 2 X), 1 µL 10 x oligo hybridisering buffert (slutlig koncentration 1 x). Tillsätt nuclease-fritt vatten till en slutlig volym av 10 µL.
    4. Ange termocyklern vid 70 ° C för 5 min. Cool omedelbart till 4 ° C och vidare till RNase H matsmältningen.
  2. RNase H matsmältningen
    1. Späd 10 x RNase H (10 U / µL) 1 x RNase H med 1 x RNase H buffert.
      Obs: Den RNase buffert kommer vid 10 x och kommer att behöva spädas med 1 x RNase H buffert till 1 x före användning.
    2. Förbereda RNase H reaktionsblandning genom att kombinera: 2 µL 10 x RNase buffert, 1 µL RNase inhibitor i 2 µL 1 x RNase H och 5 µL nuclease-fritt vatten för att en total volym 10 µL.
    3. Blanda noggrant globinzinkinsulin minskning hybridisering proverna med 10 µL av RNase H reaktionsblandning och smälta vid 37 ° C i 10 min. Cool till 4 ° C.
    4. Stoppa matsmältningen genom tillsats av 1,0 µL 0,5 M EDTA till varje prov och omedelbart gå vidare till rensning steg.
  3. RNase H-behandlade RNA totalrensning.
    1. Rena RNase H behandlas RNA med en kvarts-membran-baserade eluering rening cleanup kit enligt tillverkarens anvisningar. Premix buffertar: för mild tvätt bufferten, lägga till 44 mL 100% etanol.
    2. Inte över provet till en ny tub. Lägga till 80 µL RNase-gratis vatten och 350 μl lyseringsbuffert. Lägga till 250 µL av 100% etanol i utspädda RNA och blanda väl genom pipettering.
      Obs: Inte Centrifugera. Omedelbart gå vidare till steg 5.3.3.
    3. Nu överföra 700 µL provet till en eluering filterpatron som placeras i en 2 mL collection tube att samla flödet genom. Centrifug för 15 s vid ≥ 8 000 x g. Kassera genomflöde.
    4. Upprepa detta genom att placera eluering filterpatronen i en ny 2 mL samling tub. Tillsätt 500 µL av mild tvätt bufferten till filterpatronen och Centrifugera i 15 s vid ≥ 8 000 x g för att tvätta patronen filtermembranet. Kassera genomflöde. Återanvända samling röret i steg 5.3.5.
    5. Nu använder samma prov röret, lägga till en annan 500 µL av 80% etanol till filterpatronen. Denna gång Centrifugera röret för 2 min vid ≥ 8 000 x g. Samla in kolumnen eluering spin för nästa steg och kassera både genomflöde och insamling tube.
    6. Sätta eluering filterpatronen från det sista steget i en ny 2 mL samling tub. Lämna locket öppnar på filterpatronen och centrifugera vid full fart för 5 min torka spin kolumn membranet och förhindra etanol föra över. Kassera genomflöde och samling röret.
      Obs: För att undvika skador vinkel locken pekar i en riktning motsatt den för rotorn.
    7. Ta torkade filterpatronen och placera i en ny 1,5 mL samling tub. Tillsätt 14 µL RNase-fritt vatten för att filtrera patron membran att göra lägga till RNase-fria vattnet direkt till centrum. Centrifug för 60 s i full fart till eluera RNA.
  4. Bedöma kvaliteten på globin-reducerad RNA proverna (steg 6). Fortsätt till mRNA Provberedning (steg 7) och små RNA bibliotek förberedelse (steg 8)16,17.
    Obs: Globin-reducerad RNA prover kan nu lagras vid-20 ° C, men lagring vid-80 ° C rekommenderas för långtidslagring.

6. bedömning av RNA

  1. Kvantifiera RNA-koncentrationen med en spektrofotometer. Undersöka förhållandet mellan 260 och 280 nm våglängd. Nyckeltal på ~ 2 eller mer anses ren för RNA och lägre värden indikerar vissa föroreningar. Instrumentet används detta förhållande för att avgöra RNA-koncentrationen som ng/µL.
  2. Bedöma RNA kvalitet genom att använda 1 µL (100 ng) av provet på en lämplig krets. Slutprodukten ska vara en RIN ~ 2 eller högre och en topp vid ~ 280 nt för mRNA enda Läs bibliotek; små RNA bibliotek toppar på 143 motsvarar microRNA.

7. strandsatta totala RNA provberedning för de mRNA och lång ncRNA bibliotek. 16

  1. Obs: Ta eluering buffert och rRNA borttagning pärlor till rumstemperatur. Före etikett 0,2 ml tunnväggiga PCR-rör (plattor kan också användas). Protokollstegen baserat på tillverkarens instruktioner16.
    1. Börja med 4 µL av globin-reducerad RNA. Tillsätt 6 µL nuclease-gratis vatten, 5 µL av rRNA bindande buffert och 5 µL av rRNA borttagning mix per rör (1st tub). Överför med pipett för att blanda och re-Cap. Placera i termocyklern med 100 ° C värms-lock för 5 min vid 68° C. ta bort och lämna i rumstemperatur i 60 s.
    2. Återsuspendera rRNA borttagning pärlor av virvel; Tillsätt 35 µL av pärlor till nya (2nd) PCR-röret och Pipettera prov från 1st rören på pärlor i 2nd rören. Inkubera 2nd PCR-rör i rumstemperatur i 3 min. Placera på det magnetiska står för 7 min.
      Obs: Blanda varje prov av pipettering för optimal rRNA utarmning. Höja/sänka röret i montern kan bidra till att påskynda separationsprocess.
    3. Överföring supernatanten från 2nd PCR-röret till matchande 3rd PCR-rör och plats till den magnetiska stå för minst 60 s. Upprepa överföringen till en ny PCR-rör endast om pärlorna inte flyttas till tube sidorna.
    4. Blanda provet rening pärlor av virvel; Tillsätt 99 µL till varje 3rd PCR-röret. Låt stå i rumstemperatur i 15 min. plats på magnetisk stå i 5 min. Kontrollera pärlor flyttar till sidorna. Pipetten att Kassera supernatanten.
    5. Håll 3rd rör på magnetisk stå. Tillsätt 200 µL av 70% etanol samtidigt noga med att inte trängs pärlorna. Låt sitta i minst 30 s och pipetten att Kassera supernatanten. Upprepa steg.
    6. Låt torka i rumstemperatur i 15 min på magnetiska stativet. Centrifugera kit eluering bufferten för 5 s vid 600 x g. Ta bort röret och tillsätt 11 µL eluering buffert blanda grundligt. Inkubera i 2 min på bänken då minst 5 min på magnetiska står i rumstemperatur.
    7. Överföra 8,5 µL av supernatanten från 3rd till en ny (4th) PCR-röret. Tillsätt 8,5 µL av Elute/Prime/Fragment hög mix från kit. Blanda väl. Cap och plats i en termocykler med förvärmd lock för 8 min vid 94 ° C, håll vid 4 ° C. Ta bort och centrifugera kort.
  2. Syntetisera första Strand cDNA
    1. Låt första strand syntes mix från kit för att komma till rumstemperatur och centrifugera vid 600 × g i 5 s. överföra 50 µL av omvänt transkriptas i första strand syntes mixen. Omvänt transkriptas kan läggas till först strand syntes i förhållandet 1:9.
    2. Pipettera 8 µL av den kombinerade omvänt transkriptas/första strand syntes blandningen i 4: e röret med provet. Mössa och centrifugera 600 x g i 5 s. plats i termocyklern med förvärmd lock vid 100 ° C. Kör för: 10 min vid 25 ° C, 15 min vid 42 ° C, 15 min vid 70 ° C, sedan vila vid 4 ° C. Slutlig volym är ~ 25 µL per brunn. Gå direkt till nästa steg.
  3. Syntetisera andra Strand cDNA
    1. Ta slut reparation reagens (ERR) och andra Strand Mix (SSM) till rumstemperatur, och centrifugera 600 x g för 5 s. blandningen fela med resuspension buffert vid 1:50 utspädning. Uncap 4th tube och tillsätt 5 µL utspädda ERR och 20 µL av SSM till varje; Pipetten att blanda väl. Slutlig volym ~ 50 µL ds cDNA.
    2. Mössa och inkubera i termocyklern i 1 timme vid 16 ° C. När cykeln är klar, ta bort locken och låt komma till rumstemperatur på bänk.
  4. DS cDNA sanering steg
    1. Börja med att blanda fast fas reversibel immobilisering (SPRI) paramagnetiska pärlorna av virvel. Överföra 90 µL av pärlor till provet i 4thröret (ds cDNA) och blanda. Slutlig volym är 140 µL. Tillåt rören sitta i rumstemperatur i 15 min. Inkubera på magnetisk stå för ~ 5 min. Ta bort ~ 135 µL av supernatanten från varje brunn. Det bör 5 µL kvar i varje brunn.
    2. Låt röret den magnetisk stå och tvätta genom att lägga till 200 µL av 80% etanol. Låt sitta i 30 s och sedan ta bort och Kassera supernatanten. Upprepa tvättningen. Lämna rören på magnetiska står för 15 min till låt torka.
    3. Centrifugera resuspension bufferten vid 600 x g i 5 s efter att ha kommit till rumstemperatur. Ta bort rören från stand. Överför 17,5 µL av resuspension buffert till röret och blanda. Låt rören Inkubera i bänk toppen för flytta till magnetisk stå för 5 min sedan 2 min.
    4. Pipettera 15 µL av supernatanten innehållande ds cDNA proverna till nya uppsättning (5th) 0,2 mL tunnväggiga rör. Flytta till nästa steg omedelbart eller tätning och förvaras vid-15 ° C till-25 ° C i mer än 7 dagar.
  5. Hypofysadenylatecyclase 3' ändarna.
    1. Pipettera 2,5 µL av rumstemperatur resuspension buffert i provet röret sedan tillsätt 12,5 µL av tinade A-Tailing mix. Blanda helt genom pipettering.
      Obs: Ingen A-tailing kontroll används.
    2. Mössa och inkubera i en termocykler med 100 ° C förvärmda lock. Kör vid 37 ° C i 30 min, sedan vid 70 ° C i 5 min med uppvärmd lock. Tillåta termocyklern att vila vid 4 ° C.
  6. Ligera index adaptrar
    1. Placera RNA adapter rören och stoppa Ligation buffert blandning i rumstemperatur. För varje, Centrifugera 600 x g för 5 s. lämna ligering mix i frys tills klar för användning. Prov pooling arrangemang för indexering bör vara kända.
    2. Tillsätt 2,5 µL resuspension buffert och 2,5 µL av ligering mix till varje prov röret. Pipettera nu i 2,5 µL av en ordentlig RNA-adapter i varje prov tub. Adapter urval bör utföras av tillverkarens instruktioner för den valda kit.
    3. Resumé och blanda genom centrifugering för 1 min på 280 x g. Inkubera i en termocykel för 10 min vid 30 ° C. Tillsätt 5 µL stoppa Ligation buffert till provet stoppa reaktionen och blanda väl.
    4. Börja städa upp genom att blanda SPRI paramagnetiska pärlor av virvel för 60 s. överföra 42 µL av pärlor till varje rör. Blanda thoroughlythen Inkubera i 15 min på bänk.
    5. Flytta rören till magnetiska monter och lämna tills flytande svängar klart (~ 5 min). En gång klar avlägsna och kassera 79,5 µL av supernatanten. Lämna rör på den magnetisk stå och tvätta genom att lägga till 200 µL av 80% etanol. Låt sitta i minst 30 s och sedan ta bort och Kassera supernatanten. Upprepa tvättningen. Lämna på magnetisk stå för ytterligare ~ 15 min för torkning. Inte stör pärlor under tvätta stegen.
    6. Tillsätt 52,5 µL av resuspension buffert till provet röret och blanda tills pärlorna är helt nytt svävande. Inkubera i 2 min på bänk. Flytta provet röret tillbaka till magnetisk stå tills vätskan är klar (~ 5 min).
    7. Låt stå och försiktigt överför med pipett 50 μl av supernatanten till nya (6th) rör. Tillsätt 50 µL av vortexed SPRI pärlor. Låt Inkubera i bänk i 15 min.
    8. Flytta till magnetisk stå och låt plattan tills flytande svängar klart (~ 5 min). Kassera 95 µL i supernatanten lämnar 5 µL i varje rör.
    9. Lämna rören på magnetisk stå och tvätta genom att lägga till 200 µL av 80% etanol. Låt röret sitta i 30 s sedan bort och Kassera supernatanten. Upprepa tvätta. Låt rören torka på magnetisk stå i 15 min.
    10. Lägg till 22,5 µL av resuspension buffert och blanda tills pärlor är upphängda. Inkubera på bänk i 2 min och sedan flytta till magnetisk stå tills flytande svängar klart (~ 5 min). Överför med pipett 20 µL prov till nya PCR-rör (7th).
  7. Få komponenter behövs kit till rumstemperatur. Överföra 5 µL av PCR-primer mix och 25 µL av PCR-master mix från kit till prov (7th PCR tube) som innehåller indexerade prover. Blanda provet och cap tube.
    1. Placera rören i termocykel med förvärmd lock. Kör programmet: 98 ° C i 30 s, sedan 15 cykler av 98 ° C för 10 s, 60 ° C under 30 s, 72 ° C under 30 s, 72 ° C i 5 min. Håll vid 4 ° C.
  8. Städa upp prover genom att lägga till 50 µL av tillräckligt blandade SPRI pärlor att prova tube och Pipettera att kombinera. Låt reaktionen på Inkubera bänken uppe i 15 min.
    1. Flytta röret till en magnetisk stå och inkubera tills flytande svängar klart (~ 5 min). Kassera 95 µL i supernatanten lämnar 5 µL i varje rör.
    2. Lämna tube på magnetisk stå och tvätta genom att lägga till 200 µL av 80% etanol. Låt sitta i minst 30 s och sedan ta bort och Kassera supernatanten. Upprepa detta tvätta. Lämna på magnetisk stå för 15 min till låt torka.
    3. Lägg till 32,5 µL av resuspension buffert och blanda tills pärlorna är helt nytt svävande. Inkubera på bänk i 2 min och sedan flytta till magnetisk stå tills flytande svängar klart (~ 5 min). Pipettera 30 µL prov från varje tub i en ny PCR-röret.
    4. Bedöma DNA kvantitet och kvalitet genom att upprepa steg 6.1 och 6.2 med lämpliga chip. Gå vidare till poolning steg (steg 9).

8. små RNA bibliotek förberedelse för sncRNAs. 17

Obs: Protokollstegen baserat på tillverkarens instruktioner17.

  1. Starta små RNA bibliotek prep med ~ 220 ng - ~1.1 µg / µL av globin-reducerad RNA prover (4 µL).
  2. Adapter ligatur
    1. Ligera 3'-adaptern genom att blanda grundligt 1 µL adapter, 2 µL nuclease-gratis vatten och 4 µL av globin-reducerad RNA-prov. Inkubera vid 70 ° C i 2 min och sedan placera omedelbart på is.
    2. Tillsätt 10 µL av 2 x ligering buffert och 3 µL av ligering enzym mix, blanda och inkubera 16 ° C för 18 h.
      Obs: Ökning prov inkubationstiden 18 timmar vid en lägre temperatur på 16 ° C rekommenderas för studier intresserade av metylerade RNA arter, såsom piwi RNAs. Den längre inkubationstiden kan större ligering effektivitet på grund av klassen av ändringar under den 3' adapter ligering fasen.
    3. Tillsätt 1 µL av omvänd Transkription primer i 4,5 µL nuclease-fritt vatten till ligatur blandningen att förhindra adapter-dimer bildandet av överskjutande 3' adapter.
    4. Inkubera i en förvärmd termocykel programmerad för 5 min vid 75 ° C, 15 min vid 37 ° C, 15 min vid 25 ° C och håll vid 4° C.
    5. Denaturera 1 µL före utspädning 5'-adapter per prov i en termocykel vid 70 ° C i 2 min och sedan placera omedelbart på is.
    6. Tillsätt 1 µL av denaturerat 5'-adapter, 1 µL 10 x 5' ligering buffert och 2,5 µL 5' ligering enzym. Blanda och inkubera 25 ° C i 1 h.
  3. cDNA syntes och förstärkning
    1. Blanda omsorgsfullt genom pipettering 30 µL av 5′/3′-adapter-sammanskrivna RNA, 8 µL av första-strand buffert, 1 µL RNase inhibitor och 1 µL av omvänt transkriptas. Inkubera blandningen vid 50 ° C i 60 min. Fortsätt omedelbart till PCR-amplifiering eller värme inaktivera reaktionen vid 70 ° C i 15 min och förvaras vid-20 ° C.
    2. PCR förstärker den 40 µL av omvänt transkriptas reaktion genom att lägga till 50 µL av PCR-master mix, 2,5 µL av RNA PCR primer, tillsätt 2,5 µL av utsedda RNA PCR Primer Index till provet, och nuclease-fritt vatten till en total volym av 100 µL. Blanda genom pipettering. Köra PCR i den termocykel med cykling följande: inledande denaturering vid 94 ° C i 30 s; 11 cykler av 94 ° C för 15 s, glödgning vid 62 ° C i 30 s och förlängning vid 70 ° C för 15 s; följt av en sista förlängning vid 70 ° C för 5 min; prover kan hållas vid 4 ° C i apparat.
    3. Obs: Index läggs för syftet med provet poolning.
  4. Sanering i provet
    1. Från DNA rengöring kit tillsätt 500 µL av bindande buffert (5 M Gu-HCl, 30% isopropanol) till de 100 µL av PCR-förstärkta prov att möjliggöra effektiv bindning till spin-kolumn membranet.
      Obs: Om bindande bufferten har pH-indikator ingår Kontrollera att färgen på blandningen är gul.
    2. Pipett 600 µL blandning av prov och bindande buffert i en filterpatron inuti en 2 mL samling tub, spin för 30-60 s vid 17,900 x g i en bordsskiva centrifug. Kassera genomflöde.
    3. Tvätta filterpatronen i samma samling röret med 0,75 mL kit levereras tvättbuffert (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 80% etanol) genom spinning för 30-60 s vid 17,900 x g i en bordsskiva centrifug och kasta flödet-genom. Snurra filterpatronen torra för en ytterligare 60 s.
    4. Placera filterpatronen i en ren 1,5 mL collection tube. Lägg till 30 µL av eluering buffert (10 mM Tris-HCl pH 8,5), låt kolumnen står för 60 s, och sedan snurra för 60 s vid 17,900 x g i en bordsskiva centrifug.
  5. Bedöma provet kvalitet genom att upprepa steg 6.1 och 6.2 med lämplig DNA chip. Flytta till poolning steg (steg 9).

9. prov pooling för sekvensering

  1. Pool barcoded och QC'ed prover av inrättande och märkning nya rör (eller en 96 väl PCR-plattan) innehåller antingen mRNA eller ncRNA prover. Överföra 13 µL av varje barcoded 10nM bibliotek till motsvarande rör (eller brunnar i nya plattan) per tillverkarens instruktioner16,17. Skicka samlingsprover för sekvensering, vara säker på att välja liknande Läs längder om prover ska köras på samma chip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representativa proverna i vår studie är globin och ribo-utarmat helblod prover. Representativa resultatet i protokollet består av ett globinzinkinsulin utarmat bibliotek prov med ett RNA integritet nummer (RIN) ovan 7 (figur 1en) och 260/280 nm koncentration nyckeltal vid eller över 2 (figur 1b och 1 c). Validering av provet resultatet utfördes med spektrofotometer för att ge varje bibliotek slutliga koncentration och chip-baserade elektrofores ge RIN nummer tillsammans med ett diagram av toppar som visar vilka molekyler (mRNA eller ncRNA) fångades baserat på Infoga storlek i biblioteket provet före sammanslagning och sekvensering. För den aktuella studien var fokus placeras på mRNA och små ncRNAs bara. För de mRNA-bibliotek är det representativa resultatet ett elektroferogram peak på ~ 280 bp (figur 1d). För små ncRNAs representant resultaten består av en rad toppar från ~ 100-400 bp (figur 1e), med toppar på ~ 143 och ~ 153 bp motsvarar MicroRNA och piRNAs, respektive. Våra provresultat visade att vår optimerade teknik resulterade i biblioteken med RIN nummer som varierade från 6.3 (optimalt) till 9,2 (ovanför optimalt). Detta visade sig vara en förbättring jämfört med andra studier som använde globinzinkinsulin utarmning metoder och kunde endast att uppnå RIN nummer vid eller nära 6. De chip-baserade elektrofores resultaten visade även att det är möjligt att uppnå RNA molekylen tillfångatagandet av topparna representerar både mRNA och ncRNA (figur 1 d och 1e) från ett enda blodprov, och infoga urvalsstorlekar som omfattas både små och stora icke-kodande RNA-molekyler. Resultaten är representativa för optimal RIN poängen och infoga storlekar behövs för att säkerställa kvalitet avskrift läser kan sekvenseras från beredda biblioteken för nästan alla NGS RNA-seq plattformar.

Figure 1
Figur 1 : Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 1b
Figur 1b : Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 1c
Figur 1 c : Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 1d
Figur 1 d : Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 1e
Figur 1e : Representativa resultat för mRNA och icke-kodande RNA uttryck bibliotek från enstaka prover av hela grisblod. (a) elektrofores fil kör Sammanfattning representation av RIN nummer före globin och efter globinzinkinsulin minskning. Representant elektroferogrammen (b) pre globin och (c) efter globinzinkinsulin minskning av en enda grisblod av hela provet. (d) representant elektroferogrammen globin och ribo-utarmat helblod mRNA bibliotek proverna före sammanslagning och sekvensering. (e) representant elektroferogrammen av globinzinkinsulin utarmat sncRNA helblod bibliotek av samma prov i panelen d före sammanslagning och sekvensering vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett första viktigt steg i det protokoll som gjorde det optimerade ingår extra globinzinkinsulin utarmning stegen, vilket gjorde det möjligt att få kvalitet läsningar från helblod prover. En av de största begränsningarna på använder helblod i sekvensering studier är det stora antalet läsningar i provet som kommer att mappa till globin molekyler och minska den läser som kan mappas till andra molekyler intresse18. Optimera i protokollet för våra provtyp, behövde vi, införliva en globinzinkinsulin utarmning steg för att säkerställa den högsta möjliga mRNA och icke-kodande RNA fånga genom sekvensering. Alla prover var globinzinkinsulin utarmat till konto för hög globinzinkinsulin avskrifter med svin särskilda hemoglobin A och B (HBA och HBB) oligonukleotider baserat på proceduren från Choi et al., 201414. Ett annat viktigt steg var användningen av en ribo-utarmning utvinning kit som får förmågan att ta bort oönskade RNA-molekyler från våra prover men samtidigt behåller polyadenylated icke-kodande och viral RNA-molekyler av experimentella intresse inom våra bibliotek för sekvensering19. Dessutom kunde vi arbeta med enskilda prover att skapa både kodning (mRNA) och icke-kodande (små och lång) RNA bibliotek genom att ta bort de små RNA anrikning och storlek urval steg. Genom att göra detta, kunde vi att maximera de RNA alikvoter för poolning och garantera skickade vi tillräckligt med volym för att möjliggöra för sekvensering. Optimering av alla tillverkarens protokoll var gjort för att öka mRNA och icke-kodande RNA återvinning för nedströms bibliotek skapa. Vi har också optimerat icke-kodande RNA bibliotek förberedelserna för små icke-kodande RNA portion av vår nedströms analys genom att lägga till ytterligare tid PCR ruvning per tillverkarnas instruktioner att effektivisera ligering av metylerade RNAs och sannolikheten för att återställa piwi-RNAs.

Begränsningarna av optimerad protokollet är rotade i bristande specificitet som också gör den idealisk för flera analyser från ett enda prov. Genom att ta bort den berikning och storlek urval delar av icke-kodande RNA bibliotek preparatet, begränsar vi roman små RNA upptäckt20 för att balansera det mot förvärva både små och långa icke-kodande RNA-molekyler. Därför optimerad protokollet ger en bra översikt över typerna av icke-kodande uttryck, men kräver extra bearbetning under den analytiska etappen av kartläggning för att få mer specifik information om klasser och storlekar av icke-kodande RNA uttryck fångas i den prov. En annan begränsning till metoden är på grund av införlivandet av globinzinkinsulin utarmning stegen, vilket kommer att sänka de totala RIN nummer. Vi kunde felsöka detta genom första undersöka RIN nummer före och efter globinzinkinsulin utarmning att förstå hur stor av en minskning av RNA integritet vi skulle uppleva. Detta gav resultat som visade vi kunde uppleva en droppe ~ 1-2 punkter. För att beakta detta släpp optimerat vi ytterligare globinzinkinsulin utarmning protokollet 6 µg prov istället för de rekommenderade 10 µg. Bidragit till att förbättra våra RIN nummer samt, bevara provet. Dessutom vi också används tunna microamp reaktionsrören och iced rören omedelbart efter det första denatureringen. Detta tillät oss att släcka reaktionen snabbare, vilket möjliggör förbättrad RIN nummer på globinzinkinsulin utarmat prover.

Det modifierade protokoll som används i denna studie har flera fördelar jämfört med de base bibliotek förberedelse metoder som används i andra studier där endast mRNA eller icke-kodande RNA studeras separat. Ändringarna vi gjorde för optimering tillåts för effektiv användning av helblod som våra Provtyp. Detta är fördelaktigt för framtida studier eftersom helblod som en Provtyp har mindre steg för insamling och behandling än leukocyt portion av blod. Dessutom helblod också har extra fördelar med att låta forskare att undersöka systemisk svaren och upprepade gånger kan samlas från djuret. Det finns dock en varning till användning av hela blodprov att mängden blod som samlas in är beroende av ålder och storlek av organismen i fråga. Mindre mängder blod kommer att leda till lägre RNA avkastning, men metoden presenteras här kommer tillåta dubbla bibliotek skapelse från minst 2,5 mL helblod. Detta tillät för oss att använda ett prov för att undersöka både mRNA och icke-kodande uttryck och korrelera både individ på en ögonblicksbild i tid, effektivt Tillåt oss att samla in mer information än traditionella biblioteket beredningsmetoder. Också, genom att utföra ribo-utarmning vi gjort det möjligt att minska avskrifter som kunde tömma sekvensering läser, samtidigt som de icke-kodande och viral avskrifter som kan förloras under traditionella biblioteket skapande att studera mRNA. På detta sätt tredubblar vårt optimerade protokoll mängden information som kan vinnas från ett enda prov. Andra betydande förändringar som vi gjort till metoden att underlätta tillfångatagandet av mer RNA arter information var: ändra typ av PCR-plattan att snabbt stoppa reaktionen, som förbättrade RNA renhet avkastning; en längre termocyklern inkubation att öka ligering för eventuell återvinning av metylerade RNAs; och inte anställa en storlek urval gel, som möjliggör alla detekterbara ncRNAs identifieras oavsett längd. För efterföljande analys tillåtet detta för fångst av flera icke-kodande RNAs mellan 18nt-200nt i längd.

Genom att använda denna optimerad metod, kunde vår grupp att lägga fram ett protokoll som kan tillämpas på helblod transcriptomic analyser och möjliggöra mRNA och icke-kodande RNA från ett enda prov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Omnämnande av varunamn eller kommersiella produkter i den här artikeln är endast i syfte att tillhandahålla specifik information och innebär inte rekommendation eller bekräftelse av US Department of Agriculture. USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes främst av de av USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, och delvis av USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Denna studie stöddes delvis av en utnämning till jordbruks Service forskning deltagande forskningsprogrammet administreras av Oak Ridge Institutet för vetenskap och utbildning (ORISE) via en institutionsöverskridande avtal mellan oss Department of Energy ( DOE) och US Department of Agriculture. ORISE sköts av Oak Ridge associerade universiteten under DOE kontrakt inte. DE-AC05-06OR2310.

Vi vill tacka Dr Kay Faaberg för HP-PRRSV smittsamma klonerna, Dr Susan Brockmeier för hennes hjälp med djur involverad i experimentet, och Sue Ohlendorf för kontorstjänster i beredning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PAXgene Tubes PreAnalytix 762165
Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
mirVana miRNA Isolation Kit ThermoFisher AM1560
Rneasy MinElute Clean Up Kit QIAGEN 74204
100% Ethanol Decon Labs, Inc. 2716
0.2 mL thin-walled tubes ThermoFisher 98010540
1.5 mL RNase/DNase - free tubes Any supplier
Veriti 96-well Thermocycler ThermoFisher 4375786R
Globin Reduction Oligo (α 1) Any supplier Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT
Globin Reduction Oligo (α 2) Any supplier Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA
Globin Reduction Oligo (β 1) Any supplier Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT
Globin Reduction Oligo (β 2) Any supplier Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT
10X Oligo Hybridization Buffer
-Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
-KCl Millipore Sigma 60142-100ML-F
10X RNase H Buffer
 -Tris-HCl, pH 7.6 Fisher Scientific BP1757-100
 -DTT ThermoFisher Y00147
 -MgCl2 Promega A351B
 -Molecular Biology Grade Water ThermoFisher 10977-015
RNase H ThermoFisher AM2292
SUPERase-IN ThermoFisher AM2694 Rnase inhibitor
EDTA Millipore Sigma E7889
Microcentrifuge Any supplier
 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument Agilent Technologies G2938C
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies 5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA  Kit Agilent Technologies 5067-4626
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero  Illumina RS-122-2201 mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A  (48 samples, 12 indexes)
TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide Illumina Available on-line
RNAClean XP Beads BeckmanCoulter A63987
AMPure XP Beads BeckmanCoulter A63880
MicroAmp Optical 8-tube Strip ThermoFisher N8010580 0.2 ml thin-walled tubes
MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap ThermoFisher N801-0535
RNase/DNase - free reagent reservoirs Any supplier
SuperScript II Reverse Transcriptase ThermoFisher 18064-014
MicroAmp Optical 96 well plates ThermoFisher N8010560 These were used in place of .3mL plates as needed
MicroAmp Optical adhesive film ThermoFisher 4311971
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1)  New England Biolabs E73005 small RNA kit
NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2)  New England Biolabs E75805 small RNA kit
QIAQuick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
96S Super Magnet Plate ALPAQUA A001322

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
  2. Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
  3. Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
  4. Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
  5. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  6. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  7. Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
  8. Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf (2015).
  9. Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
  10. Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).
  11. Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
  12. Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
  13. Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
  14. Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
  15. Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf (2007).
  16. TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
  17. New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018).
  18. Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
  19. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
  20. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).

Tags

Immunologi och infektion fråga 141 mRNA icke-kodande RNA RNA-Seq helblod epigenetiska globinzinkinsulin minskning
Identifiering av kodning och icke-kodande RNA klasser uttryckta i svin helblod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fleming, D. S., Anderson, S. J.,… More

Fleming, D. S., Anderson, S. J., Miller, L. C. Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood. J. Vis. Exp. (141), e58689, doi:10.3791/58689 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter