Summary
Her presenterer vi en protokollen optimert for behandling av koding (mRNA) og ikke-koding (ncRNA) globin redusert RNA-seq biblioteker fra en enkelt hele blodprøve.
Abstract
Advent innovativ og stadig kraftigere neste generasjons sekvensering teknikker har åpnet nye muligheter i muligheten til å undersøke det underliggende genuttrykk knyttet til biologiske prosesser rundt. Disse nyvinningene gjør ikke forskere å observere uttrykk fra mRNA sekvensene som kode for gener som effekten cellulære funksjoner, men også ikke-koding RNA (ncRNA) molekyler som forbli uoversatt, men likevel har regulatoriske funksjoner. Selv om forskere har muligheten til å observere både mRNA og ncRNA, har det vært vanlig for en studie for å fokusere på ett eller annet. Men når studier er interessert i både mRNA og ncRNA uttrykk, bruker mange ganger de separate prøver for å undersøke koding eller ikke-koding RNAs på grunn av forskjellen i biblioteket forberedelser. Dette kan føre til behovet for flere prøver som kan øke tid, forbruksvarer og dyr stress. I tillegg kan det føre forskerne å avgjøre å forberede prøver eneste analyse, vanligvis mRNA, begrense antall biologiske spørsmål som kan bli undersøkt. Men ncRNAs spenner over flere klasser med regulatoriske roller effekt mRNA uttrykket. Fordi ncRNA er viktig grunnleggende biologiske prosesser og forstyrrelse av disse prosessene i under infeksjon, kan de derfor gjøre attraktiv mål for therapeutics. Dette manuskriptet viser en endret protokoll for generasjon mRNA og ikke-koding RNA uttrykk biblioteker, inkludert viral RNA, fra et enkelt utvalg av fullblod. Optimalisering av denne protokollen, forbedret RNA renhet, økt ligation for utvinning av denaturert RNAs og utelatt størrelse utvalg, for å tillate fangst av flere RNA arter.
Introduction
Neste generasjons sekvensering (NGS) har dukket opp som et kraftig verktøy for etterforskningen av endringene som oppstår på genomisk nivå biologiske organismer. Eksempel forberedelse til NGS metoder kan endres avhengig av organismen, vev type, og enda viktigere spørsmålene forskerne er opptatt av å adresse. Mange studier har slått til NGS som studerer forskjellene i genekspresjon mellom stater som sunn og syke individer1,2,3,4. Sekvensering ta plass på hele genomet basis og lar forsker å fange mest, om ikke alle, genomisk informasjon for en bestemt genetisk markør gangen pek.
Den vanligste markører uttrykksformer observert er messenger RNAs (mRNAs). Mest brukte prosedyrene for fikse biblioteker for RNA-seq er optimalisert for utvinning av mRNA molekyler ved hjelp av en rekke renselser, fragmentations og ligations5,6. Men avhenger beslutningen om hvordan en protokoll er utført svært mye på prøvetype og spørsmålene som stilles om sa prøven. I de fleste tilfeller trekkes totale RNA; Likevel, ikke alle RNA molekyler er av interesse og i slike tilfeller mRNA uttrykk studier altfor rikelig RNA arter, som ribosomal RNAs (rRNA) må fjernes for å øke antall synlig transkripsjoner knyttet til mRNAs. Den mest populære og brukte metoden for å fjerne rikelig rRNA molekylene er reduksjonen av polyadenylated RNA transkripsjoner kalles polyA uttømming7. Denne tilnærmingen fungerer godt for analyse av mRNA uttrykk som påvirker mRNA transkripsjoner. Men i studier som er interessert i ikke-koding eller viral RNAs, fjerner polyA uttømming også disse molekyler.
Mange studier vil fokusere på RNA sekvens biblioteket utarbeidelse undersøke enten mRNA uttrykk (koding) eller en bestemt klasse av små eller store ikke-koding. Selv om det er andre prosedyrer8 som vår at to utvalg forberedelse, forberede mange studier biblioteker fra separate prøver separate studier når tilgjengelig. For en studie som vår krever dette vanligvis flere blodprøver øke tid, forbruksvarer og dyr stress. Målet med vår studie var å kunne bruke hele blod fra dyr til å identifisere og telle de forskjellige klassene av både mRNA og ikke-koding RNA uttrykt mellom sunn og svært patogene svin reproduksjons- og åndedretts syndrome virus (HP-PRRSV) utfordret griser9,10 til tross for at bare en enkelt hele blodprøve (2.5 mL) fra hver gris. For dette, måtte vi optimalisere typisk utvinning og biblioteket etablering protokoller generere riktige data å tillate analyse av både mRNA og ikke-koding RNA (ncRNA) uttrykk11 fra et enkelt utvalg.
Dette bedt om et behov for en protokoll som er tillatt for mRNA og ikke-koding RNA analyse fordi tilgjengelig standard kits og metoder for oppretting av RNA-utvinning og biblioteket var ment hovedsakelig for mRNA og bruke en poly-A uttømming trinn12. Denne steg ville ha gjort det umulig å gjenopprette ikke-koding RNA eller viral transkripsjoner fra utvalget. Derfor en optimalisert metode var nødvendig som tillatt for totale RNA utvinning uten prøve polyA uttømming. Metoden presentert i dette manuskriptet er blitt optimert å tillate bruk av fullblod som en prøve og bygge sekvensering biblioteker for både mRNA og ncRNAs av små og store størrelser. Metoden har blitt optimalisert for å tillate for analyse av alle oppdages ikke-koding RNAs samt beholde viral RNAs for senere undersøkelser13. I alle tillater våre optimalisert biblioteket forberedelse protokollen for etterforskningen av flere RNA molekyler fra en enkelt hele blodprøve.
Det overordnede målet bak bruken av denne metoden var å utvikle en prosess som er tillatt for innsamling av både ikke-koding RNA og mRNA fra et utvalg av hele blod. Dette tillater oss å ha mRNA, ncRNA og viral RNA for hvert dyr i vår studie fra en enkelt prøve9. Dette til slutt gir mer vitenskapelige funn uten tilleggskostnader dyr og gir et mer komplett bilde av uttrykk for hver enkelte eksempel. Metoden beskrevet tillater undersøkelse av regulatorer av genuttrykk samt tillater gradering av correlative sammenligne begge mRNA og ikke-koding RNA uttrykk ved hjelp av en enkelt hele blodprøve. Vår studie brukt denne protokollen til å undersøke endringer i genuttrykk og mulig epigenetic regulatorer i virally infiserte 9 - uke gamle mannlige kommersielle griser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr protokollene ble godkjent av National Animal sykdom Center (USDA-ARS-NADC) Animal Care og bruk komiteen.
1. innsamling av svin blod prøver
- Samle blodprøver i RNA rør. Samle ~2.5 mL eller mer hvis større samling rør.
2. behandling av svin blod prøver
- Sentrifuge blod rør 5,020 x g i 10 min ved romtemperatur (15-25 ° C). Hvis behandlingen frosne prøvene ruge rør ved romtemperatur for et minimum på 2 timer før sentrifugering.
- Fjerne nedbryting og legge 8 mL RNase gratis vann til pellet. Lukk og vortex pellets til det synlig oppløses. Sentrifuge eksempel rør 5,020 x g i 10 min ved romtemperatur å gjenopprette pellet. Forkast alle nedbryting og bevare pellet.
3. organisk utvinning for Total RNA og små RNA (miRNA isolering Kit)
- Starte totale RNA utvinning av pipettering 300 µL av bindende lyseringsbuffer til pellet fra trinn 2.2.
- Vortex og overføre blandingen til en ny merket 1,5 mL sentrifuge rør. Legge til 30 µL av homogenate additiv fra kit. Vortex tube og sted på isen i 10 min.
- Fjerner røret og legger 300 µL av syre-fenol: kloroform reagens fra kit. Vortex røret å blande. Sentrifuge 10.000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern forsiktig vandige fasen (300-350 µL) til en frisk tube. Merk volumet for neste trinn.
4. totalt RNA isolasjon prosedyre
- Basert på mengden av vandig utvinning (300-350 µL) legge til 1,25 x volum av 100% (~ 375 µL) etanol vandige fasen. Bland prøven ved hjelp av en pipette.
- Sette opp nye samling rør som inneholder en filterelementet for hvert utvalg. Pipetter ~ 675 µL av lysate/etanol blandingen på filterelementet.
Merk: Ikke Legg til > 700 µL filterelementet samtidig. For større volumer gjelder i rekkefølge. - Sentrifuge kort (~ 15-20 s) på 10 000 x g væske passere filteret. Ikke spinne hardere enn dette.
- Utelate flyten gjennom og, om nødvendig gjenta sentrifugering med gjenværende lysate/etanol blandingen til det har alle vært brukt. Behold samme filteret kassetten og samling rør for neste trinn.
- Legge til 700 µL vask løsning 1 fra kit filterelementet og sentrifuge kort (~ 10 s) gjennom filteret. Forkast flyten gjennom og beholde samme filteret kassetten og samling rør.
- Legg til 500 µL av vaskeløsning 2/3. Sentrifuger å trekke væsken gjennom filterelementet. Kast flyten gjennom. Gjenta wash trinn.
- The samme rør, spin filterelementet en ekstra 60 s fjerne gjenværende væske fra filteret. Overføre filterelementet til en fersk samling rør.
- Legg 100 µL av forvarmet (95 ° C) nuclease-fritt vann til midten av filterelementet. Spinn for ca 20-30 s tabletop sentrifuge maks hastighet.
Merk: RNA kan finnes i eluate og nå videre behandlet eller lagret på 20 ° C eller under. Berikelse for små RNAs ble ikke utført.
5. globin reduksjon (basert på en protokollen optimert for svin hele blodprøver)14,15
Merk: Globin reduksjon utføres slik at biblioteker ikke er overbefolket med leser tilordning til globin gener som ville redusere antall leser tilgjengelig å tilordne til andre gener større interesse14,15 .
- Hybridisering med globin reduksjon oligos
- Denature RNA (6 µg RNA utvalget i maksimalnivå 7 µL) ved pipettering utdraget prøven inn i et 0,2 mL tynnvegget nuclease-fri reaksjon rør og sette i en termisk cycler på 70 ° C i 2 minutter. Det er nøkkelen til is rør umiddelbart etter første denature skritt for optimal RNA kvalitet. Ingen DNase behandling er nødvendig.
- Mens rør kule forberede en 400 µL av 10 x globin reduksjon oligo blanding: 100 µL hver av to HBA -oligos (5'-GATCTCCGAGGCTCCAGCTTAACGGT-3', og 5-TCAACGATCAGGAGGTCAGGGTGCAA-3 ") på 30 µM, to HBB oligos (5'-AGGGGAACTTAGTGGTACTTGTGGGC-3', og 5-GGTTCAGAGGAAAAAGGGCTCCTCCT-3 ") på 120 µM per reaksjon, gir en siste konsentrasjon av 7,5 µM HBA oligos og 30 µM HBB oligos. Forberede 10 x oligo hybridisering buffer: 100 mM Tris-HCL, pH 7.6; 200 mM KCl.
- Klargjør hybridisering blandingen: 6 µg av RNA prøve (maksimalt 7 µL volum), 2 µL av de 400 µL av 10 x globin reduksjon oligo blanding (siste konsentrasjon 2 X), 1 µL av 10 x oligo hybridisering buffer (siste konsentrasjon 1 x). Legge til nuclease-fritt vann i en endelig mengde 10 µL.
- Satt thermocycler til 70 ° C i 5 min. Cool umiddelbart til 4 ° C, og Fortsett til RNase H fordøyelsen.
- RNase H fordøyelse
- Fortynne 10 x RNase H (10 U / µL) til 1 x RNase H med 1 x RNase H buffer.
Merk: RNase buffer kommer på 10 x og må fortynnes med 1 x RNase H bufferen til 1 x før å bruke. - Forberede RNase H reaksjonen blanding ved å kombinere: 2 µL av 10 x RNase buffer, 1 µL av RNase hemmer i 2 µL av 1 x RNase H og 5 µL nuclease-gratis vann til et totalvolum 10 µL.
- Bland godt Globin reduksjon hybridisering prøvene med 10 µL RNase H reaksjonen blanding og fordøye ved 37 ° C i 10 min. kule til 4 ° C.
- Stoppe fordøyelsen ved tillegg av 1.0 µL av 0,5 M EDTA hvert utvalg og videre umiddelbart til rengjøring trinn.
- Fortynne 10 x RNase H (10 U / µL) til 1 x RNase H med 1 x RNase H buffer.
- RNase H-behandlet totalt RNA opprydding.
- Rense RNase H behandlet RNA bruker en silica-membranbasert elueringsrør rensing opprydding kit i henhold til produsentens instruksjoner. Premix buffere: mild vaske bufferen, legge 44 mL av 100% etanol.
- Overfør ikke utvalget til en ny tube. Legge til 80 µL RNase uten vann og 350 µL av lyseringsbuffer. Legg til 250 µL av 100% etanol utvannet RNA og bland godt av pipettering.
Merk: Ikke sentrifuge. Gå rett til trinn 5.3.3. - Nå overføre 700 µL prøven til et elueringsrør filterelementet plassert i en 2 mL samling rør å samle flyten gjennom. Sentrifuger 15 s ≥ 8000 x g. Kast gjennomflytsenhet.
- Gjenta dette ved å plassere elueringsrør filteret kassetten i en ny 2 mL samling rør. Legg til 500 µL av mild vaske bufferen filterelementet og sentrifuge for 15 s ≥ 8000 x g for å vaske filteret kassetten membranen. Kast gjennomflytsenhet. Bruke samlingen røret i trinn 5.3.5.
- Nå bruker samme utvalg rør, legge til en annen 500 µL av 80% etanol filterelementet. Denne gangen sentrifuge røret i 2 minutter på ≥ 8000 x g. Samle kolonnen elueringsrør spinn for neste trinn og forkaste både gjennomflytsenhet og samling rør.
- Sett filterelementet elueringsrør fra det siste trinnet i en ny 2 mL samling rør. La lokket åpent på filterelementet, og virvel i full fart i 5 min tørke spinn kolonnen membranen og hindre etanol bære over. Kast gjennomflytsenhet og samling røret.
Merk: For å unngå skade vinkel lokkene å peke i en retning motsatt av rotoren. - Ta tørket filteret kassetten og plasser i en ny 1,5 mL samling rør. Legge til 14 µL av RNase-fritt vann filtrere patron membran sørge for å legge til RNase-fritt vann direkte til sentrum. Sentrifuger for 60 s i full fart å elute RNA.
- Vurdere kvaliteten på globin-redusert RNA prøvene (trinn 6). Videre til mRNA eksempel forberedelse (trinn 7) og små RNA biblioteket forberedelse (trinn 8)16,17.
Merk: Globin-redusert RNA prøver kan nå lagres på 20 ° C, men lagring ved-80 ° C anbefales for langsiktig bevaring.
6. vurdering av RNA
- Kvantifisere RNA konsentrasjon bruker et spektrofotometer. Undersøke bølgelengde forholdet mellom 260 og 280 nm. Prosenter av ~ 2 eller høyere regnes ren for RNA og lavere verdier angir noen forurensning. Apparatet bruker dette forholdet for å avgjøre RNA konsentrasjon som ng/µL.
- Vurdere RNA kvalitet ved hjelp av 1 µL (100 ng) for eksempel på en passende flis. Sluttproduktet skal være en RIN ~ 2 eller høyere og en topp på ~ 280 nt for mRNA enkelt lese biblioteker; små RNA biblioteker topper på 143 tilsvarer miRNAs.
7. strandet totale RNA eksempel forberedelse til mRNA og lang ncRNA biblioteker. 16
- Merk: Ta elueringsbufferen og rRNA fjerning perler til romtemperatur. Pre etiketten 0,2 ml tynnvegget PCR rør (plater kan også brukes). Protokollen trinn basert på produsentens instruksjoner16.
- Start med 4 µL av globin-redusert. Legg 6 µL nuclease uten vann, 5 µL rRNA bindende bufferen og 5 µL av rRNA fjerning blanding per tube (1st rør). Pipetter for å mikse og re-cap. Plasser i thermocycler med 100 ° C oppvarmet-lokk for 5 min på 68° C. Fjern og la ved romtemperatur for 60 s.
- Resuspend rRNA fjerning perler av vortex; legge til 35 µL av perler i ny (2nd) PCR tube og Pipetter utvalg fra 1st rørene på perler i 2nd rørene. Inkuber 2nd PCR rør ved romtemperatur for 3 min. Plasser på magnetiske står i 7 min.
Merk: Bland hvert utvalg godt av pipettering for optimal rRNA uttømming. Øke/Lowering røret i stand kan hjelpe å fremskynde renseprosess. - Overføring nedbryting fra 2nd PCR tuben til samsvarende 3rd PCR og plasser på de stå i minst 60 s. Gjenta overføringen i en ny PCR-tube bare hvis perlene ikke flyttes til røret sidene.
- Mix utvalg rensing perler av vortex; legge til 99 µL hver 3rd PCR rør. La sitte i romtemperatur i 15 min. sted på magnetiske står for 5 min. sikre perler flytter til sider. Pipetter forkaste nedbryting.
- Holde 3rd rør på magnetiske stå. Legge til 200 µL av 70% etanol mens være forsiktig med å skubbe perler. La sitte i minst 30 s og pipette forkaste nedbryting. Gjenta trinn.
- Kan prøve å tørke i romtemperatur i 15 min på magnetiske stand. Sentrifuge kit elueringsrør bufferen for 5 s 600 x g. Fjern rør og legge 11 µL elueringsrør bufferen blander grundig. Inkuber for 2 min på benken da minst 5 min på magnetiske står ved romtemperatur.
- Overføre 8,5 µL av nedbryting fra 3rd til en ny (4th) PCR rør. Legge til 8,5 µL Elute/Prime/Fragment høy Mix fra kit. Bland godt. Cap og plass i en thermocycler med forvarmet lokk i 8 min 94 ° c, hold på 4 ° C. Fjerne og sentrifuger kort.
- Syntetisere første Strand cDNA
- Lar første strand syntese blanding kit å komme til romtemperatur og sentrifuge 600 × g for 5 s. overføre 50 µL av revers transkriptase i første strand syntese mix. Revers transkriptase kan legges til første tråd syntese i forholdet 1:9.
- Pipetter 8 µL av den kombinerte revers transkriptase/første tråd syntese blandingen inn i 4 røret med prøve. Cap og sentrifuge 600 x g 5 s. sted i thermocycler med forvarmet lokk satt til 100 ° C. Kjøre: 10 min ved 25 ° C, 15 minutter til 42 ° C, 15 minutter til 70 ° C, da hvile på 4 ° C. Endelig er ~ 25 µL per brønn. Flytte umiddelbart til neste trinn.
- Syntetisere andre Strand cDNA
- Bringe slutten reparasjon reagens (feil) og andre Strand Mix (SSM) til romtemperatur, og sentrifuge 600 x g for 5 s. blanding FEILE med rørets buffer på 1:50 fortynning. Slipp 4th rør og legge 5 µL av utvannet feil og 20 µL av SSM til hver; Pipetter til blandingen. Siste bindet ~ 50 µL ds cDNA.
- Cap og ruge i thermocycler i 1 time ved 16 ° C. Når syklusen er fullført, fjerne caps og la kom til romtemperatur benk toppen.
- DS cDNA opprydding trinn
- Begynn med å blande Solid fase reversibel immobilisering (SPRI) spinn perler av vortex. Overføre 90 µL av perler til prøven i 4thtube (ds cDNA) og bland. Endelig er 140 µL. Tillat rør å sitte ved romtemperatur i 15 min. ruge på magnetiske stå for ~ 5 min. Fjern ~ 135 µL av nedbryting fra hver brønn. Det bør 5 µL igjen i hver brønn.
- La røret på magnetiske stand og vask ved å legge til 200 µL av 80% etanol. La sitte i 30 s så fjerne og fjerne supernatant. Gjenta wash trinn. La rør på den magnetiske stå i 15 minutter for å la det tørke.
- Sentrifuge rørets bufferen på 600 x g for 5 s etter kommer til romtemperatur. Fjern rør fra stativet. Overføre 17,5 µL rørets bufferen til røret og bland. La rør ruge på benk toppen for Flytt til magnetisk stå i 5 min deretter 2 min.
- Pipetter 15 µL av nedbryting som inneholder ds cDNA prøver å nye sett med (5th) 0,2 mL tynnvegget rør. Flytte til neste steg raskt eller forsegle og lagre på-15 ° C til-25 ° C for mer enn 7 dager.
- Adenylate 3 ender.
- Pipetter 2,5 µL romtemperatur rørets bufferen i prøven røret og deretter legge 12.5 µL tinte A Tailing mix. Bland helt ved pipettering.
Merk: Ingen A tailing kontroll brukes. - Cap og ruge i en thermocycler med 100 ° C forvarmet lokk. Kjøre på 37 ° C i 30 minutter, deretter til 70 ° C i 5 min med oppvarmet lokk. Tillate thermocycler å hvile på 4 ° C.
- Pipetter 2,5 µL romtemperatur rørets bufferen i prøven røret og deretter legge 12.5 µL tinte A Tailing mix. Bland helt ved pipettering.
- Ligate indeks adaptere
- Bringe RNA adapter rør og stoppe Ligation Buffer blandingen til romtemperatur. For hver, sentrifuge 600 x g for 5 s. la ligation blanding i fryseren til du er klar for bruk. Eksempel pooling ordning for indeksering bør være kjent.
- Legge til 2,5 µL rørets bufferen og 2,5 µL av hemorroider hver eksempel rør. Nå Pipetter i 2,5 µL av riktig RNA adapteren inn i hvert eksempel rør. Adapter utvalg bør utføres av produsentens instruksjoner for valgte kit.
- Oppsummering og bland med sentrifugering for 1 min 280 x g. Inkuber i en termisk cycler i 10 min på 30 ° C. Legge 5 µL stoppe Ligation bufferen til å stoppe reaksjonen og bland godt.
- Start rydde opp av blander SPRI spinn perler av vortex for 60 s. overføre 42 µL av perler til hver tube. Blanding thoroughlythen ruge i 15 min på benk toppen.
- Flytte rør til magnetisk stå og la til flytende svinger fjerner (~ 5 min). En gang klar fjerne og slette 79,5 µL av nedbryting. La rør på magnetiske stand og vask ved å legge til 200 µL av 80% etanol. La sitte i minst 30 s så fjerne og fjerne supernatant. Gjenta wash trinn. La på magnetiske står for ekstra ~ 15 minutter å tillate tørking. Ikke avbryte perler i vask trinnene.
- Legg 52.5 µL rørets bufferen til eksempel røret og bland til perlene er helt nytt suspendert. Inkuber i 2 minutter på benk toppen. Flytte prøven tube tilbake til magnetisk stå til væsken er klar (~ 5 min).
- La på stativ og Pipetter forsiktig 50 µL av nedbryting å ny (6th) rør. Legge til 50 µL av vortexed SPRI perler. Tillat for å ruge på benk toppen i 15 min.
- Flytte til magnetisk stå og la platen bo til flytende svinger fjerner (~ 5 min). Forkast 95 µL av nedbryting forlater 5 µL i hver retning.
- La rør på magnetiske stå og vask ved å legge til 200 µL av 80% etanol. Tillate tube å sitte for 30 s deretter fjerne og slette nedbryting. Gjenta vask. La rør tørr på magnetiske stå i 15 min.
- Legg i 22,5 µL rørets bufferen og bland til perler er suspendert. Ruge på benken i 2 minutter, deretter gå til magnetisk stå til flytende blir klart (~ 5 min). Pipetter 20 µL av prøve i nye PCR rør (7th).
- Bringe nødvendig Utstyrskomponenter til romtemperatur. Overføre 5 µL av PCR primer og 25 µL PCR master Mix Kit utvalg (7th PCR rør) som inneholder indekserte prøver. Bland utvalg og cap.
- Plassere rør i termisk cycler med forvarmet lokk. Kjør programmet: 98 ° C for 30 s, da 15 sykluser av 98 ° C for 10 s, 60 ° C for 30 s, 72 ° C for 30 s, 72 ° C i 5 min. Hold på 4 ° C.
- Rydd eksempler ved å legge til 50 µL av tilstrekkelig blandet SPRI perler rør og Pipetter kombinere. At reaksjonen å ruge på benk toppen i 15 min.
- Flytt røret til en magnetisk stå og ruge til flytende svinger fjerner (~ 5 min). Forkast 95 µL av nedbryting forlater 5 µL i hver retning.
- La røret på magnetiske stå og vask ved å legge til 200 µL av 80% etanol. La sitte i minst 30 s og deretter Fjern og Forkast nedbryting. Repeter dette vask. La på magnetiske stå i 15 minutter for å la det tørke.
- Legg i 32,5 µL rørets bufferen og bland til perlene er helt nytt suspendert. Ruge på benken i 2 minutter, deretter gå til magnetisk stå til flytende blir klart (~ 5 min). Pipetter 30 µL av prøve fra hver rør i en ny PCR-tube.
- Vurdere DNA kvantitet og kvalitet ved å gjenta trinn 6.1 og 6.2 med passende chip. Gå til pooling trinn (trinn 9).
8. liten RNA biblioteket forberedelse til sncRNAs. 17
Merk: Protokollen trinn basert på produsentens instruksjoner17.
- Starte liten RNA biblioteket prep med ~ 220 ng - ~1.1 µg / µL av globin-redusert prøver (4 µL).
- Adapter hemorroider
- Ligate 3-adapteren ved å blande grundig 1 µL adapter, 2 µL nuclease uten vann og 4 µL av globin-redusert RNA prøve. Ruge på 70 ° C i 2 minutter og umiddelbart plasser på is.
- Legg 10 µL av 2 x ligation buffer, og 3 µL av hemorroider enzym mix, mix og ruge 16 ° C i 18 t.
Merk: Økning eksempler inkubasjon tid 18 timer ved lavere temperatur på 16 ° C anbefales for studier interessert i denaturert RNA arter, som piwi RNAs. Lengre inkubasjon tiden tillater større ligation effektivitet på grunn av klassen av endringer i 3 adapter ligation fasen. - Legge til 1 µL av omvendt transkripsjon primer i 4,5 µL av nuclease-fritt vann ligation blandingen å hindre adapter-dimer dannelsen av overflødig 3' adapter.
- Ruge i en forvarmet termisk cycler programmert for 5 min på 75 ° C, 15 min ved 37 ° C, 15 min ved 25 ° C, og holde på 4° C.
- Denature 1 µL av pre utvannet 5'-adapter per prøve i et termisk cycler på 70 ° C i 2 minutter og umiddelbart plasser på is.
- Legg 1 µL av denaturert 5'-adapter, 1 µL 10 x 5" hemorroider bufferen og 2,5 µL av 5' ligation enzym. Bland og ruge 25 ° C i 1 time.
- cDNA syntese og forsterkning
- Bland godt av pipettering 30 µL av 5 ' / 3-kort-samskrevet RNA, 8 µL av første-strand buffer, 1 µL av RNase hemmer og 1 µL av revers transkriptase. Inkuber blandingen ved 50 ° C i 60 min. Fortsett umiddelbart til PCR forsterkning eller varme deaktivere reaksjonen på 70 ° C i 15 min og lagre på 20 ° C.
- PCR forsterke den 40 µL revers transkriptase reaksjon ved å legge til 50 µL av PCR master mix, 2,5 µL av RNA PCR primer, legge til 2,5 µL av utpekte RNA PCR Primer indeksen utvalg, og nuclease-fritt vann til et totalt volum på 100 µL. blande av pipettering. Kjøre PCR i termisk cycler bruker sykling følgende: innledende rødsprit 94 ° c for 30 s; 11 sykluser av 94 ° C for 15 s, annealing ved 62 ° C for 30 s og utvidelse ved 70 ° C i 15 s; etterfulgt av en siste utvidelse ved 70 ° C i 5 min; eksempler kan holdes på 4 ° C i cycler.
- Merk: Indekser legges formål eksempel pooling.
- Prøve oppryddingen
- Fra DNA opprydding kit legge 500 µL bindende bufferen (5 M Gu-HCl, 30% isopropanol) til at 100 µL av PCR forsterket prøve å aktivere effektiv binding til spin-kolonne membranen.
Merk: Hvis bindingen bufferen har pH indikator inkludert Kontroller at fargen på blandingen er gul. - Pipetter 600 µL blanding av prøven og bindende buffer i et filterelement inne en 2 mL samling rør, spinn for 30-60 s 17,900 x g i en tabletop sentrifuge. Kast gjennomflytsenhet.
- Vask filterelementet i samme samling rør med 0,75 mL kit leveres vaskebuffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 80% etanol) av spinning for 30-60 s 17,900 x g i en tabletop sentrifuge og forkaster strømmen-gjennom. Spin filterelementet tørr for en ekstra 60 s.
- Sett filterelementet i en ren 1,5 mL samling rør. Legge til 30 µL av elueringsbufferen (10 mM Tris-HCl pH 8.5), la kolonnen står for 60 s, og deretter spinne for 60 s 17,900 x g i en tabletop sentrifuge.
- Fra DNA opprydding kit legge 500 µL bindende bufferen (5 M Gu-HCl, 30% isopropanol) til at 100 µL av PCR forsterket prøve å aktivere effektiv binding til spin-kolonne membranen.
- Vurder eksempel kvalitet ved å gjenta trinn 6.1 og 6.2 med passende DNA chip. Flytte til pooling trinn (trinn 9).
9. eksempel tilkoblingsgruppering for sekvensering
- Bassenget barcoded og QC'ed eksempler ved å sette og merking nye rør (eller en 96 godt PCR plate) inneholder mRNA-eller ncRNA. Overføre 13 µL av hvert barcoded 10nM bibliotek til tilsvarende rør (eller brønner i den nye platen) per produsentens instruksjoner16,17. Sende gruppert prøver for sekvensering, være sikker på å velge lignende Les lengder hvis prøvene skal kjøres på samme brikke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representative utvalgene i vår undersøkelse er globin og ribo-utarmet hele blodprøver. Representant utfallet av protokollen består av en globin utarmet biblioteket prøve med en RNA integritet nummer (RIN) over 7 (figur 1en) og 260/280 nm konsentrasjon forholdstall på eller over 2 (figur 1b og 1 c). Validering av prøven utfallet ble utført med spektrofotometer for å gi endelige konsentrasjonen av hvert bibliotek og chip-baserte geleelektroforese å gi RIN-nummer sammen med et diagram med topper som viser hvilke molekyler (mRNA eller ncRNA) ble tatt basert på Sett inn størrelsen i biblioteket prøven før pooling og sekvenser. For denne studien var fokus plassert på mRNA og små ncRNAs bare. MRNA bibliotekene representant resultatet er en electropherogram peak på ~ 280 bp (figur 1d). For små ncRNAs representant resultater består av en rekke peaks ~ 100-400 bp (figur 1e), med topper på ~ 143 og ~ 153 bp tilsvarer miRNAs og piRNAs, henholdsvis. Prøven resultatene viste at våre optimalisert teknikk resulterte i biblioteker med RIN tall som varierte fra 6.3 (sub-optimal) til 9.2 (over optimalt). Dette viste seg for å være en forbedring i forhold til andre studier som brukte globin uttømming metoder og klarte bare å oppnå RIN tall på eller nær 6. Chip-baserte gelelektroforese resultatene viste også at fra en enkel blodprøve er det mulig å oppnå RNA molekylet erobringen av topper som representerer både mRNA og ncRNA (tall 1 d og 1e), og sett inn utvalgene som dekket både små og store ikke-koding RNA molekyler. Disse resultatene er representant for den optimale RIN score og sett størrelser for å sikre kvalitet transkripsjon leser kan sekvensielt fra forberedt bibliotekene for nesten alle NGS RNA-seq-plattformer.
Figur 1 : Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 1b : Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 1 c : Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 1 d : Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 1e : Representant resultater for mRNA og ikke-koding RNA uttrykk biblioteker fra eneste prøver av svin fullblod. (a) geleelektroforese arkiv løpe Sammendrag representasjon av RIN tall før globin reduksjon og etter globin reduksjon. Representant electropherograms (b) før globin reduksjon og (c) etter globin reduksjon av en enkelt svin hele blodprøve. (d) representant electropherograms av globin og ribo-utarmet fullblod mRNA biblioteket prøver før pooling og sekvenser. (e) representant electropherograms av globin utarmet sncRNA fullblod biblioteker av samme prøvene i panelet d før pooling og sekvensering Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det første kritiske trinnet i protokollen som gjorde det optimalisert inkludert lagt globin uttømming trinnene, som gjorde det mulig å få kvalitet leser fra hele blodprøver. En av de største begrensningene på bruk fullblod i sekvensering studier er det høye antallet leser i utvalget som tilordnes globin molekyler og redusere lest som kan tilordnes til andre molekyler rundt18. Derfor optimalisere protokollen for vår eksempel type, trengte vi å innlemme en globin uttømming trinn for å sikre høyest mulig mRNA og ikke-koding RNA fange gjennom sekvensering. Alle prøvene var globin utarmet kontoen for høye nivåer av globin utskrifter med svin bestemte hemoglobin A og B (HBA og HBB) oligonucleotides basert på fremgangsmåten fra Choi et al., 201414. En annen avgjørende skritt var bruken av en ribo-uttømming utvinning kit som er tillatt for muligheten til fjerner uønskede RNA molekyler fra våre prøver samtidig samtidig som polyadenylated ikke-koding og viral RNA molekyler av eksperimentelle interesse i våre biblioteker for sekvensering19. I tillegg kunne vi arbeide med enkelt prøver å lage både koding (mRNA) og ikke-koding (små og lang) RNA biblioteker ved å fjerne de små RNA berikelse og størrelse utvalg skritt. Gjør dette, klarte vi å maksimere RNA dele for samkjøring og garantere vi sendte nok volum å tillate sekvensering. Optimalisering av alle produsentens protokoller ble gjort for å øke mRNA og ikke-koding RNA gjenoppretting for nedstrøms biblioteket etableringen. Vi har også optimalisert ikke-koding RNA biblioteket forberedelsene til den lille ikke-koding RNA delen av vår nedstrøms analyse ved å legge til ekstra tid den PCR inkubering per produsentens instruksjoner å effektivisere ligation denaturert RNAs og sannsynligheten for å utvinne piwi-RNAs.
Begrensningene for optimalisert protokollen er forankret i mangel på spesifisitet som også gjør det ideelt for flere analyser fra et enkelt utvalg. Fjerner berikelse og størrelse utvalg deler av ikke-koding RNA biblioteket forberedelsene, begrense vi romanen lite RNA oppdagelsen20 for å balansere den mot å anskaffe både små og lenge ikke-koding RNA molekyler. Derfor optimalisert protokollen gir en god oversikt av de ikke-koding uttrykk, men krever ekstra behandling under analytisk Stadium i kartlegging for å få mer informasjon om klassene og størrelser av ikke-koding RNA uttrykk fanget i den prøven. En annen begrensning for metoden er inkorporering av globin uttømming skrittene, som vil redusere det totale RIN-antall. Vi kunne feilsøke dette ved første å undersøke RIN tallene før og etter globin uttømming å forstå hvor stor av en reduksjon i RNA integritet vi vil oppleve. Dette gitt resultater som viste vi kan oppleve en dråpe ~ 1-2 poeng. Til dette slipp optimert vi fremme globin uttømming protokollen til 6 µg av prøve i stedet for den anbefalte 10 µg. Dette bidro til å forbedre våre RIN tall, samt, spare prøven. I tillegg vi også brukt tynnvegget microamp reaksjon rør og glasur rør umiddelbart etter denaturing steg. Dette tillot oss å slukke reaksjonen raskere, gir forbedret RIN tall på globin utarmet prøver.
Endret protokollen som brukes i denne studien har flere fordeler sammenlignet med base bibliotek forberedelse metodene som brukes i andre studier der bare mRNA eller ikke-koding RNA behandles separat. Endringene gjorde vi for optimalisering tillatt for effektiv bruk av fullblod våre eksempel filtype. Dette er en fordel for fremtidige studier fordi fullblod som et eksempel har mindre fremgangsmåten for innsamling og behandling av leukocytter delen av blod. Dessuten fullblod også har ekstra fordeler tillate forskere å undersøke systemisk svar og kan samles flere ganger fra dyret. Det er imidlertid en advarsel til bruk av hele blodprøver i at mengden blod samlet er avhengig av alder og størrelsen på organismen i spørsmålet. Mindre mengder blod vil føre til lavere RNA avkastning, men metoden som presenteres her vil tillate dobbelt biblioteket etableringen fra minst 2,5 mL av fullblod. Dette gjorde for oss å bruke ett utvalg å undersøke både mRNA og ikke-koding uttrykk og koordinere både til en person på et øyeblikksbilde i tid, effektivt tillater oss å samle inn mer informasjon enn tradisjonelle biblioteket forberedelse metoder. Også ved å utføre ribo-uttømming gjort vi det mulig å redusere utskrifter som kunne tømme sekvensering leser, stund fremdeles retaining ikke-koding og viral utskrifter som kan gå tapt under oppretting av tradisjonelle bibliotek å studere mRNA. På denne måten tredobler våre optimalisert protokollen mengden informasjon som kan oppnås fra et enkelt utvalg. Andre betydelige endringer vi metoden å lette fange av RNA arter mer var: endre PCR plate å stoppe raskt reaksjonen, som forbedret RNA renhet avkastning; en lengre thermocycler inkubasjon øke ligation for mulig utvinning av denaturert RNAs; og ikke ansette en størrelse utvalg gel, for å tillate alle synlig ncRNAs identifisert uansett lengde. For nedstrøms tillatt dette for erobringen av flere ikke-koding RNAs mellom 18nt-200nt lengde.
Ved en slik adferd optimalisert, kunne vår gruppe legge frem en protokoll som kan brukes til fullblod transcriptomic analyser og tillate mRNA og ikke-koding RNA fra et enkelt utvalg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Omtale av varemerker eller kommersielle produkter i denne artikkelen er utelukkende å gi informasjon, og innebærer ikke anbefaling eller oppfordring av det amerikanske Landbruksdepartementet. USDA er like muligheter leverandøren og arbeidsgiver.
Acknowledgments
Dette arbeidet var hovedsakelig støttes av den av USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236, og delvis av USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Denne studien ble støttet delvis av utnevnelsen Agricultural Research Service deltakelse forskningsprogrammet administrert av Oak Ridge Institutt for vitenskap og utdanning (ORISE) gjennom en interagency avtale mellom US Department of Energy ( DOE) og det amerikanske Landbruksdepartementet. ORISE administreres av Oak Ridge tilknyttet universiteter DOE kontrakt ikke. DE-AC05-06OR2310.
Vi vil gjerne takke Dr. Kay Faaberg for HP-PRRSV smittsomme kloner, Dr. Susan Brockmeier hennes hjelp med dyr involvert i forsøket, og Sue Ohlendorf sekretær hjelp med utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase - free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase - free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
References
- Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
- Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
- Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
- Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf (2015).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).
- Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
- Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
- Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
- Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
- Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf (2007).
- TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
- New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018).
- Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).
