Summary

רצפי RNA בתא יחיד של נוירונים Fluorescently שכותרתו העכבר באמצעות מיון ידני וכפול במבחנה תמלול עם ספירות מוחלטת רצף (DIVA-Seq)

Published: October 26, 2018
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר את המדריך מיון ההליך כדי לבודד את הנוירונים fluorescently שכותרתו יחיד ואחריו במבחנה מבוסס-תמלול mRNA הגברה עבור רצפי RNA תא בודד גבוה-עומק.

Abstract

רצפי RNA בתא יחיד (RNA-seq) הוא כעת כלי מיושמים באופן נרחב assaying ביטוי גנים. פלטפורמות זמינים מסחרית של רצפי RNA בתא יחיד לעבד תאי כל קלט ללא אבחנה. לפעמים, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) משמש במעלה הנהר כדי לבודד אוכלוסיה ספציפית עם תוויות של ריבית. מגבלה של FACS הוא בצורך מספר גבוה של תאי קלט עם שברים שכותרתו באופן משמעותי, אשר אינה מעשית עבור איסוף והגדרת פרופיל נדיר או בדלילות שכותרתו נוירון אוכלוסיות מהמוח העכבר. כאן, אנו מתארים שיטה עבור באופן ידני איסוף דליל fluorescently שכותרתו נוירונים יחיד של טרי הפומבית רקמת מוח העכבר. תהליך זה מאפשר לכידת נוירונים התווית על-ידי יחיד עם טוהר גבוהה ושילוב הבאים עם במבחנה הגברה מבוססת-תמלול פרוטוקול ששומרת יחסי התעתיק אנדוגני. אנו מתארים שיטה הגברה ליניארי זוגי המשתמשת מזהים ייחודיים מולקולה (UMIs) כדי ליצור ספירות mRNA בודדות. שני סיבובים של הגברה תוצאות ברמה גבוהה של זיהוי גנים לכל תא ותא.

Introduction

רצפי RNA בתא יחיד (RNA-seq) הפכה מחקרים transcriptomic. בעוד RNAseq תא יחיד בקנה מידה גדול יכול להתבצע תוך שימוש במגוון טכניקות, כגון טיפות1,2, מיקרופלואידיקה3, nanogrids4, microwells5, לרוב השיטות לא ניתן למיין את סוגי תאים מוגדרים זה בטא fluorophores מקודדים גנטית. כדי לבודד אוכלוסיה בחר תא, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) משמש לעתים קרובות כדי למיין תאים עם תוויות במצב תא בודד. עם זאת, FACS יש הגבלות מסוימות ומחייב שלבי עיבוד הדגימה מוקפד. ראשית, מספר גדול של תאי קלט הם בדרך כלל צורך (לעיתים קרובות מספר מיליון תאים לכל mL), עם חלק קטן משמעותית (> 15 – 20%) המכיל את האוכלוסייה עם תוויות. שנית, ההכנות התא עשויים לדרוש מספר סיבובים של צפיפות שלבים הדרגתיים צנטריפוגה כדי להסיר שבר גליה, פסולת, ובתצורות תא כי אחרת עלול לסתום את התא חרירים או זרימה. שלישית, FACS מעסיקה בדרך כלל מכתים, destaining צעדים חי/מת מכתים (למשל, 4 ′ 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), propidium יודיד (PI), צבעי Cytotracker), אשר לקחת את הזמן נוספים. רביעית, כמו כלל אצבע על שני צבעים מיון (כגון דאפי חלבון פלואורסצנטי ירוק/אדום (GFP/RFP)), בדרך כלל שני מדגמים ובקרת אחד נדרשים, הדורשים דוגמה ללא תווית יעובדו בנוסף המתח העכבר הרצויה. חמישית, סינון מבוצעת לעיתים קרובות מספר פעמים לפני ובמהלך מדגם מיון באופן יזום למנוע שורות מדגם סתומות מכשיר FACS. שישית, זמן חייב להקציב ב כיוונוני FACS הנפוץ לאתחל, לייצב את זרם נוזלים, לבצע כיול droplet. שביעית, שליטה דגימות מופעלים בדרך כלל ברצף לפני באוסף הדגימה בפועל כדי להגדיר פיצוי מטריצות, כפיל דחייה, הגדרת שערים, וכדומה משתמשים גם לבצע צעדים שש ושבע עצמם מבעוד מועד או לדרוש סיוע של טכנאי במקביל. לבסוף, פוסט-FACS, לעיתים קרובות ישנם צעדים כדי להבטיח כי רק תווית יחידה תאים הם נוכח כל טוב; לדוגמה, על-ידי בדיקת דגימות בתוך מלכודת הקרנה גבוהה-תוכן כגון imager צלחת מהיר.

כדי לעקוף את השלבים שפורטו לעיל ולהקל יחסית מהיר, ממוקד רצף של אוכלוסיה קטנה של נוירונים שכותרתו fluorescently יחיד, אנו מתארים ידנית מיון הליך ואחריו שני סיבובים של רגישות גבוהה חוץ גופית בתוך פרוטוקול הגברה, נקרא שעתוק הפריה כפולה עם ספירות מוחלטת רצף (DIVA-Seq). דור הגברה RNA ספריית cDNA המותאמים מ. Eberwine et al. 6 והשמשוני. et al. 7, עם שינויים מסוימים כדי להתאים interneurons העכבר שיש כרכים הסלולר קטן יותר; יתר על כן, מצאנו גם כי זה שהנשק של נוירונים כפירמידה סינאפסות.

Protocol

כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על-ידי IACUC קר ספרינג הרבור מעבדה, ניו יורק (IACUC #16-13-09-8). 1. מיון ידני של העכבר Fluorescently שכותרתו נוירונים למשוך 10 – 15 מיקרומטר קוטר יציאה באמצעות ההגדרות הבאות של פולר נימי זכוכית microcapillaries (ראה טבלה של חומרים): חום: 508, משיכה: רי?…

Representative Results

באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, GABAergic העצב היו ידנית למיין (איור 1) ואז RNA היה מוגבר, הפך ספריית cDNA (איור 2) וסודרו עומק גבוה8. המוצרים RNA (ארנה) מוגבר נע בין 200 – 4,000 bp בגודל, עם התפלגות שיא מעט מעל 500 bp (איור 3 א). ספריית cD…

Discussion

המדריך מיון פרוטוקול מתאים רצפי RNA תחת פיקוח של נוירון אוכלוסיות שהן גם בדלילות שכותרתו במוח עכברים או הם המייצגים אוכלוסיה תא נדיר כי אחרת אינו אפשרי ללמוד באמצעות התא הנוכחי תפוקה גבוהה שיטות מיון של הגברה. התאים נתון FACS בדרך כלל עוברים לחצים קו נדן ודגימת בטווח של psi ~ 9 – 14, תלוי בגודל הח?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH (5R01MH094705-04, R01MH109665-01 כדי Z.J.H.), על ידי הקרן Neuroscience רוברטסון CSHL (ל Z.J.H.), ועל ידי NARSAD לפוסט מלגת (אקולוגיה).

Materials

ERCC RNA Spike-In Control Mixes Thermo Fisher Cat# 4456740
SuperScript III Thermo Fisher Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer New England Biolabs Cat# E6105S
RNA MinElute kit Qiagen Cat# 74204
Antarctic phosphatase New England Biolabs Cat# M0289
Poly nucleotide kinase New England Biolabs Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated New England Biolabs Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads Beckman Coulter Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads Thermo Fisher Cat# B23317
DL-AP5 Tocris Cat# 0105
CNQX Tocris Cat# 1045
TTX Tocris Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich Cat# P5147
Message Amp II kit Thermo Fisher Cat# AM1751
Carbogen Airgas Cat# UN3156
Sylgard 184 Sigma-Aldrich Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit Illumina Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip Agilent Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip Agilent Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100 Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F). Leica Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. Warner instruments Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller Sutter Instruments Co P-97
Vibratome Thermo Microm HM 650V
Vibratome tissue cooling unit Thermo Microm CU 65

References

  1. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  3. Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
  4. Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
  5. Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
  6. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  7. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  8. Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
  9. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
  10. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
  11. Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
  12. Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
  13. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  15. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).

Play Video

Cite This Article
Paul, A., Huang, Z. J. Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq). J. Vis. Exp. (140), e58690, doi:10.3791/58690 (2018).

View Video