Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي الماوس باستخدام الفرز اليدوي وضعف في المختبر النسخ تهم المطلق بالتسلسل (DIVA-Seq)

Published: October 26, 2018 doi: 10.3791/58690
Automatic Translation
1, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory

Summary

ويصف هذا البروتوكول دليل الفرز الداخلي لعزل الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي واحدة تليها في المختبر على أساس النسخ التضخيم مرناً لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة عالية والعمق.

Abstract

خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي (الرنا-seq) الآن أداة تنفذ على نطاق واسع للمعايرة التعبير الجيني. منصات تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة متاحة تجارياً عملية خلايا الإدخال جميعا دون تمييز. في بعض الأحيان، يتم استخدام الخلية المنشط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) المنبع لعزل سكان على وجه التحديد مسمى للفائدة. حد من نظام مراقبة الأصول الميدانية هو الحاجة إلى إعداد كبيرة من خلايا الإدخال مع كسور المسمى إلى حد كبير، وغير عملي لجمع وتوصيف السكان العصبية نادرة أو قليلة مسماة من الدماغ الماوس. هنا، نحن تصف طريقة يدوياً جمع متفرق المسمى فلوريسسينتلي واحدة من الخلايا العصبية من طازجة نات بأنسجة المخ الماوس. تسمح هذه العملية لالتقاط المسمى واحد الخلايا العصبية مع درجة نقاء عالية والتكامل اللاحقة مع بروتوكولا تضخيم المستندة إلى النسخ في المختبر أن يحافظ على نسب النسخة المحلية. يمكننا وصف أسلوب تضخيم خطي مزدوج يستخدم معرفات فريدة من نوعها جزيء (أوميس) لتوليد الفرد مرناً التهم. جولتين من نتائج التضخيم في درجة عالية من اكتشاف الجينات كل خلية مفردة.

Introduction

وقد تحول خلية واحدة تسلسل الحمض النووي الريبي (الرنا-seq) دراسات ترانسكريبتوميك. وفي حين يمكن إجراء رناسيق خلية واحدة على نطاق واسع باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات، مثل قطرات1،2، ميكروفلويديكس3، نانوجريدس4و5من ميكروويلس، معظم الأساليب لا يمكن فرز أنواع الخلايا المحددة أن التعبير عن فلوروفوريس وراثيا المرمزة. لعزل سكان تحديد خلية، غالباً fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لفرز الخلايا المسماة في وضع خلية واحدة. ومع ذلك، نظام مراقبة الأصول الميدانية بعض قيود ويتطلب خطوات تجهيز العينة الدقيق. أولاً، عدد كبير من خلايا الإدخال عادة حاجة (غالباً عدة ملايين الخلايا كل مل)، مع جزء كبير (> 15 – 20%) التي تحتوي على السكان المسمى. ثانيا، قد تتطلب استعدادات خلية جولات متعددة من كثافة الطرد المركزي التدرج الخطوات لإزالة جزء الدبقية، والحطام، وكتل الخلايا التي قد تسد إلا الخلية فوهة أو تدفق. ثالثا، نظام مراقبة الأصول الميدانية توظف عادة تلطيخ وديستاينينج خطوات للعيش/الميت تلطيخ (مثلاً من 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، يوديد propidium (PI)، والأصباغ سيتوتراكير)، الذي يستغرق وقتاً إضافيا. الرابع، كما أن هناك حاجة إلى قاعدة عامة اللونين الفرز (مثل DAPI والبروتين الأخضر الأحمر نيون (التجارة والنقل/RFP))، عادة ما تكون العينتين وعنصر تحكم واحد، التي تتطلب عينة غير مسمى بحيث تتم معالجتها بالإضافة إلى سلالة الماوس المطلوب. خامسا، تصفية غالباً ما تتم عدة مرات قبل وأثناء الفرز عينة شكل استباقي منع الأسطر عينة انسداد في جهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية. سادسا، يجب تخصيص وقت في الأجهزة نظام مراقبة الأصول الميدانية الأكثر استخداماً تهيئة واستقرار تدفق السوائل وإجراء المعايرة الحبرية. مراقبة السابعة، يتم عادة تشغيل عينات في تسلسل قبل جمع العينة الفعلية لإعداد مصفوفات التعويض، ورفض يبنوا، تعيين غيتس، مستخدمين إلخ أما ستة وسبعة أنفسهم قبل الموعد المحدد بالخطوات أو تتطلب مساعدة فني بالتوازي. وأخيراً، وظيفة-نظام مراقبة الأصول الميدانية، غالباً ما تكون هناك خطوات للتأكد من أن فقط تسمية واحدة خلايا موجودة في كل بئر؛ على سبيل المثال، بفحص عينات في إعداد فحص محتوى عالية مثل تصوير لوحة سريع.

للتحايل على الخطوات المذكورة أعلاه وتيسير سريعة نسبيا، تستهدف تتابعها من عدد صغير من السكان من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي واحد، يصف لنا دليل الفرز الإجراء متبوعاً بجولتين من درجة عالية من الحساسية في المختبر بروتوكول التضخيم، دعا مزدوجة في المختبر النسخ تهم المطلق بالتسلسل (DIVA-Seq). الجيش الملكي النيبالي التضخيم وكدنا توليد المكتبة مقتبسة من أبرون et al. 6 وهاشيمشوني et al. 7، مع إجراء بعض التعديلات لتناسب إينتيرنيورونس الماوس التي لديها كميات أصغر الخلوية؛ وعلاوة على ذلك، وجدنا أيضا أن من المفيد أيضا للخلايا العصبية الهرمية عليه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية أقرها IACUC في "الربيع الباردة ميناء المختبر"، نيويورك (IACUC #16-13-09-8).

1-دليل فرز الخلايا العصبية الماوس المسمى فلوريسسينتلي

  1. سحب الزجاج ميكروكابيلاريس (انظر الجدول للمواد) إلى 10 – 15 ميكرون خروج القطر باستخدام ساحبة شعرية مع الإعدادات التالية: الحرارة: 508، سحب: حطي فارغة،: فارغة، الوقت: فارغة.
  2. إرفاق أنابيب سيليكون مرنة 120-150 سم (~0.8 مم داخل القطر) إلى 0.2 ميكرون ثنائي الفلوريد (PVDF) غشاء الفينيليدن مرشح المحاقن وصمام أنابيب ذات اتجاهين باستخدام موصلات أنابيب مناسبة.
  3. إعداد 500 مل المثلجة (4 درجات مئوية) السائل الدماغي النخاعي اصطناعية (قام، الجدول 1)، والأوكسجين بالأكسجين 5% ثاني أكسيد الكربون متوازنة محتدما خلال أيرستوني لمدة 15 دقيقة، أو حتى مسح الحل تماما.
  4. تحضير 100 مل قام مع كوكتيل محصرات النشاط في كوب 150 مل (الجدول 1).
  5. تحضير 100 مل قام مع 1 ملغ/مل العقدية الكسر الرابع حوزتي في كوب 150 مل (الجدول 1).
  6. تحضير 100 مل قام بالحل 1% مصل بقرى الجنين (FBS) في كوب 150 مل والأوكسجين مع الأكسجين 5% ثاني أكسيد الكربون متوازنة من خلال أيرستوني.
  7. تشريح الدماغ من ماوس euthanized بفتح الجمجمة مع مقص صغير واستخراج الدماغ جديدة باستخدام الملقط غرامة دون إلحاق الضرر بالقشرة.
    ملاحظة: يمكن استخدام الفئران أي السلالة والعمر ونوع الجنس حسب المطلوب. لا تجميد الدماغ أو القيام بالفرز اليدوي على الفئران حقن بالفيروسات أو غيرها من العوامل الخطرة/المعدية.
  8. الحفاظ على الدماغ في قام مبردة والاوكسيجين، تاركاً أيرستوني تعلق على الأوكسجين توازن ثاني أكسيد الكربون 5% خلال كامل مدة تمزيقها.
  9. ضع الدماغ على تشاك فيبرتوم وقطع المقاطع الاكليلية أو السهمي في 300 ميكرون سمك. جمع العديد من الأقسام حسب الحاجة للحصول على الحد أدنى من ~ 10 – 50 المسماة الخلايا تصل إلى عدة مئات من الخلايا. وضع شرائح على حامل شريحة يعشق القطن، وضعها داخل كوب حيث أنها هي حمم في قام اﻷوكسيجين.
  10. نقل الشرائح الطازجة في كوب يحتوي على قام بنشاط لسد وكتلة لمدة 15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الاحتفاظ بالأوكسجين الفقاعي باستخدام أيرستوني.
  11. نقل الشرائح إلى دورق يحتوي على قام بحوزتي الحل القيام بعملية الهضم معتدل في درجة حرارة الغرفة: 20 – 30 دقيقة للحيوانات P4 14 أو ما يصل إلى 45 – 60 دقيقة للحيوانات P28-56. الاحتفاظ بالأوكسجين محتدما.
  12. تغسل قام بحوزتي بإعادة نقل الشرائح إلى الكأس التي تتضمن قام بنشاط محصرات الحل لمدة 5 – 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الاحتفاظ بالأوكسجين محتدما.
  13. نقل المقاطع الفردية إلى طبق بتري 100 ملم تتضمن قام مع 1% FBS في درجة حرارة الغرفة. تحت نطاق تشريح فلورسنت والمناطق ميكروديسيكت وطبقات من الفائدة وجود حد أدنى من 10 – 50 الخلايا (تصل إلى بضع مئات). أداء ميكروديسيكتيون مع زوج من الملقط غرامة أو عن طريق إرفاق ز 22 – 28 الحقن بالإبر على أصحاب خشبية (الاسياخ).
  14. استخدام ماصة باستور، تحريك القطع ميكروديسيكتيد إلى 2 مل [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على ~0.8 مل من 1% FBS في الحل قام.
  15. تريتوراتي تشريح الأنسجة في [ميكروفوج] أنابيب في درجة حرارة الغرفة. جعل ثلاث ماصات باستور نشأت منذ فترة طويلة مع تناقص أقطار الخروج بالتدحرج لهم لهب المكشوف. أداء ~ 10 السكتات الدماغية مع كل ماصة، بدءاً من أكبر وتنتهي مع أصغر.
  16. الاستغناء عن خلايا معزولة في طبق بتري 100 ملم تتضمن قام اﻷوكسيجين (يمكن أن تكون مغلفة طبق بيتري رقيقة مع 5 مم أجار 1% أو سيليكون واضحة مجمع في 01:10 نسبة، إذا رغبت في ذلك). الحفاظ على درجة حرارة الغرفة.
  17. انتظر ~ 5-7 دقيقة للخلايا إلى تدريجيا تسوية، ثم مراقبة إشارة بروتينات فلورية خضراء/طلب تقديم العروض تحت مجهر تشريح.
    ملاحظة: الخلايا المفردة، والحطام، وكتل صغيرة ستكون مرئية في مشرق الميدان (BF).
  18. اختر الخلايا بروتينات فلورية خضراء/طلب تقديم العروض 10 – 15 في وقت واحد باستخدام ماصة شعرية (من الخطوة 1، 1) المرفقة بأنابيب سيليكون مرنة (0.4 – 0.8 مم القطر الداخلي) والاستغناء عن الخلايا في طبق بتري 100 ملم تتضمن قام اﻷوكسيجين الطازجة.
  19. بحظر نهاية صمام الأنابيب مع اللسان، موقف شعري القرب من الخلية التي تهم. التقاط الخلايا باستخدام شعري العمل على التخفيف من الكتلة، وكتلة بسرعة مرة أخرى الحيلولة دون دخول ماصة السوائل الزائدة. الاستغناء عن الخلايا على 100 مم طبق بيتري مع قام اﻷوكسيجين الطازجة التي تهب بلطف، مع التقيد بنصيحة الشعرية تحت البصريات fluorescence مجهر التشريح. تهدف جمع ~ 100-150 مجموع الخلايا.
  20. كرر الخطوة 1.19 مرة أو مرتين أكثر (اعتماداً على الحطام) ونقل ما مجموعة ~ 50 – 75 الخلايا إلى طبق بتري 100 ملم جديدة، مع التأكد من أن الملوثات مثل الحطام ضئيلة في التدخل التفاضلية مشرق حقل البصريات التباين (DIC).
  21. أخيرا، باستخدام ماصة ميكروكابيلاري جديدة كل الوقت، اختر خلية واحدة في لا أكثر من حجم 0.5 ميليلتر وطرد في أنبوب واحد 0.2 مل [ميكروفوج] (أو قطاع واحد من ثمانية أنابيب [ميكروفوج] 0.2 مل) الذي يحتوي على 1 ميليلتر من المخزن المؤقت لجمع العينات مع الإشعال N10B1-N10B96 (الجدول 2). كسر طرف الماصة في [ميكروفوج] أنابيب لضمان أن يبقى الخلية في المخزن المؤقت للمجموعة. تجاهل الماصات.
  22. تجميد الخلايا بوضع أنابيب على الثلج الجاف وتخزينها طويلة الأجل في ثلاجة-80 درجة مئوية حتى أنهم على استعداد لتجهيزها لتضخيم الحمض النووي الريبي.

2-أول جولة من الحمض النووي الريبي التضخيم

ملاحظة: الإجراء التالي قطاع واحد من ثمانية أنابيب [ميكروفوج] 0.2 مل. مقياس ردود الفعل حسب الحاجة.

  1. توليف حبلا أول من كدنا (الجولة الأولى).
    1. الحرارة شرائط من الخطوة 1.22 في ˚C 70 لمدة 5 دقائق تليها ˚C 4 لمدة 5 دقائق؛ كرر مرتين.
    2. تجميع على الجليد المنتسخة العكسية (RT) الرئيسية ميكس/أولاً-حبلا توليف مزيج الرئيسي استخدام المكونات التالية (انظر الجدول للمواد): 10 × المخزن المؤقت الأول-ستراند (2 ميليلتر)، دنتب مزيج (4 ميليلتر)، ومثبط رناسي (1 ميليلتر) وإنزيم (1 ميليلتر).
    3. باختصار الطرد المركزي في القطاع في أجهزة الطرد مركزي منضدية لجمع كل شيء في الجزء السفلي. الحفاظ على الجليد.
    4. إضافة ميليلتر 1 RT الرئيسية ميكس/أولاً-حبلا توليف مزيج الرئيسي لأنابيب أعلاه (إجمالي حجم 1 ميليلتر من المخزن المؤقت عينة من مجموعة الخلية + 1 ميليلتر من RT = 2 ميليلتر/أنبوب). مزيج جيد من قبل بيبيتينج. تدور بإيجاز إلى جمع المحتوى بأكمله في الجزء السفلي، وإبقائه على الجليد.
    5. احتضان الأنبوب/s أعلاه في 42 درجة مئوية ح 2 في فرن هواء. وضع الأنابيب على الجليد فورا لإنهاء رد فعل والمضي قدما إلى الخطوة الثانية-حبلا التوليف.
  2. توليف الطريقة الثانية لكدنا (الجولة الأولى).
    1. جعل الثانية حبلا مزيج الرئيسي (80 ميليلتر) على الجليد بالترتيب التالي في أنبوب 1.5 مل: المياه خالية من نوكلاس (63 ميليلتر)، 10 x الثانية حبلا المخزن المؤقت (10 ميليلتر)، دنتب ميكس (4 ميليلتر)، دنا بوليميريز (2 ميليلتر)، ورناسيه (1 ميليلتر). مزج المكونات جيدا من قبل فورتيكسينج، ثم تدور لجمع في الجزء السفلي، والحفاظ على الجليد.
    2. Cycler الحرارية، بدء تشغيل البرنامج التالي لتبرد قبل الوحدة، وتكون على استعداد لبدء الخطوة 2.2.3 (غطاء الحرارة = قبالة؛ 16 درجة مئوية ل 2 ح، عقد 4 درجة مئوية)، وتوقف عند 16 درجة مئوية.
    3. إضافة 80 ميكروليتر/قطاع (أو 10 ميليلتر/أنبوب) من الثانية حبلا مزيج الرئيسي لكل أنبوبة من قطاع والحفاظ على الجليد. تحويل قطاع غزة إلى cycler الحرارية واستئناف الخطوة 16 درجة مئوية بدأت أعلاه. احتضان القطاع ح 2 في 16 درجة مئوية.
    4. بعد الخطوة الثانية-حبلا التوليف، وضع الأنابيب على الجليد المضي قدما إلى الخطوة التالية في تنقية كدنا.
  3. تنقية كدنا الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة (الجولة الأولى).
    ملاحظة: تتم جميع سينتريفوجيشنز في ~ 8,000 س ز في درجة حرارة الغرفة. لم تتجاوز 16,000 ز x لتجنب الأضرار بخرطوشة تصفية.
    1. بدء تشغيل التدفئة 100 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي إلى 50-55 درجة مئوية لاستخدامها لاحقاً في كتلة تدفئة جافة. لم تتجاوز 58 درجة مئوية لمنع تمسخ الجزئي لكدنا.
    2. إضافة 250 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم كدنا أن أنبوب 1.5 مل. تحقق من وجود رواسب في المخزن المؤقت، ثم الحارة الحل المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بإعادة حل رواسب.
    3. نقل كدناس من قطاع واحد من 8-الأنبوبة إلى المخزن المؤقت ملزم كدنا. دمج الخلايا في هذه الخطوة من أجل المزيد من المصب العمليات (8 خلايا في الأنبوب 1). مزيج دقيق من قبل بيبيتينج 2-3 مرات والتحريك 3-4 مرات. زيادة ونقصان لجمع المحتوى الموجود في الجزء السفلي.
    4. وضع خرطوشة تصفية كدنا في أنابيب المياه والصرف الصحي (من مجموعة نسخ (IVT) في المختبر ) بشدة. إضافة هذا المزيج أعلاه إلى المركز لعامل التصفية. الطرد المركزي في 8,000 س ز ~ 1 دقيقة أو حتى من خلال عامل تصفية. تجاهل-التدفق عبر واستبدال أنابيب المياه والصرف الصحي.
    5. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي من الطقم IVT للعمود.
      ملاحظة: تأكد من أن الإيثانول المضاف إلى المخزن المؤقت يغسل سابقا.
    6. الطرد المركزي في 8,000 س ز ~ 1 دقيقة أو حتى من خلال عامل تصفية. تجاهل من خلال تدفق وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 8,000 ز س ل ~ 1 دقيقة لإفراغ الخرطوشة.
    7. نقل عامل التصفية كدنا لأنبوب شطف كدنا (1.5 مل أنبوب نوكلاس خالية). تطبيق ميليلتر 8.5 من قبل حرارة المياه خالية من نوكلاس إلى المركز لعامل التصفية. انتظر 2 دقيقة والطرد المركزي في س 8,000 ز لمدة دقيقة ~1.5.
    8. الوت مرة أخرى مع 8.5 ميليلتر من قبل حرارة المياه خالية من نوكلاس والشروع فورا في IVT الجولة الأولى.
      ملاحظة: ستكون مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل كدنا استرداد وحدة التخزين ~ 16 ميليلتر.
  4. أداء فعل نسخ (IVT) في المختبر لتضخيم الحمض النووي الريبي (ارنا) الإنتاج من كدنا (الجولة الأولى).
    1. تعيين فرن الهواء التهجين إلى 37 درجة مئوية.
    2. إعداد مزيج الرئيسي ل IVT على الجليد بالترتيب التالي: 16 ميليلتر من كدنا مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل التيد من الخطوة 2.3.8، إضافة 4 ميليلتر من T7 ATP الحل (75 ملم)؛ 4 ميليلتر من T7 CTP الحل (75 ملم)؛ 4 ميليلتر غتب T7 الحل (75 ملم)؛ 4 ميليلتر من T7 UTP الحل (75 ملم)؛ 4 ميليلتر T7 10 x رد فعل المخزن المؤقت؛ وميليلتر 4 من مزيج إنزيم T7. يخلط جيدا وتدور، وعقد على الجليد.
    3. إضافة 24 ميليلتر من مزيج IVT الرئيسي لكل أنبوبة تحتوي على 16 ميليلتر من كدنا. خلط المحتويات التي بيبيتينج بلطف ودقة. احتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية ح 14.
      ملاحظة: حضانة < ح 12 يؤثر بشدة على الغلة.
    4. إضافة 60 ميليلتر من غير ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (غير ديبك) معاملة المياه خالية من رناسي لزيادة الحجم إلى 100 ميليلتر والتوقف عن رد فعل IVT.
  5. تنقية ارنا.
    ملاحظة: تتم جميع سينتريفوجيشنز في ~ 8,000 س ز في درجة حرارة الغرفة. لم تتجاوز 16,000 ز x لتجنب الأضرار بخرطوشة تصفية.
    1. بدء تشغيل التدفئة ~ 200 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي إلى 50-55 درجة مئوية لاستخدامها لاحقاً في كتلة التدفئة الجافة أو بكر آلة. لم تتجاوز 58 درجة مئوية لمنع تمسخ جزئية من ارنا.
    2. نقل ارنا إلى أنبوب 1.5 مل خالية من نوكلياسي. إضافة 350 ميليلتر ارنا ملزمة المخزن المؤقت لكل عينة ارنا. إضافة 250 ميليلتر من الإيثانول 100% لكل أنبوب ومزيج من 3 مرات بيبيتينج (دوامة لا لخلط وتدور).
    3. نقل المزيج فورا إلى العمود تنقية الحمض النووي الريبي بإضافته بلطف إلى مركز تصفية خرطوشة. الطرد المركزي في 8,000 س ز ~ 1 دقيقة أو حتى اجتاز هذا المزيج تماما من خلال عامل تصفية. تجاهل-التدفق عبر وإعادة استخدام أنبوب جمع النفايات
      ملاحظة: سيبدأ الجيش الملكي النيبالي عجل عند إضافة الإيثانول.
    4. إضافة ميليلتر 650 من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لكل خرطوشة تصفية. أجهزة الطرد المركزي ل ~ 1 دقيقة بتكلفة قدرها 8000 x ز أو حتى اجتاز المخزن المؤقت كاملة. تجاهل-التدفق عبر وتدور حات مين ~ 1 إضافية لإزالة آثار المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
    5. نقل عامل التصفية إلى أنبوب جمع ارنا طازجة. إضافة 100 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس (50-55 درجة مئوية) قبل ساخنة للمركز من عامل التصفية. انتظر لمدة 2 دقيقة، ثم الطرد المركزي لدقيقة ~1.5 بتكلفة قدرها 8000 x ز أو حتى أنه اجتاز في أنبوب جمع.

3-ثاني جولة التضخيم

  1. توليف كدنا حبلا الأولى (الجولة الثانية).
    1. ارنا نقل من خطوة 2.5.5 لأنبوب [ميكروفوج] 200 ميليلتر وفراغ يركز 100 ميليلتر الوتانت إلى 10 ميليلتر. استخدام لا الحرارة، تشغيل مركزات فراغ ل 65 دقيقة مقارنة مع 10 ميليلتر من الماء في أنبوب 200 ميليلتر لتقدير حجم مخفض.
    2. يسخن الفرن الهواء التهجين إلى 42 درجة مئوية.
    3. إضافة 2 ميليلتر من الإشعال هيكسامير عشوائية من مجموعة IVT ارنا، دوامة بإيجاز، وتدور لجمع المحتويات.
    4. احتضان [ميكروفوج] أنابيب عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في cycler حرارية، ثم ضعه على الجليد.
    5. إعداد مزيج RT الرئيسية التالية: 2 ميليلتر من 10 × الأولى المخزن المؤقت توليف حبلا، 4 ميليلتر من مزيج دنتب، 1 ميليلتر من مثبط رناسي و 1 ميليلتر من الإنزيم أرايسكريبت. المزيج جيدا في 200 ميليلتر [ميكروفوج] أنابيب بلطف فورتيكسينج، ثم تدور لجمع المحتويات ووضع على الجليد.
    6. إضافة 8 ميليلتر سيد RT مزيج (الجزء الأول) لكل [ميكروفوج] أنابيب. ضع الأنابيب في 42 درجة مئوية هواء حاضنة ح 2.
    7. أضف 1 ميليلتر من رناسيه لأن رد الفعل المذكور أعلاه. مزيج جيد من قبل بيبيتينج 2-3 مرات والتحريك 3-4 مرات، وتدور لجمع المحتويات. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على جهاز PCR. بعد الحضانة، انتقل إلى الخطوة الثانية-حبلا التوليف فورا.
  2. الطريقة الثانية لكدنا توليف (الجولة الثانية).
    1. إضافة 3 ميليلتر من التمهيدي T7-RA5 (في 25 نانوغرام/ميليلتر العامل تمييع، الجدول 2) و 2 ميليلتر من المياه خالية من رناسي لكل عينة كدنا. المزيج جيدا، وتدور لجمع المحتويات.
    2. تبني على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في cycler حرارية. ضع رد فعل على الجليد.
    3. إعداد سيد RT مزيج (الطريقة الثانية) على الجليد: 58 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس 10 ميليلتر من 10 × الثانية حبلا العازلة، 4 ميليلتر من مزيج دنتب و 2 ميليلتر من بوليميريز الحمض النووي. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج وتدور لجمع المحتويات. الحفاظ على الجليد.
    4. إضافة ميليلتر 74 من هذا المزيج أعلاه لكل أنبوبة من الخطوة 3.2.2. مزيج جيد من قبل بيبيتينج 2 – 3 مرات والتحريك 3-4 مرات، ثم تدور لجمع المحتويات. الحفاظ على الجليد باستمرار.
    5. قبل بارد cycler الحرارية إلى 16 درجة مئوية عن طريق إيقاف الحرارة الغطاء. ضع الأنابيب في cycler الحرارية ح 2 في 16 درجة مئوية.
    6. بعد الخطوة الثانية-حبلا التوليف، وضع الأنابيب على الجليد المضي قدما إلى الخطوة تنقية كدنا، أو تجميد في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يوصي بتنقية كدنا قبل التجميد.
  3. إجراء تنقية كدنا (الجولة الثانية).
    ملاحظة: تتم جميع سينتريفوجيشنز في ~ 8,000 س ز في درجة حرارة الغرفة. لم تتجاوز 16,000 ز x لتجنب الأضرار بخرطوشة تصفية.
    1. بدء تسخين المياه خالية من نوكلياسي إلى 50-55 درجة مئوية لاستخدامها لاحقاً في كتلة تدفئة جافة. لم تتجاوز 58 درجة مئوية لمنع تمسخ الجزئي لكدنا.
    2. نقل كدنا أنبوب 1.5 مل خالية من نوكلياسي. إضافة 250 ميليلتر كدنا ملزمة المخزن المؤقت لكل أنبوبة. تحقق من وجود رواسب في المخزن المؤقت والحارة الحل المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بإعادة حل. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج 2 – 3 مرات والتحريك 3-4 مرات. زيادة ونقصان لجمع المحتويات.
    3. بشدة وضع خرطوشة تصفية كدنا في أنابيب المياه والصرف الصحي. إضافة هذا المزيج أعلاه إلى المركز لعامل التصفية. الطرد المركزي في 8,000 س ز ~ 1 دقيقة أو حتى من خلال عامل تصفية. تجاهل-التدفق عبر واستبدال أنابيب المياه والصرف الصحي.
    4. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. تأكد من الإيثانول المضاف إلى المخزن المؤقت يغسل سابقا. الطرد المركزي في 8,000 س ز ~ 1 دقيقة أو حتى من خلال عامل تصفية.
    5. تجاهل في التدفق من خلال، والطرد المركزي مرة أخرى في س 8,000 ز ~ 1 دقيقة لإفراغ الخرطوشة. نقل عامل التصفية كدنا أن أنبوب شطف كدنا.
    6. تطبيق ميليلتر 8.5 من قبل حرارة المياه خالية من نوكلياسي إلى المركز لعامل التصفية. انتظر 2 دقيقة والطرد المركزي في 8,000 س ز لدقيقة ~1.5 الوتي مرة أخرى مع ميليلتر 8.5 إضافية من قبل حرارة المياه خالية من نوكلياسي.
      ملاحظة: ستكون مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل كدنا استرداد وحدة التخزين ~ 16 ميليلتر.
    7. الشروع فورا في ثاني جولة IVT أو تجميد كدنا في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. إجراء جولة ثانية من إنتاج ارنا IVT.
    1. تعيين التهجين هواء الفرن إلى 37 درجة مئوية (setpoint 36 درجة مئوية).
    2. إعداد مزيج الرئيسي ل IVT على الجليد بالترتيب التالي: 16 ميليلتر من كدنا مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل التيد من الخطوة 3.3.7، إضافة 4 ميليلتر من T7 ATP الحل (75 ملم)؛ 4 ميليلتر من T7 CTP الحل (75 ملم)؛ 4 ميليلتر غتب T7 الحل (75 ملم)؛ 4 ميليلتر من T7 UTP الحل (75 ملم)؛ 4 ميليلتر T7 10 x رد فعل المخزن المؤقت؛ وميليلتر 4 من مزيج إنزيم T7. مزيج جيد، تدور بإيجاز لجمع المحتويات، وعقد على الجليد.
    3. إضافة 24 ميليلتر من مزيج IVT الرئيسي لكل أنبوبة تحتوي على 16 ميليلتر من كدنا. خلط المحتويات التي بيبيتينج بلطف ودقة. احتضان أنبوب في 37 درجة مئوية ح 14.
      ملاحظة: حضانة < ح 12 يؤثر بشدة على الغلة.
    4. إضافة 60 ميليلتر من غير ديبك معاملة المياه خالية من رناسي لزيادة الحجم إلى 100 ميليلتر والتوقف عن رد فعل IVT.
  5. إجراء تنقية ارنا (الجولة الثانية).
    ملاحظة: تتم جميع سينتريفوجيشنز في ~ 8,000 س ز في درجة حرارة الغرفة. لم تتجاوز 16,000 ز x لتجنب الأضرار بخرطوشة تصفية.
    1. بدء تشغيل التدفئة ~ 200 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس إلى 50-55 درجة مئوية لاستخدامها لاحقاً في كتلة التدفئة الجافة أو بكر آلة. لم تتجاوز 58 درجة مئوية لمنع تمسخ جزئية ارنا.
    2. نقل ارنا إلى أنبوب خالية نوكلاس 1.5 مل. إضافة 350 ميليلتر ارنا ملزمة المخزن المؤقت لكل عينة ارنا. إضافة 250 ميليلتر ACS الصف الإيثانول 100% لكل أنبوب وخلط 3 مرات بيبيتينج (دوامة لا لخلط وتدور).
      ملاحظة: سيبدأ الجيش الملكي النيبالي عجل عند إضافة الإيثانول.
    3. نقل المزيج فورا إلى العمود تنقية الحمض النووي الريبي بإضافته بلطف إلى مركز تصفية خرطوشة. الطرد المركزي في 8,000 س ز ~ 1 دقيقة أو حتى اجتاز هذا المزيج تماما من خلال عامل تصفية. تجاهل-التدفق عبر وإعادة استخدام أنبوب جمع النفايات.
    4. إضافة ميليلتر 650 من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لكل خرطوشة تصفية. أجهزة الطرد المركزي ل ~ 1 دقيقة بتكلفة قدرها 8000 x ز أو حتى اجتاز المخزن المؤقت كاملة. تجاهل-التدفق عبر وتدور حات مين ~ 1 إضافية لإزالة آثار المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
    5. نقل عوامل التصفية إلى أنبوب جمع ارنا طازجة. إضافة 100 ميليلتر من الماء الساخن مسبقاً خالية من نوكلياسي إلى المركز لعامل التصفية. انتظر لمدة 2 دقيقة، ثم الطرد المركزي لدقيقة ~1.5 بتكلفة قدرها 8000 x ز أو حتى أنه اجتاز.
    6. ميليلتر 2 اليكووت في أنبوب لجهاز المطياف الضوئي (في الطول الموجي نانومتر 260) وبيواناليزير نشر تحليلات للتحقق من وجود ارنا الغلة والجودة.
      ملاحظة: يجب أن يكون التركيز على الأقل 5 نانوغرام/ميليلتر؛ وبخلاف ذلك، نرفض العينة. ويمكن تخزين العينة لمدة سنة ~ 1-80 درجة مئوية. تجنب تجميد تذويب العينات.
    7. فحص العينات باستخدام بيواناليزير لتصور سليم نشر المنتجات ارنا بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (الشكل 2).

4-تضخيم الحمض النووي الريبي تجزئة وتنظيف

  1. خلط ما يلي على الجليد (الحجم الإجمالي 40 ميكروليتر، أنابيب الجمع بين 2 من الرموز الشريطية عينة غير متداخلة ارنا): 36 ميليلتر من ارنا (200 نانوغرام المجموع) و 4 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي تجزئة المخزن المؤقت. احتضان المخلوط في 94 درجة مئوية ل 90 ثانية.
  2. تتحرك فورا الخليط الجليد وإضافة 4 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي تفتت توقف المخزن المؤقت. ضبط حجم الصوت إلى 100 ميليلتر بإضافة ميليلتر 56 من المياه خالية من نوكلاس.
  3. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت RLT من تنقية الحمض النووي الريبي كيت (انظر الجدول للمواد)، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج. إضافة 250 ميليلتر من EtOH ومزيج جيد من قبل بيبيتينج، ونقل النموذج إلى عمود الدوران تنقية الحمض النووي الريبي. تدور لمدة 15 ثانية في 8,000 س ز.
  4. نقل العمود إلى أنبوب جمع جديدة وإضافة 500 ميليلتر RPE المخزن المؤقت. تدور لمدة 15 ق في غ. س 8,000 تجاهل في التدفق من خلال. إضافة 500 ميليلتر من 80% EtOH وتدور لمدة 2 دقيقة في 8,000 س ز.
  5. نقل العمود إلى أنبوب جمع جديد، فتح غطاء العمود، وتدور لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة.
  6. نقل العمود إلى أنبوب جمع جديدة ومن الوت مع 16 ميليلتر المياه خالية من نوكلاس، والغزل بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.

5-إعداد المكتبة

ملاحظة: المالية ويمكن تجميع عند هذه النقطة، إذا لم يكن هناك أي تداخل في استخدام الرموز الشريطية. وقت المعاملة الفوسفاتيز 40 دقيقة بولي-النوكليوتيدات كيناز وقت العلاج ح 1.

  1. إضافة إلى 16 ميليلتر من ارنا مجزأة في أنبوب PCR 0.7 مل، 4 ميليلتر من المزيج التالي: 2 ميليلتر من 10 × الفوسفاتيز المخزن المؤقت و 1 ميليلتر من أنتاركتيكا الفوسفاتيز 1 ميليلتر من ribonuclease المؤتلف المانع (مثلاً، رناسيوت). احتضان في cycler حرارية مع البروتوكول التالي: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وعقد في 4 درجات مئوية.
  2. إضافة إلى أنبوب PCR 0.7 مل من الخطوة 5، 1، 30 ميليلتر من المزيج التالي: 17 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي و 5 ميليلتر من 10 × الفوسفاتيز المخزن المؤقت، 5 ميليلتر من ATP (10 ملم)، 1 ميليلتر من مثبط ribonuclease المؤتلف 2 ميليلتر من بنك. احتضان في cycler الحرارية في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، ثم عقد في 4 درجات مئوية.
  3. تنفيذ تنظيف عمود الفوسفاتيز وتعامل بنك ارنا.
    1. ضبط وحدة التخزين إلى 100 ميليلتر بإضافة 50 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي. إضافة 350 ميليلتر RLT المخزن المؤقت ومزيج جيد. إضافة 250 ميليلتر من EtOH ومزيج جيد من قبل بيبيتينج، ونقل النموذج إلى عمود الدوران تنقية الحمض النووي الريبي.
    2. تدور لمدة 15 ق في غ. س 8,000 نقل العمود إلى أنبوب جمع جديدة وإضافة 500 ميليلتر RPE المخزن المؤقت.
    3. تدور لمدة 15 ثانية في 8,000 س زاي تجاهل في التدفق من خلال وإضافة 500 ميليلتر من 80% EtOH.
    4. تدور لمدة 2 دقيقة في 8,000 س زاي نقل العمود إلى أنبوب جمع جديد، فتح غطاء العمود، وتدور لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة.
    5. نقل العمود إلى أنبوب جمع جديدة والوتي مع ميليلتر 14 المياه خالية من نوكلياسي، والغزل بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة لاستعادة وحدة تخزين ~ 10 ميليلتر من المواد. تجاهل العمود. تقليل الحجم إلى 5 ميليلتر استخدام مركز فراغ ~ 10 دقيقة.
  4. سد 3 ' محول استخدام تجاري كيت (انظر الجدول للمواد).
    1. تمييع 3 ' المحول (RA3) من تراسك طقم 3 طيات مع المياه خالية من نوكلاس وتخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
    2. إلى 5 ميليلتر الفوسفاتيز وتعامل بنك الحمض النووي الريبي، إضافة 1 ميليلتر من المخفف 3 ' محول. احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وثم ضع الأنبوبة فورا على الجليد لمنع تشكيل هيكل الثانوية.
    3. إضافة 4 ميليلتر من المزيج التالي: 2 ميليلتر من 5 × HM ربط المخزن المؤقت (HML)، 1 ميليلتر من رناسي المانع، و 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي T4 ليجاسى 2 (اقتطاع). احتضان الأنبوب في cycler حرارية ساخنة مسبقاً عند 28 درجة مئوية ح 1 (غير مدفأة أو أثناء فتح الغطاء).
    4. مع أنبوب رد فعل المتبقية على cycler الحرارية، إضافة 1 ميليلتر لوقف الحل (سان تومي وبرينسيبي) ولطف "الماصة؛" وحدة التخزين بأكملها صعودا وهبوطاً 6 – 8 مرات إلى مزيج دقيق. الاستمرار في احتضان الأنبوب رد فعل على cycler الحرارية عند 28 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم ضع الأنبوبة على الجليد.
    5. إضافة 3 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس الحصول على إجمالي حجم 12 6 استخدام ميليلتر ميليلتر. وتخزين ميليلتر 6 المتبقية في-80 درجة مئوية.
  5. القيام برد فعل على نسخ عكسي.
    1. الجمع بين ما يلي في أنبوب PCR: 6 ميليلتر من الحمض النووي الريبي محول متصلة و 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي RT التمهيدي (RTP). احتضان الأنبوب عند 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم وضع الأنبوب فورا على الجليد.
    2. إضافة 5.5 ميليلتر من المزيج التالي: 2 ميليلتر من 5 × أول حبلا العازلة، 0.5 ميليلتر من مزيج دنتب 12.5 ملم، 1 ميليلتر من 100 مم DTT، 1 ميليلتر من رناسي المانع، و 1 ميليلتر من المنتسخة العكسية. احتضان الأنبوب في cycler حرارية ساخنة مسبقاً عند 50 درجة مئوية ح 1، ثم ضع الأنبوبة على الجليد (يمكن الاحتفاظ بعينات في-20 درجة مئوية).
  6. أداء [بكر] تضخيم مع دورات 11-15 لإثراء 5 '3'--التمهيدي الواصلة المنتج.
    1. لكل رد فعل النسخ العكسي، أضف 35.5 ميليلتر من المزيج التالي: 8.5 ميليلتر من الماء النقي فائقة و 25 ميليلتر من مزيج PCR (الرابطة الإسلامية) 2 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي PCR التمهيدي (RP1). لكل رد فعل، إضافة 2 ميليلتر من التمهيدي PCR رنا فريد المفهرسة (ربيكس، X = 1 إلى 24).
    2. تضخيم الأنبوب في cycler الحرارية باستخدام PCR الدراجات الشروط التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 12-15 دورات 98 درجة مئوية لمدة 10 ق؛ 60 درجة مئوية في 30 ثانية؛ 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ ثم عقد في 4 درجات مئوية.

6-بكر تنظيف المنتج وحجم التحديد

  1. بريوارم حبات أمبوريكسب المغناطيسية في درجة حرارة الغرفة. دوامة الخرز حتى تكون مشتتة جيدا، ثم قم بإضافة 50 ميليلتر لتفاعل PCR 50 ميليلتر (1:1 بكر المنتج: الخرز). خلط المحتويات لعشر مرات مزيج دقيق.
  2. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 15 مكان على الوقوف مغناطيسية لمدة 5 دقائق على الأقل، حتى يظهر السائل واضحة. إزالة وتجاهل ميليلتر 95 من المادة طافية.
  3. إضافة 200 ميليلتر طازجة 80% EtOH. احتضانها لمالا يقل عن 30 ثانية، ثم إزالة وتجاهل المادة طافية دون الإخلال بالخرز. كرر هذه العملية مرة أخرى.
  4. أيردري الخرز لمدة 15 دقيقة أو حتى يجف تماما. ريسوسبيند مع ميليلتر 32.5 استثارة المخزن المؤقت. "الماصة؛" وحدة التخزين بأكملها صعودا وهبوطاً عشر مرات مزيج دقيق.
  5. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2 مكان على الوقوف مغناطيسية لمدة 5 دقائق، حتى يظهر السائل واضحة. نقل 30 ميليلتر من المادة طافية إلى أنبوب جديد. إضافة 20 ميليلتر من الماء خالية من نوكلياسي للحصول على إجمالي 50 ميليلتر.
  6. إجراء التحديد حجم منتجات PCR مع المرحلة الصلبة التثبيت عكسها (سبري) الخرز المغناطيسية.
    1. إضافة المجلد x 0.7 (35 ميليلتر) من حبات سبري إلى أنبوب أعد الخطوة 6.5 ومزيج دقيق من بيبيتينج. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. ضع الأنبوب على الوقوف مغناطيسية والانتظار لمدة 5 دقائق أو حتى الخرز منفصلة. إزالة المادة طافية بعناية دون الإخلال بالخرز.
    3. إضافة 200 ميليلتر طازجة 85% EtOH. انتظر 30 ثانية، ثم إزالة EtOH. أيردري الخرز لمدة 10 دقائق.
  7. إضافة 20 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس. ضع الأنبوب مرة أخرى على المغناطيس والانتظار لمدة 5 دقائق "الماصة؛" إيقاف الجزء السائل دون إزعاج أو لمس الخرز. تخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية.

7-تحديد مكتبة كمية ونوعية

  1. تحقق من أن تركيز الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي في الطول الموجي نانومتر 260 (المتوقع أن التركيز هو على الأقل ~ 5-10 نانوغرام/ميليلتر).
  2. تشغيل 1 ميليلتر من كل عينة على بيواناليزير استخدام رقاقة الحمض النووي حساسية عالية لدراسة حجم التوزيع (المتوقع ذروة في 300-400 شركة بريتيش بتروليوم (انظر الشكل 3)).

8-نموذج إرسال

  1. الجمع بين عدم تداخل تسلسل الرموز الشريطية بكر (نسبة 1:1). على سبيل المثال، الجمع بين منتجات PCR العينات مع RPI-1 RPI-2، RPI-3 و RPI-4 معا في نانوجرام تساوي المبالغ، وفقا للجيش الملكي النيبالي تسلسل نموذج إدخال إجمالي المبلغ شرط التوصيات الأساسية.
  2. بعد دمج، ضبط التركيز الكلي 5 نانوغرام/ميليلتر ويقل حجم 10 ميليلتر أو حسبما أوصت به لب مرفق التسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام البروتوكول، المذكورة أعلاه، جابايرجيك الخلايا العصبية كانت يدوياً فرز (الشكل 1) والحمض النووي الريبي تم تضخيمه، ثم إلى مكتبة كدنا (الشكل 2) ومتسلسلة في عمق ارتفاع8. المنتجات تضخيم الحمض النووي الريبي (ارنا) تراوحت بين 200-4,000 بي بي في حجمها، مع توزيع ذروة أعلى قليلاً من 500 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 3A). المكتبة كدنا تنقية حبة كان كذلك تقييد حجم بجولة ثانية لتنقية استخدام الخرز إزالة شظايا أصغر أقل من 200 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 3 وج 3) ومع ذروة في ~ 350 بي بي. وجود شظايا أقصر سوف تؤدي إلى فارغة ما يلي (إدراج لا مرناً، تسلسل محول والتمهيدي فقط)، بينما الشظايا أطول سوف تشغل مساحة أكبر على تدفق الخلايا، خفض مجموع قراءة الإخراج. على التسلسل، حصلنا عليها بشكل روتيني 4.8 × 105 الوسيط، أو 6.9 × 105 متوسط المعينة ما يلي في الخلية (الشكل 4 أ). بعد إزالة الحمض النووي الريبي المكررة باستخدام أوميس، كان كل خلية مفردة 1.0 x 10 الوسيط، أو 1.4 × 105 5 فريدة متوسط القراءات كل خلية (الشكل 4 باء). في كل خلية مفردة الخارجية الجيش الملكي النيبالي ضوابط كونسورتيوم (اركك)، استخدمت المصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي كرقابة داخلية التي يمكن حساب العدد المطلق للجزيئات التي يتم إضافتها إلى النموذج. وكان هناك علاقة خطية للإدخال من الملاحظ التهم الموجهة إليه، مع منحدر من 0.92 والمعدل R2 = 0.94 (الشكل 4). اكتشفنا في المتوسط الجينات ~ 10,000 كل واحد العصبية (تتراوح ~ 7,500 12,000 الجينات/الخلية)، ومع > 95% من الواحد خلايا كشف > 6,000 الجينات (الرقم 4-4F). يقارن هذا الرقم إيجابي ضد البيانات المنشورة من مماثلة الماوس المستمدة من الدماغ واحدة من الخلايا العصبية (مثلاً، 1,865-4,760 الجينات في زايسل et al. 9, 7,250 الجينات في تاسيتش et al. 10، وجينات 8,000 في أوكاتي et al. 11)-توجه القراء إلى بولين et al. 12 لمقارنة مفصلة.

Figure 1
الشكل 1 : سير العمل للفرز اليدوي للخلايا العصبية التي تليها المغنية-ما يليها وجمعت العقول الماوس الطازجة وشرائح، والمنطقة لمصلحة ميكروديسيكتيد. واحد من الخلايا العصبية معربا عن البروتينات الفلورية جمعت يدوياً وتضخم استخدام جولتين من التضخيم الخطي بالنسخ في المختبر . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 2
الشكل 2 : سير العمل التخطيطي للمغنية Seq بجولتين من التضخيم أثناء دمج معرفات فريدة الجزيئية (أوميس) أو الأصناف-العلامات- عينة من الرمز الشريطي (اتفاقية بازل) يسمح لكل خلية واحدة تحددها التعليمات البرمجية الخاصة به 9-النوكليوتيدات (أزرق مخضر). أومي هو امتداد عشوائي النيوكليوتيدات 10 bp في طول مختلف لكل التمهيدي المستخدمة. أثناء الخطوة المعلوماتية الحيوية، هما النصوص المعينة لها نفس تسلسل أومي سيتم حسابها مرة واحدة فقط، وبالتالي إزالة التكرارات التضخيم والسماح لعد نسخة المطلق. RA5 و RA3 تسلسل كبسولة تفجير، والتمهيدي T7-RA5 مطلوب لإضافة تسلسلات T7 العودة إلى المنتجات ارنا الجولة الأولى بحيث يمكن ربط بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 والقيام بجولة ثانية من التضخيم الخطي بالنسخ في المختبر . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : بيواناليزير سبيل المثال المؤامرات. توزيع حجم ارنا (A) يجب أن يكون بين 200-4,000 بي بي مع ذروة في حوالي 500 هناك المحور س، وحدة الأسفار التعسفي [فو]. (ب) حجم التوزيع لمنتجات مكتبة كدنا بعد تنظيف حبة. (ج) حجم التوزيع بعد تحديد حجم x SPRI 0.7 (الخطوة 6، 6) مع ذروة بلغت حوالي 350 شركة بريتيش بتروليوم.

Figure 4
الشكل 4 : قراءة تسلسل المثال توزيعات والكشف عن الجينات من الخلايا العصبية التي تم فرزها يدوياً بعد Seq المغنية8 . المجموع (أ) تعيين قراءة التوزيع. (ب) مجموعة فريدة من نوعها يقرأ التوزيع. (ج) اركك ما يلي: إظهار علاقة خطية ما يزيد على 4 من حيث الحجم. اكتشاف الجينات (د) مقابل قراءة التهم الموجهة إليه ويبين أن > قد الخلايا المفردة 95% > 6000 الجينات/خلية. الكشف عن الجينات (ه) بين 6 أنواع إينتيرنيورون قابلة للمقارنة. (و) توزيع الجينات الكشف عن كل خلية، توقعات البيئة العالمية الانضمام #GSE92522. وهذا الرقم قد تم تكييفه من بول et al. 8- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المخزن المؤقت البند تركيز المبلغ (ميليلتر)
المخزن المؤقت لجمع العينة مثبط ريبونوكليسي المؤتلف 55
اركك 1:50K المخفف 110
نوكلاس المياه مجاناً 605
الكوة ميليلتر 43.75 من أعلاه إلى أنابيب 16 (شرائط 2 من أنابيب PCR ميليلتر 8؛ 200)؛ إضافة بعد كل أنبوب
T7-أومي-الإشعال (مثل N10B1-N10B16) 1 نانوغرام/ميليلتر ميليلتر/أنبوب 6.25
الحجم النهائي في كل أنبوب 50 ميليلتر (كل أنبوبة يمكن تقسيم في 25 ميليلتر مختبرين والمجمدة في-80 درجة مئوية)
الحلول: البند تركيز المبلغ
قام: جعل 5 ل حل كلوريد الصوديوم 126 ملم ز 36.8
بوكل 3 مم ز 1.15
نة2بو4 1.25 مم ز 0.75
NaHCO3 20 مم ز 8.4
إلى 500 مل قام، فقاعة الأكسجين لمدة 10-15 دقيقة ثم إضافة بعد جديد في كل مرة:
د-الجلوكوز 20 مم ز 1.8
مجسو4 2 مم 0.5 مل من مخزون م 4
كاكل2 2 مم 0.5 مل من مخزون م 4
الحفاظ على تهوية قام بها من خلال
الحلول: البند تركيز
النشاط مانع كوكتيل: جعل أسهم 100 x
إضافة إلى 100 مل قام
APV 0.05 مم
كنقكس 0.02 مم
ت 0.0001 مم (0.1 ميكرون)
الحلول: البند المبلغ
سولتيون البروتياز (100 مل) حوزتي من غريس متسلسلة 100 ملغ
الجنين المصل البقري: مصدر التجارية، الكوة في 500 ميليلتر لكل استخدام.

الجدول 1: قائمة بالحلول والمخازن المؤقتة.

الجدول 2: قائمة أجهزة الإشعال وتسلسلات. N10B1-N10B96 هي أول حبلا الإشعال و T7-RA5 التمهيدي الجولة الثانية. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دليل الفرز البروتوكول مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي تحت إشراف العصبية المسمى في الدماغ الفئران السكان التي أما أن تكون قليلة أو التي تمثل سكان خلية نادرة أن خلاف ذلك ليس عمليا لدراسة استخدام الخلية الفائق الحالية أساليب الفرز والتضخيم. الخلايا التي تخضع لنظام مراقبة الأصول الميدانية عادة الخضوع للضغوط خط غمد وعينه في نطاق المبادرة ~ 9 – 14، تبعاً لحجم الفوهة والمطلوب معدلات الحدث. وبالإضافة إلى ذلك، عند يتم قذف من الفوهة، الخلايا يمكن جد على الأرض سطح أنبوب جمع أو آبار مغطاة بطبقة عازلة عينة تسبب الإجهاد أثر. أثناء الفرز اليدوي، تطبق ابدأ مثل هذه الضغوط العالية، السقوط الماصة بعمل شعري الخلايا وطرد تهب بلطف بها وكسر ببساطة نصائح الماصات الزجاجية. البروتوكول Seq المغنية مفيد لتضخيم الحمض النووي الريبي من الخلايا التي تحتوي على وحدات تخزين الخلوية الصغيرة (< ميليلتر 8) ومنخفضة ابتداء من المواد واستمرار غلة أعدادا كبيرة من الجينات يمكن كشفها (8 – 10 ك)، الذي، عندما يقترن مع تسلسل العميق، يسمح المفصلة عمليات إعادة بناء صورة جزيئية متماسكة للوظائف الخلوية الكامنة وراء الخلية هوية8،،من1314. بسبب نقاء خطوات جمع خلية وحساسية عالية للكشف عن الجينات، والقدرة على أداء التهم جزيء المطلق، أن هذا الأسلوب مفيد لدراسة الدول الخلوية والفيزيولوجيا المرضية المرض مع ارتفاع العمق والدقة.

بينما العائد من تضخيم الحمض النووي الريبي ودرجة الكشف عن الجينات مرتفع نسبيا في هذا البروتوكول، تساعد بعض التدابير الإجرائية الحفاظ على الاتساق. خلال التوليف الثانية-ستراند، الجمعية العامة يجب أن يتم على الجليد و cycler الحرارية يجب أن يبرد قبل قبل نقلها إلى الوحدة، ويجب أن يتم رد فعل صارما في 16 درجة مئوية (أو أقل قليلاً) لتجنب تشكيل دبابيس الشعر التي قد تقلل من الغلة ارنا. ينصح أيضا لا أن تتجاوز ح 2 في 16 درجة مئوية خلال التوليف الثانية-ستراند، ومن المهم للانتقال إلى الخطوة تنقية كدنا في أقرب وقت ممكن. خلال الخطوات IVT، قد تقلل الحضانة لأقل من 12 ح ارنا الغلة، بينما يتجاوز 14 ساعة وقت IVT قد تسفر عن بعض التدهور ارنا.

ونحن لم يقم دراسة مقارنة مع نفس العينة الإدخال من القمامة-الأصحاب تخضع لنظام مراقبة الأصول الميدانية والفرز اليدوي باستخدام المغنية-Seq؛ ومن ثم فإننا لا ندعي أن أي فئة خاصة الجينات هو ميسريجولاتيد في نظام مراقبة الأصول الميدانية وليس في الفرز اليدوي. نظام مراقبة الأصول الميدانية والفرز اليدوي سيعرض يرجح أن درجة ما من التحف التعبير الجيني. لحالات التعبير الجيني التفاضلي، أي تأثير مثل هذه ينبغي نظرياً إلغاء بعضها البعض، كما أنها سوف يتجلى في مجموعات كل من عنصر التحكم وعينه. في الآونة الأخيرة، استخدمت مزيج من النسخ مثبطات منع تنشيط التعبير الجيني المبكر الفوري، ويمكن أيضا إدراج مثل هذه الخطوات لهذا البروتوكول15.

عملية الفرز والدليل لطيف وأسرع (عادة ما تكون دقيقة 90 – 160) مقارنة بنظام مراقبة الأصول الميدانية (باستثناء أوقات إعداد عينة) التي تتطلب كثافة التدرج الطرد المركزي، تلطيخ مع بقاء، الأصباغ سيتوتراكير، وبعد فرز التصور. الفرز اليدوي لا تخضع الخلايا للإجهاد غمد عالية الضغط والتأثير على الفرز على الآبار. كما أنه يتيح الوصول قرب ثابت قام اﻷوكسيجين وعموما يوفر بيئة فرز مضياف وأقل إرهاقاً، التي قد تكون حاسمة بالنسبة للخلايا التي تكون حساسة للتأكيد مثل خلايا التشويك بسرعة مع مطالب الأيض عالية. في المغنية Seq حاليا، تصل إلى 96 من الخلايا يمكن أن يكون متعدد كاشف تكاليف حفظ وتوفير المطلق مرناً عد تهم الجينات عالية بكل خلية.

ومع ذلك، هناك عيوب إلى هذا الأسلوب؛ على سبيل المثال، المسمى دليل فرز احتياجات موثوقة فلوريسسينتلي الخلايا كعدد سكان انطلاق. وهي أصلاً عملية منخفضة الإنتاجية، مع كل دورة الفرز الغلة 32 – 64 الخلايا إلى الحد الأقصى، وأقل كثيرا في نظام مراقبة الأصول الميدانية. الفرز اليدوي يتطلب أيضا المهارات الحركية الدقيقة وبعض الممارسات للتعامل مع الزجاج الماصات تحت مجهر تشريح والتقاط الخلايا المفردة في الماصات ميكروكابيلاري. التضخيم Seq المغنية 3 '--متحيزة؛ ومن ثم فإنه لا يمكن استخدامها لتضخيم الترنسكربيتوم كله وهو أيضا غير مناسب للكشف عن isoform الوصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أنه لا يوجد أي تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (5R01MH094705-04 و R01MH109665-01 إلى Z.J.H.)، كشل روبرتسون علم الأعصاب الصندوق (Z.J.H.)، ونارساد شواغر زمالة (أ فب).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ERCC RNA Spike-In Control Mixes Thermo Fisher Cat# 4456740
SuperScript III Thermo Fisher Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer New England Biolabs Cat# E6105S
RNA MinElute kit Qiagen Cat# 74204
Antarctic phosphatase New England Biolabs Cat# M0289
Poly nucleotide kinase New England Biolabs Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated New England Biolabs Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads Beckman Coulter Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads Thermo Fisher Cat# B23317
DL-AP5 Tocris Cat# 0105
CNQX Tocris Cat# 1045
TTX Tocris Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich Cat# P5147
Message Amp II kit Thermo Fisher Cat# AM1751
Carbogen Airgas Cat# UN3156
Sylgard 184 Sigma-Aldrich Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit Illumina Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip Agilent Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip Agilent Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100 Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F). Leica Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. Warner instruments Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller Sutter Instruments Co P-97
Vibratome Thermo Microm HM 650V
Vibratome tissue cooling unit Thermo Microm CU 65

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  3. Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
  4. Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
  5. Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
  6. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  7. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  8. Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
  9. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
  10. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
  11. Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
  12. Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
  13. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  15. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).

Tags

علم الأعصاب، العدد 140، دليل الفرز، العصبية، التسلسل، Seq المغنية، والنسخ في المختبر ، والتضخيم الخطي، المعرف الفريد الجزيئية (أومي) الجيش الملكي النيبالي خلية واحدة
تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي الماوس باستخدام الفرز اليدوي وضعف <em>في المختبر</em> النسخ تهم المطلق بالتسلسل (DIVA-Seq)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paul, A., Huang, Z. J. Single-cell… More

Paul, A., Huang, Z. J. Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq). J. Vis. Exp. (140), e58690, doi:10.3791/58690 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter