Summary
本协议描述了将单个荧光标记神经元与体外转录的 mRNA 扩增分离以进行高深度单细胞 RNA 测序的人工分拣程序。
Abstract
单细胞 rna 测序 (rna 序列) 现在是一个广泛实施的工具, 用于测定基因表达。商业上可用的单细胞 RNA 测序平台不加区别地处理所有输入单元。有时, 在上游使用荧光活化细胞分类 (流化) 来隔离特定标记的感兴趣种群。流化的局限性是需要大量的输入细胞具有显著标记的分数, 这是不切实际的收集和分析稀有或稀疏标记的神经元种群从小鼠大脑。在这里, 我们描述了一种手动收集稀疏荧光标记单个神经元从新鲜分离的小鼠脑组织的方法。此过程允许捕获具有高纯度的单标记神经元, 并随后与体外转录放大协议相结合, 以保留内源转录比。我们描述了一种双线性放大方法, 它使用唯一的分子标识符 (医药学) 来生成单个 mRNA 计数。两轮的扩增会导致每个单细胞的基因检测高度。
Introduction
单细胞 rna 测序 (rna 序列) 改变了转录组研究。虽然可以使用各种技术 (如水滴1、2、微流体3、nanogrids4和 microwells5) 执行大型单细胞 RNAseq, 但大多数方法无法对定义的像元类型进行排序表达基因编码的荧光基团为了隔离选择的细胞种群, 荧光活化细胞分类 (流式) 通常用于在单细胞模式下对标记的细胞进行排序。然而, 流流仪有一些限制, 需要细致的样品处理步骤。首先, 通常需要大量的输入单元格 (通常每毫升有数个百万细胞), 其中包含标记种群的显著分数 (> 15–20%)。其次, 细胞制剂可能需要多轮的密度梯度离心步骤, 以除去可能堵塞喷嘴或流动细胞的胶质碎片、碎屑和细胞团簇。第三, 流式细胞仪通常采用染色和脱色步骤进行活/死染色 (例如4′-、6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI)、丙啶碘化物 (PI) 和 Cytotracker 染料), 这会占用更多时间。第四, 作为双色排序的经验法则 (如 DAPI 和绿/红荧光蛋白 (GFP/RFP)), 通常需要两个样本和一个控制, 要求除了所需的鼠标应变之外, 还需要处理未标记的样本。第五, 过滤通常在样品排序之前和期间多次执行, 以主动防止流式机中的采样线堵塞。第六, 必须在最常用的流式处理装置中分配时间, 以初始化和稳定流体流动并执行液滴校准。第七, 控制样本通常在实际样本采集之前按顺序运行, 以设置补偿矩阵、双峰抑制、设置门等.用户可以提前执行步骤六和七, 或者要求技术人员并行协助。最后, 后流后, 经常有步骤, 以确保只有标记的单个单元格中存在每个井;例如, 通过在高内容筛选设置 (如快速平板成像仪) 中检查样本。
为了规避上述步骤, 并促进相对快速、有针对性的单荧光标记神经元的小种群序列, 我们描述了一个手动分拣程序, 后跟两轮高度敏感的体外扩增协议, 称为双体外转录与绝对计数排序 (天后-Seq)。RNA 扩增和 cDNA 文库的生成是从 Eberwine等。6和 Hashimshony等。7、有一定的修改, 适合小鼠中间神经元的蜂窝体积较小;此外, 我们还发现, 它对兴奋性锥体神经元同样有用。
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Protocol
所有的程序, 包括动物科目已经批准了 IACUC 在寒冷的春天海港实验室, 纽约州 (IACUC #16 13-09-8)。
1. 荧光标记的小鼠神经元的手动排序
- 拉玻璃显微操作针 (见材料表) 到10–15µm 出口直径使用毛细管拉拔器与以下设置: 热: 508, 拉: 空白, 上: 空白, 时间: 空白。
- 使用合适的油管接头将 120–150 cm 柔性硅胶管 (直径约0.8 毫米) 添加到0.2 µm 聚偏二氟化 (PVDF) 膜注射器过滤器和双向油管阀上。
- 准备500毫升的冷冻 (4 摄氏度) 人工脑脊液 (学联,表 1) 和氧化通过冒泡5% 二氧化碳平衡氧通过 airstone 15 分钟或直到解决方案完全清除。
- 准备100毫升的学联与鸡尾酒的活动阻滞剂在一个150毫升烧杯 (表 1)。
- 准备100毫升的学联与1毫克/毫升链球菌分数 IV 蛋白酶在一个150毫升烧杯 (表 1)。
- 准备100毫升的学联与1% 胎牛血清 (FBS) 溶液在150毫升烧杯和氧化与5% 二氧化碳平衡氧通过 airstone。
- 用小剪刀打开颅骨, 用细钳子提取新鲜的大脑, 而不损害皮质, 解剖大脑, 从安乐死的老鼠。
注意: 任何应变, 年龄和性别的小鼠可以根据需要使用。不要冻结大脑或对注射病毒或其他危险/传染性药物的小鼠进行手动分拣。 - 保持大脑在冷冻和含氧学联, 留下一个 airstone 连接到5% 二氧化碳平衡氧在整个切片期间。
- 将大脑定位在 vibratome 恰克上, 并以300µm 厚度切割冠状或矢状节。收集尽可能多的部分, 以获得最小的 ~ 10–50标记细胞多达数个百细胞。将切片放在棉网状片架上, 放置在烧杯内, 使其沐浴在含氧学联中。
- 将新鲜切片移入包含学联的烧杯中, 并在室温下15–20最小。使用 airstone 保持冒泡氧气。
- 将切片移到含有学联的烧杯中, 在室温下进行轻度消化: P4-14 动物20–30分钟或 P28-56 动物最多45–60分钟。保持气泡的氧气。
- 将切片移回含有学联的烧杯中, 用活性阻滞剂溶液将学联与蛋白酶一起洗涤, 室温下 5–10 min。保持气泡的氧气。
- 在室温下将单个截面移动到含有学联的 100 mm 培养皿中, 1% FBS。在荧光解剖范围内, 切割区域和感兴趣的层至少有10–50细胞 (最多数百)。用一对细钳或将 22–28 G 注射针附着在木架 (串) 上进行显微切割。
- 使用巴斯德移液器, 将显微切割片移动到含有约 0.8 ml 1% FBS 的2毫升微量离心管中学联溶液中。
- 在室温下颠倒微量离心管中的解剖组织。通过在明火上滚动, 使三个长茎的巴斯德移液器减少出口直径。每个移液器执行 ~ 10 冲程, 从最大和最小的末端开始。
- 将分离的细胞分配到含有氧化学联的 100 mm 培养皿中 (培养皿可以用5毫米1% 琼脂或透明硅胶化合物在1:10 的比例下进行薄涂层)。保持室温。
- 等待约5-7 分钟细胞逐渐沉降, 然后在解剖显微镜下观察 GFP/RFP 信号。
注: 在明亮场 (BF) 中, 单个细胞、碎屑和小团块将可见。 - 使用毛细管移液器 (从步骤 1.1) 连接到柔性硅胶管 (0.4–0.8 mm 内径) 并将细胞分配到含有新鲜氧学联的 100 mm 培养皿中, 一次拾取 10–15 GFP/RFP 细胞。
- 通过用舌头堵住油管阀的末端, 将毛细管靠近感兴趣的细胞。在释放块时使用毛细管动作捕获细胞, 并快速阻断, 防止过量液体进入移液器。在解剖显微镜的荧光光学下观察毛细管尖端, 在100毫米培养皿上用新鲜的含氧学联将细胞分配给它。目的收集 ~ 100–150细胞总数。
- 重复步骤1.19 一次或两次更多 (取决于碎片), 并将总的 ~ 50–75细胞转移到一个新的100毫米培养皿, 确保在明亮场差动干涉对比 (DIC) 光学中, 碎屑等污染物极小。
- 最后, 每次使用新鲜的 microcapillary 移液器, 选择一个细胞在不超过0.5 µL 体积, 并将其驱逐成一个0.2 毫升微量离心管 (或一条八0.2 毫升微量离心管) 包含1µL 样品收集缓冲区与引物N10B1-N10B96 (表 2)。断开微量离心管中的移液器尖端, 以确保电池留在收集缓冲器中。丢弃移液器。
- 通过将管子放在干冰上并将它们长期储存在-80 摄氏度的冷冻室中, 直到它们准备好进行 RNA 扩增处理时, 冷冻细胞。
2. 第一轮 RNA 扩增
注: 以下步骤为单条带八0.2 毫升微量离心管。根据需要缩放反应。
- 合成 cDNA 的第一个链 (第一轮)。
- 热条从步骤1.22 在70˚C 5 分钟后4˚C 5 分钟;重复两次。
- 组装在冰反转录酶 (RT) 主混合物/第一链合成主混合物使用以下成分 (见材料表): 10x 第一股缓冲液 (2 µL), dNTP 混合物 (4 µL), 核糖核酸酶抑制剂 (1 µL) 和酵素 (1 µL)。
- 在台式离心机上简单地离心带钢, 收集底部的所有物品。保持沉默。
- 添加1µL 的 RT 主混合物/第一链合成主混合物到上述管 (总体积1µL 样品缓冲液从细胞收集 + 1 µL RT = 2 µL/管)。通过移液混合良好。简单的旋转收集整个内容在底部, 并保持它在冰上。
- 在空气烘箱中孵育上述管/s 在42摄氏度2小时。立即将管子放在冰上以终止反应并进行第二链合成步骤。
- 合成 cDNA 的第二个链 (第一轮)。
- 在1.5 毫升管中按以下顺序使第二股主混料 (80 µL) 在冰上: 无核酸酶 (63 µL)、10x 秒链缓冲液 (10 µL)、dNTP 混合 (4 µL)、DNA 聚合体 (2 µL) 和 RNaseH (1 µL)。通过涡旋混合配料, 然后旋转收集在底部, 并保持在冰上。
- 启动热循环仪, 运行以下程序, 预冷却装置, 准备开始步骤 2.2.3 (盖子热 = 关; 16 °c 2 小时, 4 °c 保持), 并暂停16摄氏度。
- 添加80µL/条 (或10µL/管) 的第二股主混合到每管的条和保持在冰上。将带钢转移到热循环仪上, 并恢复上面启动的16摄氏度步骤。在16摄氏度孵育2小时的带钢。
- 在第二链合成步骤后, 将管放在冰上进行下一个 cDNA 纯化步骤。
- 纯化双链 cDNA (第一轮)。
注: 所有 centrifugations 在室温下以约 8000 x g 的温度执行。切勿超过 1.6万 x g 以避免损坏滤芯。- 开始加热100µL 无核酸酶的水到50–55°c 以后使用在干燥加热块。切勿超过58摄氏度, 以防止 cDNA 的部分变性。
- 将250µL cDNA 结合缓冲液添加到1.5 毫升管中。检查缓冲液中的沉淀, 然后将缓冲液加热至37摄氏度, 10 分钟后再溶解沉淀。
- 将 cDNAs 从单个8管带状传输到 cDNA 结合缓冲液。将此步骤中的单元格合并为进一步的下游过程 (1 管中的8细胞)。通过移液彻底混合2-3 次, 然后滑动3-4 次。旋转以收集底部的内容。
- 将 cDNA 滤筒装入洗涤管 (从体外转录 (IVT) 试剂盒) 牢固。将上述混合添加到筛选器的中心。在 8000 x g 处离心1分钟或直到它通过过滤器。丢弃流过并更换清洗管。
- 将500µL 的洗涤缓冲器从 IVT 套件添加到列中。
注: 确保以前已将乙醇添加到洗涤缓冲液中。 - 在 8000 x g 处离心1分钟或直到它通过过滤器。在 8000 x g 处丢弃流量, 再离心1分钟以清空墨盒。
- 将 cdna 过滤器转移到 cdna 洗脱管 (1.5 毫升无核酸酶管)。将8.5 µL 预加热的无核酸酶水应用到过滤器的中心。等待2分钟, 离心 8000 x g, 约1.5 分钟。
- 洗脱再次与8.5 µL 预加热的无核酸酶的水, 并立即进行第一轮 IVT。
注: 双链 cDNA 恢复量将为16µL。
- 执行体外转录 (IVT) 反应放大 RNA (aRNA) 生产从 cDNA (第一轮)。
- 将杂交空气烘箱设置为37摄氏度。
- 按照以下顺序准备在冰上的 IVT 的主混合物: 从步骤2.3.8 的洗脱双链 cDNA 的16µL, 添加4µL T7 ATP 溶液 (75 毫米);4µL T7 CTP 解决方案 (75 mM);4µL T7 GTP 溶液 (75 mM);4µL T7 UTP 溶液 (75 mM);4µL T7 10x 反应缓冲液;和4µL 的 T7 酶混合物。混合好, 旋转, 并保持在冰上。
- 添加24µL 的 IVT 主混合物到每个管包含16µL 的 cDNA。通过轻轻和彻底地移液混合内容。孵育管在37摄氏度14小时。
注: 孵育 < 12 小时严重影响产量。 - 加入60µL 非二乙基酯 (非 DEPC) 处理无核糖核酸酶的水, 将体积增加到100µL, 停止 IVT 反应。
- 净化 aRNA。
注: 所有 centrifugations 在室温下以约 8000 x g 的温度执行。切勿超过 1.6万 x g 以避免损坏滤芯。- 开始加热 ~ 200 µL 不含核酸酶的水到50–55摄氏度, 以便以后在干燥加热块或 PCR 机中使用。切勿超过58摄氏度, 以防止 aRNA 的部分变性。
- 将 aRNA 转移到1.5 毫升无核酸酶管。向每个 aRNA 示例中添加350µL 的 aRNA 绑定缓冲区。每管加250µL 100% 乙醇, 通过移液混合3次 (不要涡旋混合和旋转)。
- 通过将混合物轻轻地添加到滤筒的中心, 将混合液立即转移到 RNA 纯化柱上。离心机在 8000 x g, 约1分钟, 或直到混合物完全通过过滤器。弃用回收管
注: 添加乙醇后, RNA 会开始沉淀。 - 将650µL 的洗涤缓冲液添加到每个过滤器盒中。离心约1分钟, 在 8000 x g 或直到整个缓冲区已通过。丢弃流过的过滤器, 再旋转1分钟以移除洗涤缓冲液的痕迹。
- 将过滤器转移到新鲜的 aRNA 收集管。将100µL 预加热 (50-55 摄氏度) 无核酸酶的水添加到过滤器的中心。等待2分钟, 然后离心1.5 分钟, 在 8000 x g 或直到它已经通过到收集管。
3. 第二轮放大
- 合成第一链 cDNA (第二轮)。
- 将 aRNA 从步骤2.5.5 转移到200µL 微量离心管和真空集中100µL elutant 至10µL. 使用无热量, 运行真空浓缩器65分钟. 与10µL 管中的水µL 进行比较, 以估计减少的体积。
- 将杂交空气烘箱预热至42摄氏度。
- 添加2µL 随机赫克萨默引物从 IVT 试剂盒到 aRNA, 漩涡短暂, 和旋转收集内容。
- 在热循环仪中孵育70摄氏度的微量离心管10分钟, 然后将其放在冰上。
- 准备以下 RT 主混合物: 2 µL 的10x 第一链合成缓冲液, 4 µL 的 dNTP 混合, 1 µL 的 rna 抑制剂, 和1µL 的 ArrayScript 酶。在200µL 微量离心管中混合好, 轻轻涡旋, 然后旋转收集的内容和地方在冰上。
- 将 RT 主混音 (第一股) 的8µL 添加到每个微量离心管中。将管子放在42摄氏度空气培养箱中, 2 小时。
- 在上述反应中加入1µL 的 RNaseH。通过移液搅拌2-3 次, 然后滑动3-4 次, 然后旋转收集内容。在 PCR 机上孵育37摄氏度30分钟。孵育后, 立即进行二股合成步骤。
- 合成第二个 cDNA 链 (第二轮)。
- 添加3µL T7-RA5 底漆 (在 25 ng/µL 工作稀释,表 2) 和2µL 的无核糖核酸酶的水到每个 cDNA 样本。混合好, 旋转收集的内容。
- 在热循环仪中孵育70摄氏度10分钟。把反应放在冰上。
- 准备在冰上的 RT 主混合物 (第二链):58 µL 无核酸酶的水, 10 µL 的10x 第二链缓冲液, 4 µL 的 dNTP 混合, 和2µL 的 DNA 聚合体。混合涡旋和旋转收集的内容。保持沉默。
- 将上述混合物的74µL 添加到步骤3.2.2 的每个管中。通过移液次数和弹3-4 次混合, 然后旋转收集内容。保持沉默。
- 通过关闭盖子热量, 将热循环仪预冷却至16摄氏度。将管子放在热循环仪中, 2 小时16摄氏度。
- 在第二股合成步骤后, 将管放在冰上进行 cDNA 纯化步骤, 或冻结在-20 摄氏度。
注意: 在冷冻前建议使用 cDNA 纯化。
- 进行 cDNA 纯化 (第二轮)。
注: 所有 centrifugations 在室温下以约 8000 x g 的温度执行。切勿超过 1.6万 x g 以避免损坏滤芯。- 开始加热无核酸酶的水到50–55°c, 以便以后在干燥加热块中使用。切勿超过58摄氏度, 以防止 cDNA 的部分变性。
- 将 cDNA 转化为1.5 毫升无核酸酶管。将250µL cDNA 结合缓冲液添加到每个管中。检查缓冲器中的沉淀, 将缓冲液加热至37摄氏度, 10 分钟后再溶解。通过移液次数和滑动3-4 次彻底混合。旋转以收集内容。
- 将 cDNA 滤筒牢牢地放在洗涤管中。将上述混合添加到筛选器的中心。在 8000 x g 处离心1分钟或直到它通过过滤器。丢弃流过并更换清洗管。
- 添加500µL 的洗涤缓冲液。确保先前已将乙醇添加到洗涤缓冲液中。在 8000 x g 处离心1分钟或直到它通过过滤器。
- 丢弃流过, 并再次离心在 8000 x g 的约1分钟, 清空墨盒。将 cdna 过滤器转移到 cdna 洗脱管中。
- 将8.5 µL 预加热的无核酸酶水应用到过滤器的中心。等待2分钟, 在 8000 x g 离心1.5 分钟洗脱再次与额外8.5 µL 预加热无核酸酶的水。
注: 双链 cDNA 恢复量将为16µL。 - 立即进行第二轮 IVT 或冻结 cDNA 在-20 摄氏度过夜。
- 通过 IVT 执行第二轮 aRNA 生产。
- 将杂交空气烘箱设置为37摄氏度 (36 摄氏度设定值)。
- 按照以下顺序准备在冰上的 IVT 的主混合物: 从步骤3.3.7 的洗脱双链 cDNA 的16µL, 添加4µL T7 ATP 溶液 (75 毫米);4µL T7 CTP 解决方案 (75 mM);4µL T7 GTP 溶液 (75 mM);4µL T7 UTP 溶液 (75 mM);4µL T7 10x 反应缓冲液;和4µL 的 T7 酶混合物。混合好, 简单地旋转收集的内容, 并保持在冰上。
- 添加24µL 的 IVT 主混合物到每个管包含16µL 的 cDNA。通过轻轻和彻底地移液混合内容。孵育管在37摄氏度14小时。
注: 孵育 < 12 小时严重影响产量。 - 添加60µL 非 DEPC 处理无 rna 的水, 将体积增加到100µL, 停止 IVT 反应。
- 执行 aRNA 纯化 (第二轮)。
注: 所有 centrifugations 在室温下以约 8000 x g 的温度执行。切勿超过 1.6万 x g 以避免损坏滤芯。- 开始加热 ~ 200 µL 不含核酸酶的水到50–55摄氏度, 以便以后在干燥加热块或 PCR 机中使用。切勿超过58摄氏度, 以防止 aRNA 的部分变性。
- 将 aRNA 转移到1.5 毫升无核酸酶管。向每个 aRNA 示例中添加350µL 的 aRNA 绑定缓冲区。添加250µL 100% 的 ACS 级乙醇到每个管和混合3次通过移液 (不涡旋混合和旋转)。
注: 添加乙醇后, RNA 会开始沉淀。 - 通过将混合物轻轻地添加到滤筒的中心, 将混合液立即转移到 RNA 纯化柱上。离心机在 8000 x g, 约1分钟, 或直到混合物完全通过过滤器。弃用回收管。
- 将650µL 的洗涤缓冲液添加到每个过滤器盒中。离心约1分钟, 在 8000 x g 或直到整个缓冲区已通过。丢弃流过的过滤器, 再旋转1分钟以移除洗涤缓冲液的痕迹。
- 将过滤器转移到新鲜的 aRNA 收集管。将100µL 预加热无核酸酶的水添加到过滤器的中心。等待2分钟, 然后离心1.5 分钟, 在 8000 x g 或直到它已经通过。
- 等分2µL 在分光光度计 (260 nm 波长) 和 bioanalyzer 扩散分析的管, 以检查 aRNA 的产量和质量。
注: 浓度必须至少为 5 ng/µL;否则, 拒绝该示例。样品可在-80 摄氏度下储存约1年。避免冻融样品。 - 使用 bioanalyzer 检查样品, 以可视化制造商协议后 aRNA 产品的正确传播 (图 2)。
4. 放大 RNA 碎片和清除
- 将以下内容混合在冰上 (总体积40µL, 结合2管 aRNA 非重叠样条代码):36 µL aRNA (200 ng 总) 和4µL RNA 碎片缓冲液。在九十年代将混合物孵育94摄氏度。
- 立即将混合物移至冰上, 并添加4µL RNA 碎片停止缓冲液。通过添加56µL 无核酸酶的水, 调节体积至100µL。
- 从 RNA 纯化试剂盒中添加350µL 的 RLT 缓冲液 (见材料表), 并通过移液混合良好。添加250µL 的乙醇, 通过移液混合好, 并将样品转移到 RNA 纯化离心柱。旋转十五年代在 8000 x g。
- 将列转移到新的收集管, 并添加500µL 的 RPE 缓冲区。旋转十五年代在 8000 x g. 丢弃流过。添加500µL 80% 乙醇和旋转2分钟在 8000 x g。
- 将列转移到新的收集管, 打开柱盖, 并在全速旋转5分钟。
- 将列转移到一个新的收集管, 并洗脱与16µL 无核酸酶的水, 全速旋转1分钟。
5. 图书馆准备工作
注意: 如果使用的条形码中没有重叠, 人权可以在此时汇集。磷酸酶治疗时间为40分钟, 聚核苷酸激酶治疗时间为1小时。
- 在0.7 毫升 PCR 管中的16µL 碎片 aRNA, 添加4µL 以下混合物: 2 µL 10x 磷酸酶缓冲液, 1 µL 的南极磷酸酶, 和1µL 的重组核糖核酸酶抑制剂 (例如, RNaseOUT)。使用以下协议在热循环仪中孵育:37 摄氏度, 30 分钟, 65 摄氏度, 5 分钟, 保持在4摄氏度。
- 从步骤5.1 的0.7 毫升 PCR 管, 添加30µL 以下混合物:17 µL 无核酸酶的水, 5 µL 10x 磷酸酯缓冲液, 5 µL ATP (10 毫米), 1 µL 的重组核糖核酸酶抑制剂, 2 µL PNK。在37摄氏度的热循环仪中孵育60分钟, 然后保持在4摄氏度。
- 执行磷酸酶和 PNK 处理 aRNA 的列清除。
- 通过添加50µL 无核酸酶的水, 调节容积至100µL。添加350µL 的 RLT 缓冲液, 混合均匀。添加250µL 的乙醇, 通过移液混合好, 并将样品转移到 RNA 纯化离心柱。
- 旋转十五年代在 8000 x g. 将列转移到新的收集管并添加500µL 的 RPE 缓冲区。
- 旋转十五年代在 8000 x g. 丢弃流过, 并添加500µL 80% 乙醇。
- 旋转2分钟, 8000 x g. 将列转移到新的收集管, 打开柱盖, 并在全速旋转5分钟。
- 将列转移到一个新的收集管和洗脱与14µL 无核酸酶的水, 全速旋转1分钟, 以恢复一个 ~ 10 µL 体积的材料。放弃该列。使用真空浓缩器将体积减少到5µL, 约为10分钟。
- 使用商用套件结扎 3 ' 适配器 (参见材料表)。
- 稀释 3 ' 适配器 (RA3) 从 TrueSeq 套件3折叠与无核酸酶的水和存储等份在-20 摄氏度。
- 5µL 磷酸酶和 PNK 处理 RNA, 添加1µL 稀释的 3 ' 适配器。在70摄氏度孵育2分钟, 然后立即将管子放在冰上防止二次结构形成。
- 添加4µL 以下混合物: 2 µL 的 5x HM 结扎缓冲液 (HML), 1 µL 的核糖核酸酶抑制剂, 1 µL T4 RNA 连接酶 2 (截断)。在预加热的热循环仪上孵育28摄氏度的管子, 1 小时 (不加热或盖子打开)。
- 通过在热循环仪上剩余的反应管, 添加1µL 的停止溶液 (STP), 并轻轻地将整个体积向上和向下移液6–8倍混合。继续在28摄氏度的热循环仪上孵育反应管15分钟, 然后将管子放在冰上。
- 添加3µL 无核酸酶的水, 以获得总体积12µL. 使用6µL 并将剩余的6µL 存储在-80 摄氏度。
- 执行反转转录反应。
- 在 PCR 管中组合以下内容: 6 µL 适配器结扎 rna 和1µL rna RT 底漆 (RTP)。在70摄氏度下孵育2分钟, 然后立即将管子放在冰上。
- 添加5.5 µL 以下混合物: 2 µL 5x 第一链缓冲液, 0.5 µL 12.5 mm dNTP 混合, 1 µL 100 mM DTT, 1 µL 的核糖核酸酶抑制剂, 1 µL 逆转录酶。将管子在预热的热循环仪中孵育50摄氏度, 1 小时, 然后将管子放在冰上 (样品可以保持在-20 摄氏度)。
- 使用11-15 个周期进行 PCR 扩增, 丰富 5 ', 3 '-底漆结扎产品。
- 对每个反转转录反应, 添加35.5 µL 以下混合物: 8.5 µL 超纯水, 25 µL pcr 混合 (PML) 和2µL RNA pcr 底漆 (RP1)。对每个反应, 添加2µL 唯一索引 RNA PCR 底漆 (RPIX, X = 1 到 24)。
- 使用以下 PCR 循环条件在热循环仪中放大管: 三十年代98摄氏度;十年代12-15 次周期为98摄氏度;三十年代60摄氏度;三十年代72摄氏度;72摄氏度10分钟;然后保持在4摄氏度。
6. PCR 产品清理和尺寸选择
- 预热 AmpureXP 磁珠在室温下。涡旋珠子, 直到它们分散均匀, 然后添加50µL 到50µL pcr 反应 (1:1 pcr 产物: 珠子)。将内容混合多达十次以彻底混合。
- 在室温下孵育15分钟, 放置在磁性支架上至少5分钟, 直到液体显示清楚为止。移除并丢弃95µL 的上清液。
- 添加200µL 新鲜准备的80% 乙醇。孵育至少三十年代, 然后移除并丢弃上清液而不干扰珠子。再重复一次。
- 空气干燥的珠子15分钟或直到完全干燥。用32.5 µL 的再悬浮缓冲液重悬。将整个音量上下移十次以彻底混合。
- 在室温下孵育2分钟, 放置在磁性支架上5分钟, 直到液体出现清晰。将上清液的30µL 转移到新管中。添加20µL 无核酸酶的水, 以获得50µL 总体积。
- 使用固相可逆固定 (SPRI) 磁珠进行 PCR 产品的尺寸选择。
- 将 SPRI 珠的0.7x 体积 (35 µL) 添加到步骤6.5 中准备好的管子中, 并通过移液彻底混合。室温下孵育5分钟。
- 将管子放在磁性支架上, 等待5分钟或直到珠子分开。小心移除上清液而不干扰珠子。
- 添加200µL 新鲜准备的85% 乙醇。等待三十年代, 然后删除乙醇。空气干燥珠10分钟。
- 添加20µL 无核酸酶的水。将管子放回磁铁上, 等待5分钟, 并在不干扰或接触珠子的情况下移出液体部分。将 DNA 储存在-20 摄氏度。
7. 图书馆数量和质量的确定
- 用 260 nm 波长的分光光度计检查 DNA 浓度 (预期浓度至少为5–10µL)。
- 使用高灵敏度 DNA 芯片对 bioanalyzer 上的每个样本运行1µL, 以检查尺寸分布 (预期峰值在 300–400 bp (见图 3))。
8. 提交样品
- 结合非重叠测序 PCR 条码 (1:1 比率)。例如, 根据 RNA 测序核心的总输入样本量需求建议, 将样品与 RPI-1 和 RPI-2、RPI-3 和 RPI-4 的 PCR 产物结合在一起, 分别在相等的纳克量中。
- 结合后, 将总浓度调整到 5 ng/µL, 至少10µL 体积或按测序设施核心的建议。
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Representative Results
使用上面描述的协议, gaba 能神经元被手动排序 (图 1) 和 RNA 被放大, 然后被制成 cDNA 文库 (图 2) 和排序在高深度8。放大的 RNA (aRNA) 产品介于 200–4,000 bp 的大小之间, 峰值分布略高于 500 bp (图 3A)。珠纯化 cDNA 文库进一步大小-限制由第二轮纯化使用珠子, 消除小碎片小于 200 bp (图 3B和3C) 和峰值在 ~ 350 bp。较短的片段将导致空读 (没有 mRNA 插入, 只有适配器和引物序列), 而较长的片段将占用更多的空间在流细胞, 减少总读取输出。在测序时, 我们通常会获得 4.8 x 105中位数, 或者每个像元的 6.9 x 105平均映射读数 (图 4A)。使用医药学重复 RNA 去除后, 每个单细胞有 1.0 x 105中位数, 或 1.4 x 105每个像元的平均唯一读数 (图 4B)。在每个单细胞外部 rna 控制联合体 (ERCC) 中, 使用尖峰 rna 作为内部控制, 可以计算添加到样本中的分子的绝对数量。输入与观测计数之间存在线性关系, 斜率为 0.92, 调整 R2 = 0.94 (图 4C)。我们检测到平均每神经元1万个基因 (范围从 ~ 7500 到1.2万基因/细胞), 与 > 95% 的单细胞检测 > 6000 基因 (图 4D-4F)。这个数字比较有利的从类似的小鼠脑衍生的单个神经元 (例如, 1,865-4, 760 基因在嬉戏等的公布的数据。9, 7250 Tasic等基因。Okaty 等10和8000基因. 11). 读者被定向到 Poulin等。12进行详细比较。
图 1: 人工排序神经元的工作流, 后跟天后序列.新鲜的老鼠大脑被收集和切片, 感兴趣的区域是显微切割。通过体外转录两轮线性扩增, 手动收集表达荧光蛋白的单神经元。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 带两轮放大的天后序列的示意图工作流程, 同时包含独特的分子标识符 (医药学) 或品种标签.样条代码 (SBC) 允许通过其9核苷酸代码 (青色) 识别每个单细胞。海海是随机核苷酸的延伸 10 bp 的长度, 是不同的每个底漆使用。在生物信息学步骤中, 两个具有相同海序序列的贴图转录记录只会被计数一次, 从而消除放大重复, 并允许绝对转录计数。RA5 和 RA3 是测序引物, 需要 T7-RA5 底漆将 T7 序列添加回第一轮 aRNA 产品, 以便 T7 RNA 聚合酶可以通过体外转录重新绑定和执行第二轮线性扩增。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 示例 bioanalyzer 图解.(A) aRNA 尺寸分布应介于200-4、000 bp 之间, 峰值在 500 bp 左右. X 轴具有任意荧光单元 [傅]。(B) 微珠清理后 cDNA 文库产品的大小分布。(C) 0.7x SPRI 尺寸选择后的尺寸分布 (步骤 6.6), 峰值约为 350 bp。
图 4: 从人工排序的神经元后序列读取分布和基因检测的示例天后-Seq8 .(A) 映射的总读取分布。(B) 总的唯一读取分布。(C) ERCC 读数显示线性关系超过4个数量级。(D) 检测到的基因与读取计数表明 > 95% 单细胞有 > 6000 基因/细胞。(E) 在6中间类型之间检测到的基因是可比较的。(F) 每细胞检测到的基因分布情况, 地理加入 #GSE92522。这个数字已经适应了保罗等。8.请点击这里查看这个数字的更大版本.
| 缓冲区 | 项目 | 浓度 | 金额 (µL) |
| 样本收集缓冲区 | 重组核糖核酸酶抑制剂 | 55 | |
| ERCC | 1:50K 稀释 | 110 | |
| 核酸酶游离水 | 605 | ||
| 等分43.75 µL 16 管 (2 条 8; 200 µL PCR 管);每管添加以下内容 | |||
| T7-UMI-primers (例如 N10B1-N10B16) | 1 ng/µL | 6.25 µL/管 | |
| 每个管中的最终体积50µL (每个管可在25µL 等份中拆分, 在-80 摄氏度处冻结) | |||
| 解决 方案： | 项目 | 浓度 | 量 |
| 学联: 使 5 L 溶解 | Nacl | 126毫米 | 36.8 克 |
| 氯化钾 | 3毫米 | 1.15 克 | |
| NaH2PO4 | 1.25 毫米 | 0.75 克 | |
| NaHCO3 | 20毫米 | 8.4 克 | |
| 500毫升的学联, 气泡氧10-15 分钟, 然后添加以下新鲜每次: | |||
| d-葡萄糖 | 20毫米 | 1.8 克 | |
| MgSO4 | 2毫米 | 0.5 毫升从 4 M 库存 | |
| CaCl2 | 2毫米 | 0.5 毫升从 4 M 库存 | |
| 保持学联氧化 | |||
| 解决 方案： | 项目 | 浓度 | |
| 活动拦截器鸡尾酒: 制作100x 股票 | |||
| 100毫升学联添加 | |||
| APV | 0.05 毫米 | ||
| CNQX | 0.02 毫米 | ||
| TTX | 0.0001 毫米 (0.1 µM) | ||
| 解决 方案： | 项目 | 量 | |
| 蛋白酶孤子 (100 毫升) | 灰色链霉菌的蛋白酶 | 100毫克 | |
| 胎儿牛血清: 商业来源, 等分在500µL 为每使用。 | |||
表 1: 解决方案和缓冲区列表。
表 2: 引物和序列的列表.N10B1-N10B96 是第一束引物, T7-RA5 是第二轮底漆。请点击这里下载此表格.
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Discussion
手动排序协议适用于神经元种群的受监督 RNA 序列, 它们要么是稀疏标记在小鼠大脑中, 要么代表一个罕见的细胞种群, 否则使用当前高通量细胞进行研究是不可行的。排序和放大方法。根据喷嘴尺寸和所需的事件速率, 在 9–14 psi 范围内, 受流管的细胞通常会承受鞘和采样线压力。此外, 当从喷嘴中弹出时, 细胞可以在收集管表面坚硬, 或涂有样品缓冲液的油井, 造成冲击应力。在手动分拣过程中, 这种高压永远不会被应用, 因为细胞通过毛细管作用吸入移液器, 并通过轻轻地吹出来, 并简单地打破玻璃移液器的尖端排出。在小蜂窝体积 (< 8 µL) 和低起始材料的细胞中进行 RNA 扩增, 并持续产生大量可检测的基因 (8–10 K), 这是非常有用的, 当与深度测序结合时, 可以详细重建细胞功能的相干分子图象8,13,14。由于细胞采集步骤的纯度、基因检测灵敏度高, 以及执行绝对分子计数的能力, 这种方法对于研究高精度的细胞状态和疾病病理生理学是非常有用的。
在本协议中, 扩增 RNA 的产量和基因检测的程度相对较高, 但某些程序性措施有助于保持一致性。在第二束合成过程中, 必须在冰上进行组装, 热循环仪必须在转移到装置前进行预冷却, 反应必须严格地在16摄氏度 (或略低于以下) 进行, 以避免产生可能会降低 aRNA 屈服的发夹。也建议在第二链合成过程中, 在16摄氏度时不要超过2小时, 并且尽快移到 cDNA 纯化步骤是很重要的。在 ivt 步骤中, 孵育少于12小时可能会降低 aRNA 产量, 而超过14小时的 ivt 时间可能会导致某些 aRNA 降解。
我们并没有进行比较研究与相同的输入样本从废物处理和手工排序使用天后-Seq;因此, 我们不主张任何特定基因类别在 misregulated, 而不是手动排序。流控和手动排序都可能会引入某种程度的基因表达伪像。对于微分基因表达的情况, 任何这样的效果应该在理论上取消彼此, 因为它将表现在控制和样本组。最近, 一种转录抑制剂的鸡尾酒被用来防止立即早期基因表达的激活, 这些步骤也可以纳入本议定书15。
手动分拣过程是温和和快速 (通常 90–160 min) 相比流式处理 (不包括样品制备时间), 需要密度梯度离心, 染色与活性, cytotracker 染料和后整理可视化。在对井进行分拣时, 手动分拣不会使细胞受到高护套压力和冲击应力的影响。它还允许近乎恒定地获得含氧学联, 并且整体提供了一个好客和压力较小的分拣环境, 这对于对压力敏感的细胞 (如具有高代谢需求的快速尖峰细胞) 来说可能至关重要。目前, 在天后序列中, 多达96细胞可以多路复用, 以节省试剂成本, 并提供绝对 mRNA 计数, 每个细胞有较高的基因计数。
然而, 这种方法有缺点;例如, 手动排序需要可靠的荧光标记的单元格作为起始填充。它本质上是一个低吞吐量的过程, 每个排序会话产生最大的32–64细胞, 这是远远低于在流式处理。手动分拣还需要精细的运动技能和一些实践, 操作玻璃移液器在解剖显微镜下和捕获单个细胞在 microcapillary 移液器。天后序列放大是 3 '-偏置;因此, 它不能用于整个转录组扩增, 也不适合拼接异构体检测。
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Disclosures
作者声明, 没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了 NIH (5R01MH094705-04 和 R01MH109665-01 至 Z.J.H.)、CSHL 罗伯逊神经科学基金 (Z.J.H.) 和 NARSAD 博士后奖学金 (美联社) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
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